綿羊癢螨兔亞種MMP2基因的轉(zhuǎn)錄水平及其重組蛋白間接ELISA的建立

葛 優(yōu)，鄭 晶，蒲善秋，周 宇，黃翠銳，楊光友，謝 躍，何 冉，徐 璟，古小彬*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，成都 611130； 2. 中華人民共和國成都海關(guān)技術(shù)中心, 成都 610041)

兔癢螨病是綿羊癢螨兔亞種(Psoroptesovisvar.cuniculi)在兔外耳道皮膚表面寄生所引起的一種慢性、接觸傳染性皮膚病[1]。該病以外耳道出現(xiàn)卷紙樣痂皮、劇癢、皮膚增厚和消瘦等為臨床特征，導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率下降，若不及時治療可引起死亡，給兔養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)危害[1-3]。及時準(zhǔn)確地診斷出患病兔是兔癢螨病有效防控的基礎(chǔ)，現(xiàn)生產(chǎn)中通過耳部結(jié)痂等臨床癥狀及痂皮鏡檢出蟲體或蟲卵來對兔癢螨病進(jìn)行診斷，但這種方法對亞臨床感染病兔易漏檢，造成該方法敏感性低[4]。兔經(jīng)人工感染P.ovisvar.cuniculi后，兔血清抗體陽性的出現(xiàn)時間早于結(jié)痂臨床癥狀出現(xiàn)時間，因此，可通過檢測血清抗體篩出亞臨床病例[5]。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是對血清抗體檢測的方法之一，可同時對大量樣本進(jìn)行檢測篩選，具有高敏感性、高特異性優(yōu)點(diǎn)[6]。建立一種針對血清抗體檢測的高度靈敏和特異的血清學(xué)檢測方法需要篩選特異性強(qiáng)、敏感性高的抗原蛋白。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一種鋅離子依賴的內(nèi)源性蛋白酶家族，廣泛參與胚胎發(fā)育、血管生成、組織穩(wěn)態(tài)、傷口修復(fù)、炎癥反應(yīng)等多項(xiàng)重要生物學(xué)功能，在寄生蟲感染中還可參與寄生蟲入侵和免疫逃避等過程[7-9]。寄生蟲來源的MMPs蛋白則可以作為診斷抗原，用于寄生蟲疾病的診斷[10]。本課題組前期的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，P.ovis中存在MMP2基因，但目前尚未見該基因的相關(guān)研究。因此，本研究擬分析綿羊癢螨兔亞種MMP2的蟲體轉(zhuǎn)錄水平，并經(jīng)原核表達(dá)獲得重組MMP2蛋白，基于該重組蛋白建立測定P.ovisvar.cuniculi抗體的間接ELISA方法，并將該方法用于臨床血清樣品的檢測。

1 材料與方法

1.1 螨蟲的收集

從四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物寄生蟲病研究中心保種的癢螨病新西蘭兔的耳部痂皮中分離蟲體，待蟲體爬出后鏡檢鑒定為P.ovisvar.cuniculi，收集混合各發(fā)育階段的螨蟲1份，以及雄蟲、雌蟲、幼蟲和若蟲蟲體各1份[11]?；旌细麟A段的飽食和饑餓的螨蟲各1份，具體收集方法參考文獻(xiàn)[12]。

1.2 血清

建立方法所用血清：50份癢螨陽性血清采自經(jīng)病原學(xué)檢測呈陽性的兔群；54份癢螨陰性血清采自無癢螨病史的兔場，且無任何臨床病癥的兔群。

交叉反應(yīng)血清：15份柔嫩艾美耳球蟲陽性血清采自經(jīng)漂浮法檢測呈陽性的兔群；11份疥螨陽性血清采自經(jīng)病原學(xué)檢測為陽性的兔群。

田間血清：田間檢測血清共86份，于2020年3月，從成都金堂某兔場采集，該養(yǎng)殖場具有癢螨病流行病史，采集血清的兔經(jīng)癢螨病的病原學(xué)檢測有9只為陽性，77只為陰性。

1.3 主要試劑

微量RNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司； Real Time PCR EasyTM-SYBR Green I試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自成都福際生物技術(shù)有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自Sigma公司；蛋白質(zhì)預(yù)染Marker(20～250 ku)購自Bio-Rad公司；HRP(辣根過氧化物酶)標(biāo)記的羊抗兔IgG購自Abclonal公司。

1.4 MMP2序列分析

從P.ovisvar.cuniculi三代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(未發(fā)表)中篩選出MMP2完整基因序列，利用在線分析預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測其編碼蛋白的信號肽(https://services.healthtech.dtu.dk/Services.PhP?SignalP)及跨膜結(jié)構(gòu)[TMHMM Server, v. 2.0 (dtu.dk)]；根據(jù)NCBI 在線Blast工具查詢到螨類MMP2同源基因，利用軟件DNAMAN和Jalview比較他們的氨基酸序列相似性；用InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)。

1.5 蟲體MMP2相對轉(zhuǎn)錄水平的測定

取出“1.1”中收集的雌蟲、雄蟲、若蟲、幼蟲以及飽食和饑餓的蟲體，經(jīng)試劑盒提取總RNA和合成cDNA第一鏈。qPCR擴(kuò)增MMP2的引物：5′-ATCTCCCACAAACGGGCGAAATC-3′(F1)，5′-TTCGACATCAGGCACACCACAA-3′(R1)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。根據(jù)qPCR染料說明書設(shè)置反應(yīng)體系和應(yīng)用程序，結(jié)果以2-△△ct計(jì)算蟲體的MMP2相對轉(zhuǎn)錄水平。

1.6 MMP2基因擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)及合成

參照P.ovisvar.cuniculi三代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中MMP2序列，設(shè)計(jì)和合成引物，引物序列：5′-CAGGATCCCCAATGATGATTTTGGTTGATTATA- ATTCAG-3′(F2,下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn))，5′-TCGAAGCTTTTATCCAGCTTTCGCCGAT-3′(R2,下劃線為Hind Ⅲ 酶切位點(diǎn))，由上海生工生物工程有限公司合成引物。

1.7 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-MMP2 的構(gòu)建

用微量RNA提取試劑盒提取“1.1”中收集的混合發(fā)育階段的螨蟲總RNA， 合成cDNA。以cDNA 為模板，使用引物F2 和 R2進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min； 94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s, 35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將產(chǎn)物切膠回收并純化，插入pMD-19T(Simple)，提取質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切后，插入pET-32a(+)后轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR和雙酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測序，將測序正確的重組表達(dá)載體命名為pET-32a(+)-MMP2。

1.8 重組MMP2蛋白的表達(dá)、純化與免疫印跡(Western blot)

將pET-32a (+)和pET-32a (+)-MMP2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，將菌液涂布于含AMP抗性的LB平板于37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落于含AMP抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌液OD600 nm值達(dá)到0.6～0.8時，加入100 μmol·L-1IPTG 18 ℃ 180 r·min-124 h，收集菌液，4 ℃ 7 000 r·min-110 min，沉淀用30 mL Tris-HCl(pH6.8)重懸，于冰浴中超聲破碎，4 ℃ 10 000 r·min-110 min，收集上清，超聲破碎后的沉淀物分別用2、4、8 mol·L-1尿素溶液溶解，4 ℃ 10 000 r·min-110 min收集上清。將每一步收集的上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測，判斷蛋白是否呈可溶性表達(dá)。將上述處理的蛋白經(jīng)鎳柱(Bio-ScaleTMMini NuviaTMIMAC Cartridges)純化，將純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后轉(zhuǎn)印到醋酸纖維膜(PDVF膜)，經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入癢螨病兔陽性血清或健康兔陰性血清(1∶200稀釋)4 ℃過夜，以Goat Anti Rabbit IgG-HRP(1∶3 000)室溫孵育2 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.9 間接ELISA方法的建立

1.9.1 方陣滴定法確定包被抗原和血清的最佳工作濃度 將重組MMP2蛋白用包被液(pH 9.6，碳酸鹽緩沖液)按2×倍稀釋比從每孔74.88 μg·mL-1稀釋到1.17 μg·mL-1，將稀釋后蛋白以每孔100 μL加入96孔板，4 ℃包被過夜；PBST(pH7.4)洗滌3次， 每次5 min；加入150 μL 5%脫脂奶粉，37 ℃ 2 h； PBST洗滌3次，每次5 min；癢螨陽性血清和癢螨陰性血清用PBS緩沖液按1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320和1∶640稀釋，每孔100 μL，37 ℃ 1 h； PBST洗滌3次，每次5 min；每孔加入PBS稀釋的Goat Anti Rabbit IgG-HRP(1∶ 3 000)100 μL，37 ℃ 1 h；PBST洗滌4次，每次5 min；加入100 μL鄰苯二胺底物緩沖液，37 ℃ 15 min，加入2 mol·L-1濃硫酸100 μL終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定OD450 nm值。計(jì)算P/N值， P/N最大時對應(yīng)的值即為抗原最佳包被濃度和最佳血清稀釋度。

1.9.2 臨界值(cut-off值)、敏感性和特異性的計(jì)算 用上述已優(yōu)化的iELISA方法檢測50份癢螨兔陽性血清、54份癢螨兔陰性血清、15份柔嫩艾美耳球蟲兔陽性血清和11份疥螨兔陽性血清。將得到的數(shù)據(jù)計(jì)算臨界值、敏感性和特異性。約登指數(shù)越大，真陽性率(敏感性)和假陽性率(1-特異性)差異最大化，此時所對應(yīng)的臨界值具有最好的指示效果[13]。根據(jù)確定的臨界值判定血清樣本的陰陽性，最終計(jì)算特異性和敏感性[14]。特異性=真陰性數(shù)/(真陰性數(shù)+假陽性數(shù))×100%，敏感性=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))×100%。

1.9.3 受試者工作曲線(ROC曲線)分析 利用MedCalc軟件繪制ROC曲線[15]并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，從而評價所建iELISA方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

1.9.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份癢螨病兔陽性血清，分別用同一批次和3個不同批次包被的酶標(biāo)板在相同條件下進(jìn)行檢測，每個血清樣本做3個重復(fù)，根據(jù)讀數(shù)結(jié)果分別判定批內(nèi)和批間重復(fù)性。

1.10 與傳統(tǒng)病原學(xué)檢測的對比

使用上述建立的iELISA方法對“1.2”中的86份臨床兔血清樣本進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果與病原學(xué)檢測結(jié)果進(jìn)行對比。

2 結(jié) 果

2.1 PocMMP2的序列分析

PocMMP2基因序列開放閱讀框(ORF)長1 656 bp，編碼長551個氨基酸的多肽，無信號肽，有一個跨膜結(jié)構(gòu)域(氨基酸位數(shù)為7—29)。功能結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)PocMMP2含半胱氨酸開關(guān)基序PRCGVPDV的前肽區(qū)、含鋅的催化結(jié)構(gòu)域(ZnMc-MMP, 150—303)和血紅素樣結(jié)構(gòu)域(hemopexin-like dom, 349—540)(圖1)。PsoMMP2與其他3種螨蟲的同源基因氨基酸序列相似性為51.78%～63.65%(圖1)。

Dermatophagoides pteronyssinus (GenBank No.: XP_027203761.1), Euroglyphus maynei (GenBank No.: OTF75656.1), Sarcoptes scabiei (GenBank No.: KPM05303.1)。圖中方框圈出的序列代表MMP2保守的半胱氨酸開關(guān)基序；序列標(biāo)識在序列之間以黑色/灰色背景突出顯示，越保守，顏色越深Dermatophagoides pteronyssinus (GenBank No.: XP_027203761.1), Euroglyphus maynei (GenBank No.: OTF75656.1), Sarcoptes scabiei (GenBank No.: KPM05303.1). The sequence circled in the figure represents the conservative cysteine-switch motif of MMP2； sequence identity is highlighted with a black/grey background, between sequences, and the more conservative, the darker the color圖1 螨類MMP2同源基因多序列比Fig.1 Multiple sequence alignment of mite MMP2 homologous genes

2.2 蟲體MMP2相對轉(zhuǎn)錄水平測定

MMP2在螨蟲的4個發(fā)育階段均有表達(dá)，相對轉(zhuǎn)錄水平：雄蟲>幼蟲>雌蟲>若蟲，其中，若蟲的轉(zhuǎn)錄水平顯著低于其他3個發(fā)育階段(P<0.05或P<0.01，圖2A)。饑餓蟲體的相對轉(zhuǎn)錄水平顯著高于飽食蟲體(P<0.05，圖2B)。

A. 不同發(fā)育階段；B. 饑餓/飽食狀態(tài)。*. P<0.05;**. P<0.01A. Different developmental stages; B. The state of “fed” or “starved”. *. P<0.05;**. P<0.01圖2 蟲體MMP2相對轉(zhuǎn)錄水平Fig.2 The relative transcription level of MMP2 of Psoroptes ovis var. cuniculi

2.3 rPocMMP2的表達(dá)及純化

插入pET-32a (+)載體后的MMP2經(jīng)雙酶切，獲得約1 656 bp片段，重組質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定正確，說明成功構(gòu)建pET-32a(+)-MMP2重組質(zhì)粒(圖3)。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的重組菌獲得與預(yù)期大小一致的72 ku目的蛋白條帶，且目的蛋白主要以包涵體的形式存在，經(jīng)鎳柱純化獲得單一的目的蛋白條帶(圖4)。重組MMP2蛋白可與癢螨病兔陽性血清相識別，在約72 ku處出現(xiàn)特異性條帶，表明其具有較好的免疫反應(yīng)性；與陰性兔血清無反應(yīng)條帶(圖4)。

M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. pET-32a(+)-MPP2酶切片段M. DNA marker; 1. Digested fragments of pEF-32a(+)-MPP2圖3 pET-32a(+)-MMP2雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid pET-32a (+)-MMP2 digested with Hind Ⅲ and BamHⅠ

2.4 間接ELISA檢測方法的建立

2.4.1 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定 癢螨病兔陽性血清OD450 nm值/陰性血清OD450 nm值(P/N)最高時，其對應(yīng)的rMMP2最佳包被濃度為 2.34 μg·mL-1，血清最佳稀釋度為1∶40。

2.4.2 臨界值(cut-off值)、特異性、敏感性和曲線下面積(AUC)的確定 用“2.4.1” 得到的iELISA反應(yīng)條件檢測50份癢螨病兔陽性血清、54份兔陰性血清、11份疥螨病兔陽性血清和15份柔嫩艾美耳球蟲兔陽性血清獲得OD450 nm值(圖5)。利用MedCalc軟件繪制計(jì)算得到最大約登指數(shù)為0.693，此時對應(yīng)的臨界值(cut-off值)為0.223，計(jì)算出敏感性和特異性分別為86.0%和83.3%，AUC為0.876(95% CI：0.806～0.946)(圖6)。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 采用同一批和3個不同批次rPocMMP2包被的酶標(biāo)板，分別對6份癢螨兔陽性血清進(jìn)行檢測，得到的批內(nèi)、批間變異系數(shù)平均值分別為3.28%和2.51%，均小于10%。結(jié)果說明rPocMMP2-iELISA重復(fù)性較好。

2.4.4 臨床檢測 rPocMMP2-iELISA對有癢螨病流行病史的86份臨床兔血清樣本(圖7)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，9份病原學(xué)檢測呈陽性的兔血清樣本全部呈現(xiàn)血清學(xué)陽性，77份病原學(xué)檢測呈陰性的兔血清樣本中有55份呈血清學(xué)陽性。計(jì)算獲得病原學(xué)陽性率為10.47%(9/86)，血清陽性率為74.42%(64/86)?？梢妑PocMMP2-iELISA方法較傳統(tǒng)病原學(xué)方法能檢出更多的亞臨床感染病兔。

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. pET-32(a)空載蛋白；2. 誘導(dǎo)的rPocMMP2；3. rPocMMP2超聲裂解上清液；4～6. rPocMMP2超聲裂解沉淀分別用2、4、8 mol·L-1尿素處理；7. 純化的rPocMMP2；8. rPocMMP2+癢螨兔陽性血清；9. rPocMMP2+癢螨兔陰性血清M. Protein marker; 1. Proteins of E. coli expressing pET32a (+); 2. Recombinant proteins of Escherichia coli expressing pET32a (+)-MMP2 induced by the reagent IPTG; 3. The supernatant of sonicated rPocMMP2; 4-6. Inclusion body of rPocMMP2 dissolved in 2, 4, 8 mol·L-1urea, respectively; 7. Purified rPocMMP2; 8. Purified rPocMMP2 immunoblotted with P. ovis var. cuniculi-positive serum from rabbits with psoroptic mange; 9. Purified rPocMMP2 immunoblotted with P. ovis var. cuniculi-negative serum圖4 rPocMMP2蛋白表達(dá)、純化及免疫印跡Fig.4 Expression, purification and Western blot of recombinant MMP2 protein of Psoroptes ovis var. cuniculi

細(xì)水平線代表陽/陰性截?cái)嘀担碿ut-off=0.223The thin horizontal line represents the positive/negative cut-off value, cut-off=0.223圖5 rPocMMP2-iELISA檢測兔癢螨陰/陽性血清、交叉反應(yīng)血清結(jié)果Fig.5 The result of rPocMMP2-iELISA detecting rabbit negative/positive serum and cross-reactive serum

AUC代表曲線下面積AUC stands for area under the curve圖6 rPocMMP2-iELISA 的ROC曲線Fig.6 ROC curve of rPocMMP2-iELISA

3 討 論

本研究獲得的綿羊癢螨兔亞種MMP基因的催化區(qū)有3個Ⅱ型纖連蛋白重復(fù)序列，表明其具有明膠酶的典型結(jié)構(gòu)[16]，根據(jù)MMPs的分類標(biāo)準(zhǔn)[10]，筆者將其歸類為MMP2。PocMMP2轉(zhuǎn)錄水平分析發(fā)現(xiàn)，在P.ovisvar.cuniculi4個發(fā)育階段(雌蟲、雄蟲、若蟲和幼蟲)均有表達(dá)，推測MMP2在P.ovisvar.cuniculi發(fā)育生理過程中具有重要作用；與飽食螨蟲相比，饑餓螨蟲MMP2轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，推測MMP2可能有助于螨蟲找到寄主或取食地點(diǎn)或啟動取食行為[12]，亦可能與降解宿主皮膚膠原有助于螨蟲入侵宿主皮膚表皮層有關(guān)[17]。

目前，中國家兔飼養(yǎng)量占全球飼養(yǎng)總量的40%以上，而我國23個省/市/區(qū)兔群中癢螨病感染率達(dá)7.98%～15.7%[18]， 患病兔出現(xiàn)生產(chǎn)性能下降，飼料成本增加，嚴(yán)重者甚至導(dǎo)致死亡，給兔養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[19-20]。該病通過健康兔與患兔或被蟲體污染的物品及飼養(yǎng)人員的衣物等直接接觸而感染；兔經(jīng)實(shí)驗(yàn)室一次性人工感染50～100只螨蟲后，約4周才能出現(xiàn)明顯的結(jié)痂臨床癥狀，而在養(yǎng)殖過程中兔經(jīng)接觸途徑的自然感染需要更長的時間方可出現(xiàn)明顯結(jié)痂等臨床癥狀，因此，在感染早期兔往往呈現(xiàn)亞臨床感染[5,21-22]。而作為“金標(biāo)準(zhǔn)”的結(jié)痂中檢測到蟲體或蟲卵的病原學(xué)檢測方法無法將這部分亞臨床感染的癢螨病兔檢出，而成為重要的隱性傳染源。研究證實(shí)，ELISA方法已被用于多種寄生蟲病的血清學(xué)檢測[23-24]，因此，ELISA方法有望作為兔癢螨病的首選血清學(xué)診斷方法。目前，已報(bào)道有多種重組蛋白用于兔癢螨病的血清學(xué)診斷?；谥亟M肌鈣蛋白C建立的Dot-ELISA方法具有95.3%(81/85)的敏感性，但其易與疥螨陽性血清產(chǎn)生交叉反應(yīng)(10/12)[25]；重組精氨酸激酶的iELISA(rPocAK-iELISA)具有94.4%的敏感性和88.2%的特異性，且對兔癢螨病具有早期診斷作用[26]；陳宇航等[27]比較了兩種重組絲氨酸蛋白酶抑制劑(Psoc 27和PsoSP2)的iELISA方法，發(fā)現(xiàn)rPsoc 27-iELISA具有更好的診斷效應(yīng)，其敏感性和特異性分別為96.0%和90.91%。本研究建立的rPocMMP2-iELISA獲得了較好的敏感性(86.0%)和特異性(83.3%)，進(jìn)一步分析計(jì)算獲得AUC為0.876(0.8

細(xì)水平線代表陽/陰性截?cái)嘀担碿ut-off=0.223The thin horizontal line represents the positive/negative cut-off value, cut-off=0.223圖7 rPocMMP2-iELISA與傳統(tǒng)病原學(xué)方法的臨床檢測Fig.7 Clinical detection of rPocMMP2-iELISA and etiological detection

4 結(jié) 論

PocMMP2在P.ovisvar.cuniculi雌蟲、雄蟲、若蟲和幼蟲階段均有表達(dá)，且在饑餓蟲體的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于飽食蟲體；基于rPocMMP2建立的iELISA有良好的敏感性、特異性和較高的重復(fù)性，可用于兔癢螨病的血清抗體檢測。