新型鵝細(xì)小病毒感染鴨的肝、胸腺、回腸轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)分析

王璐瑤，郝雪飄，雷白時(shí),2，趙 款,2，張武超,2，袁萬哲,2*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，保定 071001；2. 河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心, 保定 071001)

2014年下半年以來，在我國櫻桃谷鴨群中報(bào)道了一種宿主范圍改變的鵝細(xì)小病毒(goose parvovirus，GPV)變異毒株，被命名為NGPV[1-2]。其臨床癥狀主要為雛鴨個(gè)頭矮小、發(fā)育遲緩、喙萎縮、舌頭外伸、跛行癱瘓、腹瀉、脛骨變短、易骨折，被稱為鴨短喙與侏儒綜合征(short beak and dwarfism syndrome，SBDS)[3]。主要感染小日齡雛鴨群，發(fā)病率隨年齡增長而降低[4]，患病鴨淘汰率高，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，對(duì)于NGPV的研究更多集中于病原分離與鑒定、病毒的基因序列分析及PCR方法建立等方面，關(guān)于該病毒與宿主細(xì)胞相互作用的分子致病機(jī)制尚不清楚?；诖?，本研究通過建立NGPV感染雛鴨的動(dòng)物模型，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，分析感染后雛鴨肝、胸腺、回腸的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜差異,尋找參與感染發(fā)生的相關(guān)基因及其信號(hào)通路，為探究NGPV致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒及動(dòng)物

新型鵝細(xì)小病毒SD株(EID50：10-4.3·0.2 mL-1；GenBank登錄號(hào)：KY511124)，3日齡櫻桃谷鴨。

1.2 儀器/耗材

Nanodrop 紫外定量設(shè)備購自Thermo Scientific；2100生物分析儀、RNA 6000 nano kit均購自Agilent公司；電泳儀購自北京六一公司；凝膠成像系統(tǒng)購自北京百晶公司； Agarose購自Invitrogen公司；Marker購自TaKaRa公司；

1.3 樣本的采集

將6只雛鴨隨機(jī)分為對(duì)照組和感染組。對(duì)照組肌肉注射生理鹽水0.2 mL·只-1，感染組肌內(nèi)注射NGPV SD株0.2 mL·只-1。在處理后14 d,采集兩組雛鴨肝、胸腺和回腸，-80 ℃保存。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

提取雛鴨肝、胸腺和回腸的總RNA， RNA質(zhì)量檢測(cè)，純化mRNA，將mRNA片段化并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，文庫構(gòu)建，Illumina平臺(tái)上機(jī)測(cè)序(由上海派森諾公司完成)。

2 結(jié) 果

2.1 表達(dá)差異分析

結(jié)果顯示(圖1)：感染組回腸中上調(diào)基因有78個(gè)，下調(diào)基因有31個(gè)；感染組胸腺中上調(diào)基因有111個(gè)，下調(diào)基因有78個(gè)；感染組肝中上調(diào)基因有128個(gè)，下調(diào)基因有313個(gè)。

圖1 差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.1 Statistical graph of the results of differentially expressed genes

2.2 GO富集分析

GO富集分析涵蓋3個(gè)方面，分別描述基因的分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞的組分(cellular component，CC)、參與的生物學(xué)過程(biological process，BF)。

回腸差異基因在免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)、核苷結(jié)合、抗原結(jié)合、細(xì)胞因子活性、碳水化合物衍生物等BF和MF中顯著富集(P<0.05)。

胸腺差異基因在免疫效應(yīng)過程、淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、補(bǔ)體激活、白細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答的激活、細(xì)胞黏附等BF顯著富集(P<0.05)。

肝差異基因在異源生物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、生物黏附、細(xì)胞表面受體信號(hào)通路、己糖激酶活性、葡萄糖結(jié)合、神經(jīng)酰胺代謝過程等BF和MF中顯著富集(P<0.05)。

2.3 KEGG富集分析

回腸中差異基因在Toll樣受體信號(hào)通路、ECM-受體相互作用、JAK-STAT信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、Th1和Th2細(xì)胞分化、炎癥介質(zhì)對(duì)色氨酸通道的調(diào)節(jié)等過程顯著富集(P<0.05)。

胸腺中差異基因在NF-κB信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、FcεRI信號(hào)通路、FcγR介導(dǎo)的吞噬作用、PI3K-Akt信號(hào)通路、抗原處理和提呈、Apelin信號(hào)通路等過程有顯著富集(P<0.05)。

肝差異基因在Rap1信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、淀粉和蔗糖代謝、抗原處理和提呈等過程顯著富集(P<0.05)。

3 討 論

本研究中，建立了NGPV感染雛鴨動(dòng)物模型，通過PCR檢測(cè)感染組組織均為陽性，對(duì)照組組織均為陰性。

NGPV具有組織泛嗜性，有人推測(cè)禽類細(xì)小病毒感染后最早在腸壁發(fā)生復(fù)制，再通過血液達(dá)到次級(jí)靶器官[5]。但對(duì)于NGPV感染后病毒載量分布情況目前沒有統(tǒng)一的研究結(jié)論，研究顯示，NGPV感染后在腸道、肝、胸腺的病毒載量相對(duì)較高[6-8]。所以，本研究對(duì)感染NGPV雛鴨的胸腺、回腸和肝進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，探究NGPV的感染對(duì)雛鴨組織的基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。

NGPV感染后，回腸差異表達(dá)基因參與多個(gè)免疫相關(guān)生物學(xué)過程；差異表達(dá)基因涉及Toll樣受體信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、Th1和Th2細(xì)胞分化。其中，Toll樣受體信號(hào)通路和JAK-STAT信號(hào)通路都是重要的抗病毒信號(hào)通路，Toll樣受體信號(hào)通路可通過多種途徑激活多種免疫細(xì)胞，啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答[9]；NGPV感染可以激活TLR3受體觸發(fā)有效的抗病毒天然免疫應(yīng)答[10]。差異表達(dá)基因OASL上調(diào)7.82倍， OASL表達(dá)可通過JAK-STAT信號(hào)通路途徑發(fā)揮抗病毒活性[11]，在抗病毒過程起重要作用。

NGPV感染后，胸腺差異表達(dá)基因也參與多個(gè)免疫相關(guān)生物學(xué)過程，差異表達(dá)基因涉及NF-κB信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、FcεRI信號(hào)通路等多個(gè)通路。其中，上調(diào)基因CCL19參與NF-κB信號(hào)通路、細(xì)胞因子相互作用、趨化因子信號(hào)通路等，在炎癥形成過程中起重要作用[12]。

肝感染NGPV后差異表達(dá)基因在MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集。研究表明，PI3K-Akt、HIF-1信號(hào)通路與某些病毒復(fù)制有關(guān)[13-15]。差異上調(diào)基因中EPSPI1、OASL、IFITM2均在抗病毒免疫中起重要作用[11, 16]。

4 結(jié) 論

NGPV感染雛鴨后，肝、胸腺、回腸差異表達(dá)基因參與多個(gè)免疫相關(guān)生物學(xué)過程，并在PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路等多個(gè)經(jīng)典信號(hào)通路富集，提示NGPV感染宿主后激活了宿主免疫反應(yīng)及相關(guān)抗病毒信號(hào)通路，從而對(duì)抗病毒感染。