基于HPLC-MS/MS法的咽炎片中麥冬摻偽檢查

馬昌豪 ，李洪芹，李懷偉

（1.山東省食品藥品審評查驗中心，山東 濟(jì)南 250014 ；2.菏澤學(xué)院，山東 菏澤 274000；3.菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 菏澤 274000）

咽炎片由玄參、百部（制）、天冬、牡丹皮、麥冬、款冬花（制）、木蝴蝶、地黃、板藍(lán)根、青果、蟬蛻、薄荷油等十二味藥材組成，具有養(yǎng)陰潤肺，清熱解毒，清利咽喉，鎮(zhèn)咳止癢等作用，用于治療慢性咽炎引起的咽干，咽癢，刺激性咳嗽，是治療咽炎的常用藥。麥冬為百合科植物麥冬Ophiopogon japonicus（L.f） Ker-Gawl.的干燥塊根，主產(chǎn)于四川、浙江。山麥冬為百合科植物湖北麥冬Liriope spicata（Thunb.）Lour.var.prolifera Y.T.Ma或短葶山麥冬Liriope muscari（Decne.）Baily的干燥塊根，根據(jù)產(chǎn)地不同習(xí)稱湖北麥冬和福建麥冬[1]。麥冬具有養(yǎng)陰生津，潤肺清心的功效，麥冬和山麥冬均收載于《中國藥典》2020年版，兩者功能主治相同，性狀相近，易混用，日常抽檢中發(fā)現(xiàn)有以山麥冬代替麥冬銷售的情況。中醫(yī)傳統(tǒng)用藥習(xí)慣中并不使用山麥冬，湖北麥冬僅作為地方用藥[2-3]，同時研究[4]表明麥冬質(zhì)量優(yōu)于山麥冬，說明麥冬和山麥冬不能混用。

咽炎片制劑中存在麥冬摻偽投料的風(fēng)險，應(yīng)建立相關(guān)檢驗方法對山麥冬替代麥冬投料的情況進(jìn)行檢查。參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-7]本實驗采用高效液相色譜-串聯(lián)電噴霧三重四級桿質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS），分別以麥冬中的麥冬皂苷D、湖北麥冬中的山麥冬皂苷B、短葶山麥冬中的短葶山麥冬皂苷C為指標(biāo)性成分，建立咽炎片中麥冬投料的檢測方法，以判斷咽炎片制劑中是否存在以山麥冬替代麥冬投料的情況。

1 儀器與試藥

XS-105電子天平（梅特勒公司）、超聲波清洗器（杭州超聲波有限公司）、QTRAP6500高效液相色譜-串聯(lián)電噴霧三重四級桿質(zhì)譜（AB SCIEX公司）。

麥冬皂苷D（PS180725-04、Stanford Chemicals），麥冬對照藥材（121013-201711）、湖北麥冬對照藥材（121136-201803）、山麥冬皂苷B（111907-201103）和短葶山麥冬皂苷C（111908-201102）均來自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純（Merk化工）；水為超純水。

麥冬、湖北麥冬、短葶山麥冬分別購于安徽亳州中藥材市場、菏澤鄄城舜王城藥材市場，經(jīng)菏澤市食品藥品檢驗檢測研究院馬海春副主任中藥師檢定均為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Innoval ODS-2（2.1 mm×100 mm，3 μm）色譜柱；流動相：乙腈-0.1 %甲酸：（75:25）；流速0.3 ml/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μl。

2.2 質(zhì)譜條件

掃描模式為質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），具體參數(shù)見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測條件

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液 取麥冬皂苷D、山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C對照品適量，分別加甲醇制成濃度為500，250，500 ng/ml對照品溶液。

2.3.2 藥材溶液 取麥冬對照藥材、湖北麥冬對照藥材、短葶山麥冬藥材適量，粉碎，分別稱取0.5 g，加甲醇30 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水25 ml使溶解，用水飽和的正丁醇提取2次，每次20 ml，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇5 ml使溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 供試品溶液 取咽炎片6片，去除糖衣，研細(xì)，加甲醇30 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水25 ml使溶解，用水飽和的正丁醇提取3次，每次25 ml，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇5 ml使溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)樣品及陰性樣品溶液 按照咽炎片處方配料比，制備標(biāo)準(zhǔn)樣品及缺少麥冬的陰性對照，按照2.3.3項供試品溶液制備方法制成標(biāo)樣溶液及陰性對照溶液。

2.4 對照品質(zhì)譜確認(rèn)結(jié)果

取3種對照品溶液，參照2.1項和2.2項下條件，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。色譜圖見圖1～圖3。

圖1 麥冬皂苷D MRM總離子流圖

圖2 短葶山麥冬皂苷C MRM總離子流圖

圖3 山麥冬皂苷B MRM總離子流圖

2.5 專屬性試驗

將2.3.2項和2.3.4項下藥材溶液、標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液、陰性樣品溶液在2.1項和2.2項條件下進(jìn)樣，結(jié)果見圖4～圖8。

圖4 麥冬對照藥材MRM總離子流圖

圖5 湖北麥冬對照藥材MRM總離子流圖

圖6 短葶山麥冬藥材MRM總離子流圖

圖7 標(biāo)樣溶液MRM總離子流圖

圖8 陰性樣品溶液MRM總離子流圖

由圖可見，麥冬、湖北麥冬對照藥材及短葶山麥冬藥材分別只檢出與麥冬皂苷D、山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C對照品保留時間一致的離子峰，母離子及子離子峰均與對照品一致。標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液僅檢出與麥冬皂苷D對照品保留時間一致的離子峰，陰性樣品溶液未檢出與各對照品相應(yīng)的離子峰。由此判定，制劑中其他組分及輔料對目標(biāo)成分無干擾，該方法可準(zhǔn)確判定咽炎片是否存在麥冬摻偽投料。

2.6 檢測限

分別取麥冬皂苷D、山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C對照品溶液逐級稀釋，以3倍信噪比為檢測限，測定3種對照品，結(jié)果見表2。

表2 對照品檢測限

2.7 結(jié)果測定

依照上述色譜及質(zhì)譜條件，測定31批次樣品，結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果

由表3可見，有23批次樣品僅檢出麥冬皂苷D，未發(fā)現(xiàn)替代投料；有7批次樣品檢出短葶山麥冬皂苷C，表明混有短葶山麥冬投料；有1批次樣品檢出山麥冬皂苷B，表明混有湖北麥冬投料；有1批次樣品檢出山麥冬皂苷B和短葶山麥冬皂苷C，表明同時混有湖北麥冬和短葶山麥冬投料。

3 討論

3.1 檢測方法優(yōu)化

前期研究中采用薄層色譜和液相色譜法檢查，干擾較多，靈敏度難以滿足要求。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)具有靈敏度高，專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)，在中藥研究中廣泛應(yīng)用[8-12]。根據(jù)3種指標(biāo)性成分化學(xué)結(jié)構(gòu)，選用不同的采集模式，其中山麥冬皂苷B在正離子模式下的母離子信號響應(yīng)較強(qiáng)，短葶山麥冬皂苷C和麥冬皂苷D在負(fù)離子模式下的母離子信號響應(yīng)較強(qiáng)。為提高檢驗靈敏度，分別采用正負(fù)離子模式對3種指標(biāo)性成分進(jìn)行監(jiān)測。

3.2 結(jié)果分析

現(xiàn)行藥典收錄的麥冬和山麥冬來源不同，在常規(guī)的性狀鑒別上常難以區(qū)分。在前期調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，部分農(nóng)戶種植的麥冬種質(zhì)資源存在問題，采收后經(jīng)鑒別為山麥冬，相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)的藥材驗收人員對麥冬的鑒別要點(diǎn)認(rèn)識不足，導(dǎo)致制劑企業(yè)可能存在混用的風(fēng)險。本試驗建立的液質(zhì)聯(lián)用的檢查方法能夠準(zhǔn)確鑒別麥冬、湖北麥冬和短葶山麥冬，可為咽炎片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供參考。該制劑中麥冬為提取后投料，后續(xù)的研究中將對麥冬原粉投料的制劑進(jìn)行研究，為含麥冬類制劑的通用檢查方法的建立提供依據(jù)。