弓形蟲卵囊感染小鼠的急性期與慢性期的腦組織蛋白質(zhì)組變化

付 明，賀君君，朱興全，叢 偉*

(1. 山東大學(xué)海洋學(xué)院，威海 264209； 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，蘭州 730046; 3. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院, 太谷 030801; 4. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南省高校獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，昆明 650201)

弓形蟲是一種呈全球性分布的細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，全世界約有三分之一的人口感染弓形蟲[1]，我國居民弓形蟲感染率約為8%，而一些歐美國家弓形蟲感染率更高[2-3]。弓形蟲可以感染幾乎所有溫血動物[4]，在宿主中速殖子是急性感染期間的標(biāo)志，一旦速殖子受到來自宿主免疫反應(yīng)的壓力，就會分化為緩殖子并在宿主多種組織中以包囊形式長期存在而不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀,表現(xiàn)為慢性感染[1]。弓形蟲感染對于免疫功能低下患者或受損個體可能具有致命性[5]，潛伏感染可能被重新激活，這種再激活通常表現(xiàn)為弓形蟲腦炎[6]。

貓科動物是弓形蟲唯一的終末宿主，感染弓形蟲的貓科動物通過一次糞便排泄可向環(huán)境中釋放大量卵囊，在適宜條件下可發(fā)育為感染性極強(qiáng)的孢子化卵囊，且在不利的環(huán)境中仍能保持較長時間的感染能力[7-8]。據(jù)調(diào)查，人急性弓形蟲病與環(huán)境弓形蟲卵囊污染密切相關(guān)，主要是由孢子化卵囊污染環(huán)境水源、土壤引起[9]。與弓形蟲包囊(緩殖子)和假包囊(速殖子)相比，卵囊污染已成為水源性和食源性弓形蟲感染的主要因素[10-11]。弓形蟲感染被認(rèn)為是對牲畜業(yè)造成經(jīng)濟(jì)影響的一個重要原因[12-13]，尤其是豬等雜食性動物，在中國,母豬弓形蟲感染造成的流產(chǎn)現(xiàn)象比較普遍，可能會導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失[14]。而生食或食用未煮熟的被感染動物的肉類被認(rèn)為是人感染弓形蟲的主要來源之一。

弓形蟲具有獨特的協(xié)調(diào)宿主基因表達(dá)與逃避宿主免疫防御機(jī)制的能力，以便更好地建立急性或慢性感染[15]，而蛋白質(zhì)組學(xué)對于揭示不同階段弓形蟲感染和對宿主細(xì)胞的機(jī)制研究具有重要意義[16]，iTRAQ技術(shù)結(jié)合2D-LC-MS/MS分析已廣泛用于病原體與宿主相互作用的組學(xué)研究。采用該項技術(shù)，Yang等[17]分析了弓形蟲包囊慢性感染對野生型和CD44小鼠腦組織蛋白的表達(dá)情況；Zhou等[18]進(jìn)行了弓形蟲卵囊孢子化過程的蛋白質(zhì)組學(xué)研究；Wang等[19]研究了弓形蟲不同發(fā)育階段的蛋白表達(dá)情況。這也表明蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可能是進(jìn)一步闡明弓形蟲持續(xù)存在的許多未知因素的最佳方法[20]。

弓形蟲感染的嚴(yán)重程度與環(huán)境因素、宿主遺傳學(xué)特點、弓形蟲蟲株、感染期間蟲體所處階段以及感染途徑等有關(guān)[20]。迄今為止，對于弓形蟲蟲體本身及弓形蟲包囊以及速殖子感染宿主相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究相對較多[17,21-22]，但缺少弓形蟲卵囊感染對宿主蛋白質(zhì)組影響的研究。因此本試驗利用iTRAQ技術(shù)對弓形蟲PRU株卵囊急、慢性感染對小鼠腦組織蛋白組的影響展開研究，并對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行功能分析。這些發(fā)現(xiàn)將有助于了解弓形蟲腦炎的發(fā)病機(jī)制，并有助于發(fā)現(xiàn)弓形蟲腦病新的診斷、預(yù)防、控制和治療方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及蟲株

SPF級6～8周齡雌性BALB/c小鼠購自蘭州大學(xué)實驗動物中心。1只10周齡的中國貍花貓(Chinese Li Hua Mao)，購自蘭州雁灘花鳥市場，經(jīng)間接血凝試驗(IHA)和改良凝集試驗(MAT)檢測[23]，呈弓形蟲抗體陰性。弓形蟲Ⅱ型PRU株系由本實驗室經(jīng)小鼠傳代保存。

1.2 主要試劑及儀器

Bradford 蛋白定量試劑盒(Bio-Rad)、iTRAQ?Reagents Multiplex Kit(Sigma)、質(zhì)譜級胰酶(Promega)、L-3000 HPLC(RIGOL)、EASY-nLCTM1200 納升級 UHPLC(Thermo)、Q ExactiveTM HF-X 質(zhì)譜儀(Thermo)、C18除鹽柱(Thermo)、RT-6100 酶標(biāo)儀(雷杜)、3k超濾管(Millipore)、組織研磨儀(上海凈信)、超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝)。

1.3 卵囊的制備與收集

弓形蟲PRU蟲株感染小鼠制備包囊，含100個PRU株包囊的小鼠腦組織研磨液飼喂小貓。飼喂后第3天起對貓糞便進(jìn)行顯微鏡檢查，檢測到卵囊后，收集糞便，利用蔗糖浮選和氯化銫梯度離心法對卵囊進(jìn)行分離純化[18，24]。將純化過的卵囊360 r·min-1離心后，置于2 mL·L-1硫酸中懸浮，室溫下?lián)u床搖動7 d，獲得孢子化(即感染性)的卵囊。用0.85 mL·L-1生理鹽水洗滌2次，2 mL·L-1硫酸懸浮。最后，對卵囊計數(shù)，調(diào)整為每毫升PBS含100個卵囊, 4 ℃保存?zhèn)溆肹25]。

1.4 弓形蟲卵囊感染及小鼠腦組織收集

12只SPF 6～8周齡雌性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為4組，每組3只。隨機(jī)選擇其中兩組，1 mL PBS(含100個孢子化卵囊) 灌胃感染，另外兩組為對照組，1 mL PBS緩沖液灌胃。在感染后的第11和33天[26-29]，麻醉處理后，無菌采集腦組織，使用TIANamp Genomic DNA kit (TianGenTM, Beijing, China) 提取腦組織基因組DNA，-20 ℃保存，利用弓形蟲B1基因經(jīng)PCR擴(kuò)增進(jìn)一步證實腦組織中弓形蟲的存在，最后樣品經(jīng)瞬時液氮冷凍后轉(zhuǎn)移至—80 ℃冰箱保存，用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

1.5 蛋白質(zhì)抽提及定量

樣品低溫條件研磨成粉，迅速轉(zhuǎn)移至離心管(經(jīng)液氮預(yù)冷)，加入蛋白質(zhì)裂解液(50 mmol·L-1Tris-HCl、8 mol·L-1尿素、0.2 mL·L-1SDS，pH=8)，振蕩混勻，冰水浴超聲5 min。充分裂解后，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min。取上清加入終濃度2 mmol·L-1二硫蘇糖醇，56 ℃反應(yīng)1 h后,加入足量碘乙酸，室溫避光反應(yīng)1 h。離心管中加入4倍體積的丙酮(經(jīng)-20 ℃預(yù)冷)，-20 ℃條件下進(jìn)行沉淀(不少于2 h)，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min收集沉淀。再加入1 mL 經(jīng)-20 ℃預(yù)冷處理過的丙酮，重新懸浮并清洗沉淀后，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，收集沉淀，風(fēng)干，加入蛋白溶解液(8 mol·L-1尿素、100 mmol·L-1TEAB，pH=8.5)溶解蛋白沉淀。將抽提出來的蛋白按照Bradford 蛋白質(zhì)定量試劑盒說明書的要求進(jìn)行蛋白定量。

1.6 樣品的酶解、iTRAQ標(biāo)記蛋白及HPLC分級

每個樣品各取100 μg蛋白，加入蛋白溶解液定容至100 μL，分別加入1 μg·μL-1胰酶2 μL和100 mmol·L-1TEAB緩沖液500 μL，混勻，37 ℃酶切過夜。再加等體積的1 mL·L-1甲酸，混勻，室溫條件下，12 000 r·min-1離心 5 min。將上清通過C18除鹽柱處理后，清洗洗脫，洗脫樣合并后凍干。加入 0.5 mol·L-1TEAB緩沖液20 μL復(fù)溶，并加入足量 iTRAQ 標(biāo)記試劑(溶于異丙醇)混勻，室溫反應(yīng)1 h。標(biāo)記采用8-plex 標(biāo)記，方法參考 iTRAQ試劑盒操作說明。配制流動相 A 液(2 mL·L-1乙腈，氨水調(diào)至 pH=10)，使用1 mL A液溶解標(biāo)記后的混合樣品粉末，室溫下12 000 r·min-1離心10 min， 取1 mL體積上清進(jìn)樣。使用L-3000 HPLC系統(tǒng)，色譜柱為XBridge Peptide BEH C18(25 cm×4.6 mm, 5 μm)，進(jìn)行HPLC分級。

1.7 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析、差異蛋白篩選及生物信息學(xué)分析

每個餾分上清各取 2 μg進(jìn)樣，液質(zhì)檢測。使用 EASY-nLCTM1200 納升級 UHPLC 系統(tǒng)，按儀器說明進(jìn)行液相色譜洗脫。使用 Q ExactiveTM HF-X 質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜序列測定，生成質(zhì)譜檢測原始數(shù)據(jù)(raw文件)。將下機(jī)后的raw文件直接導(dǎo)入到Proteome Discoverer2.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，譜肽、蛋白定量。按差異倍數(shù)FC(Fold Change)篩選差異表達(dá)蛋白，其中，F(xiàn)C≥1.5且P≤0.05為上調(diào)表達(dá)蛋白，F(xiàn)C≤0.83且P≤0.05為下調(diào)表達(dá)蛋白。利用Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)對篩選到的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO功能富集分析。同時，利用 KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes) 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異蛋白通路富集分析。最后利用STRING(https://string-db.org/)獲取蛋白互作數(shù)據(jù)，使用Cytoscape3.7.2進(jìn)行蛋白互作分析。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)蛋白的篩選

依據(jù)FC≥1.5 或者≤0.83 倍，P≤0.05 的篩選條件，在急性感染階段，共篩選出85個差異表達(dá)蛋白，其中,30個上調(diào)表達(dá)，55個下調(diào)表達(dá)。在慢性感染階段，共篩出51個差異表達(dá)蛋白，其中47個上調(diào)表達(dá)，4個下調(diào)表達(dá)。而慢性感染階段與急性感染階段相比，共有114個差異表達(dá)蛋白，其中,71個上調(diào)表達(dá)，43個下調(diào)表達(dá)(圖1)。相關(guān)蛋白組數(shù)據(jù)已通過iProX[30]上傳ProteomeXchange，獲得的接收編號為IPX0002989000/PXD025815。

2.2 差異蛋白的GO功能富集分析

對弓形蟲卵囊急慢性感染小鼠腦組織鑒定到的差異蛋白進(jìn)行GO分析(圖2)可以發(fā)現(xiàn)，在弓形蟲卵囊急性感染期，差異表達(dá)蛋白在生物過程排在首位的為運輸(transport)，差異蛋白主要表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)；而慢性感染中免疫系統(tǒng)過程(immune system process)排在首位，表現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。在細(xì)胞組分中，排在首位的均為生物膜(membrane)，分別表現(xiàn)為下調(diào)和上調(diào)。在分子功能中，排在首位的分別為離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性(ion transmembrane transporter activity)和小分子結(jié)合(small molecule binding)，分別表現(xiàn)為下調(diào)和上調(diào)。

與急性感染相比，慢性感染小鼠腦組織差異表達(dá)蛋白在生物過程、細(xì)胞組分和分子功能主要在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(regulation of intracellular signal transduction)、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物(plasma membrane protein complex)、半胱氨酸型肽酶活性(cysteine-type peptidase activity)方面表現(xiàn)出差異。

2.3 差異表達(dá)蛋白的KEGG通路分析

對于弓形蟲卵囊急性感染小鼠，在85個差異表達(dá)蛋白中，有59個蛋白被注釋，共涉及115條通路。慢性感染小鼠的51個差異表達(dá)蛋白中，有38個蛋白被注釋，共涉及56條通路。弓形蟲慢性感染與急性感染相比，在114個差異表達(dá)蛋白中，有79個蛋白被注釋，共涉及103條通路。

對差異表達(dá)蛋白進(jìn)行KEGG通路分析(圖3)，相同的路徑富集主要集中在同種異體移植排斥(allograft rejection)、抗原處理和呈遞(antigen processing and presentation)、自身免疫性甲狀腺疾病(autoimmune thyroid disease)、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease)、單純皰疹病毒感染(herpes simplex infection)、弓形蟲病(toxoplasmosis)、Ⅰ型糖尿病(Type I diabetes mellitus)、病毒性心肌炎(viral myocarditis)，這些通路多與機(jī)體免疫應(yīng)答過程相關(guān)。在弓形蟲急性感染期，其他路徑包括鈣信號通路(calcium signaling pathway)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus)等通路相關(guān)蛋白也表現(xiàn)差異性表達(dá)。在慢性感染期，與原發(fā)性免疫缺陷(primary immunodeficiency)、肺結(jié)核(tuberculosis)等相關(guān)通路蛋白表現(xiàn)出特異性表達(dá)。急慢性感染相比多種信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)呈現(xiàn)特異性，如甲狀腺激素信號通路(thyroid hormone signaling pathway)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)。

2.4 差異表達(dá)蛋白的互作分析

急性感染小鼠腦組織差異蛋白互作分析(圖4)發(fā)現(xiàn)，信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白1(Stat1)處于作用網(wǎng)絡(luò)中心，與干擾素-γ(IFN-γ)誘導(dǎo)的GTP酶(Igtp、Iigp1)、免疫相關(guān)的GTP酶(Irgm1、Irgm2)、鳥苷酸結(jié)合蛋白(Gbp2、Gbp6)、β-2-微球蛋白(B2 m)等上調(diào)表達(dá)蛋白及血清白蛋白(Alb)等下調(diào)表達(dá)蛋白具有相互作用。慢性感染期間，絕大多數(shù)蛋白均表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)，蛋白酶體亞基(Psmb8)處于網(wǎng)絡(luò)中心，除與Stat1、Igtp、Irgm1、Irgm2、Gbp2等具有相互作用外，還與泛素蛋白(Isg15)、干擾素-γ誘導(dǎo)蛋白(Ifi47、Ifit3)等具有相互作用。

慢性與急性感染小鼠腦組織差異蛋白互作分析發(fā)現(xiàn)，干擾素-γ誘導(dǎo)蛋白(Ifi47)處于作用網(wǎng)絡(luò)中心，與Stat1、Isg15、Irgm2、Irgm1、Iigp1、Psbm10、B2m、胞嘧啶單磷酸激酶2(Cmpk2)等上調(diào)表達(dá)蛋白及囊泡相關(guān)蛋白(Vta1)等下調(diào)表達(dá)蛋白具有相互作用。

3 討 論

作者應(yīng)用iTRAQ技術(shù)結(jié)合2D-LC-MS/MS，對弓形蟲PRU株卵囊感染后11和33 d的小鼠大腦差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行了GO功能富集、KEGG通路分析以及蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析。多數(shù)差異表達(dá)蛋白都參與代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)等過程。KEGG路徑分析表明，多數(shù)差異表達(dá)蛋白與機(jī)體免疫應(yīng)答過程相關(guān)。

A. 急性感染；B. 慢性感染；C. 慢性vs 急性感染A. Acute infection; B. Chronic infection; C. Chronic infection vs Acute infection圖2 弓形蟲卵囊急慢性感染階段腦組織差異蛋白進(jìn)行GO分類富集分析Fig.2 The GO classification enrichment analysis of all DEPs of mouse brain infected with Toxoplasma gondii oocysts

A. 急性感染 B.慢性感染 C. 慢性vs 急性感染A. Acute infection; B. Chronic infection; C. Chronic vs Acute infection圖3 弓形蟲卵囊急慢性感染小鼠腦組織差異表達(dá)蛋白KEGG通路分析(top20)Fig.3 KEGG pathway analysis of all DEPs of mouse brain infected with Toxoplasma gondii oocysts (top20)

A. 急性感染 B.慢性感染 C. 慢性vs 急性感染A. Acute infection; B. Chronic infection; C. Chronic vs Acute infection圖4 弓形蟲卵囊急慢性感染小鼠腦組織差異表達(dá)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Interaction network of all DEPs of mouse brain infected by Toxoplasma gondii oocysts

與弓形蟲PRU株包囊感染相比，卵囊感染有多種蛋白呈現(xiàn)相同的表達(dá)趨勢，如包囊感染14 d泛素C末端水解酶L1(Uchl1)與卵囊慢性感染中均表現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，包囊感染21 d鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白α-1亞基與卵囊急性感染中鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白α-2亞基均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)[26]。而卵囊急性感染期絲氨酸蛋白酶抑制劑(Serpin A3k)(見圖4A)下調(diào)表達(dá)，在包囊感染7、14以及21 d，該蛋白呈現(xiàn)持續(xù)上調(diào)表達(dá)[26]。多種絲氨酸蛋白酶抑制劑具有免疫調(diào)節(jié)特性，如阻止核因子(NF-κB)激活來抑制炎癥反應(yīng)[31]，可見Serpin A3k在卵囊急性感染期的低表達(dá)與誘導(dǎo)宿主免疫增強(qiáng)來抵抗弓形蟲感染有關(guān)。此外蛋白酶體活化復(fù)合物3(Psme3)在包囊感染7及14 d均下調(diào)表達(dá)，而在卵囊慢性感染期psme1呈上調(diào)表達(dá)。此外在包囊感染中有多種差異表達(dá)蛋白在卵囊感染中未檢測到，如蛋白Lmnb1、Eif1a、Cops4等[26]?？梢姽蜗x包囊感染與卵囊感染具有差異性。

弓形蟲卵囊急慢性感染期間免疫應(yīng)答效應(yīng)顯著增強(qiáng)。IFN-γ是弓形蟲感染后產(chǎn)生的重要細(xì)胞因子[32]，在感染弓形蟲的細(xì)胞中強(qiáng)烈刺激細(xì)胞引發(fā)自主免疫，其誘導(dǎo)的效應(yīng)物如IFN誘導(dǎo)的GTP酶、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等在抑制弓形蟲生長及其在細(xì)胞自主免疫反應(yīng)中起重要作用[33]。IFN-γ誘導(dǎo)宿主防御弓形蟲的效應(yīng)機(jī)制是研究熱點之一，從感染初期直到慢性感染，多種與IFN-γ相關(guān)的蛋白表達(dá)量隨之增加以應(yīng)對感染，如Gbp2、Gbp2b、Gbp5、Gbp6、Gbp7等均上調(diào)表達(dá)，這與Hu等[25]的結(jié)果一致。p65鳥苷酸結(jié)合蛋白(GBPs) 是GTP酶家族四個成員之一[34]，其中小鼠鳥苷酸結(jié)合蛋白家族(mGBPs)是由炎癥細(xì)胞因子IFN-γ誘導(dǎo)的，并已被證明是誘發(fā)自主免疫抵抗弓形蟲感染的重要物質(zhì)[35]。Degrandi等[36]證實mGBP2是介導(dǎo)寄生蟲抗性的基本免疫效應(yīng)分子，能積聚在寄生蟲的質(zhì)膜上進(jìn)而破壞了寄生蟲的完整性。相關(guān)研究結(jié)果表明mGBPs對弓形蟲的抗性可能與其在納空泡膜(PVM)中積累和破壞囊泡完整性有關(guān)[37-38]。

作為GTP酶的Irgm1、Irgm2、Igtp、ligp1、Tgtp1等蛋白在小鼠腦組織中上調(diào)表達(dá)，這與Hu等[25]的試驗結(jié)果一致。GBP含有一個保守的GTP酶結(jié)構(gòu)域，儲存于正常細(xì)胞中，一旦受到弓形蟲感染便可迅速定位到囊泡上，并在囊泡上形成聚合體對弓形蟲囊泡結(jié)構(gòu)造成破壞。GTP的水解為這一聚合過程及這一過程的化學(xué)修飾提供能量，這可以解釋GBP與GTP酶同時表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象。

卵囊急性感染階段小鼠腦組織細(xì)胞能量供代謝受抑制。肌酸激酶(Ckm)在所有脊椎動物中都存在，可催化肌酸和ATP的可逆反應(yīng)，形成磷酸肌酸和ADP[39]，在能量傳導(dǎo)以及間歇性高能量需求細(xì)胞的能量平衡中起著重要作用[40]。在弓形蟲急性感染階段，肌酸激酶呈下調(diào)表達(dá)，這與周永華等[41]的研究結(jié)果一致。此外急性感染小鼠腦組織中血紅蛋白(Hbb-b1和Hba-a2)的合成受抑制，這將導(dǎo)致氧氣從肺部到腦組織的輸送效率降低，導(dǎo)致腦部組織能量供應(yīng)受阻以及腦組織細(xì)胞內(nèi)環(huán)境pH的改變。碳酸酐酶 8 (Car8) 是三磷酸肌醇受體 1 (ITPR 1) 的變構(gòu)抑制劑，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放，對關(guān)鍵細(xì)胞功能如線粒體能量產(chǎn)生中至關(guān)重要[42]，在急性感染中Car8呈下調(diào)表達(dá)。

免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平在弓形蟲卵囊急、慢性感染中被顯著上調(diào)。Stat1和IFN-γ的活性對于調(diào)控弓形蟲急、慢性感染是必不可少的[43]。IFN-γ主要通過JAK/STAT1信號通路激活基因表達(dá)[44]，Stat1可以在IFN-γ存在的條件下被磷酸化，進(jìn)而形成二聚體遷移至細(xì)胞核，在細(xì)胞核中激活抗病原體相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[45]。弓形蟲效應(yīng)體TgIST運輸?shù)剿拗骷?xì)胞核后通過將抑制性Mi-2/NuRD復(fù)合物募集到染色質(zhì)上的Stat1來阻斷Stat1的轉(zhuǎn)錄來適時抵抗宿主的防御[46-47]。試驗結(jié)果表明在弓形蟲卵囊急慢性感染中Stat1均上調(diào)表達(dá)，這也與弓形蟲急性和慢性感染GO富集及KEGG通路富集結(jié)果相吻合。

4 結(jié) 論

對弓形蟲PRU株卵囊急慢性感染小鼠后腦組織差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析，在急性感染期小鼠腦組織能量代謝受到明顯抑制，慢性感染期小鼠免疫應(yīng)答變得十分強(qiáng)烈，這與Ckm 的下調(diào)及mGbp2、Irgm1、Irgm2、Igtp的上調(diào)表達(dá)相關(guān)。結(jié)果表明多種與免疫相關(guān)的蛋白顯著上調(diào)，可見機(jī)體抗弓形蟲的生理過程是在多種蛋白協(xié)同下完成的，本研究將為弓形蟲腦病的研究及弓形蟲卵囊感染的致病機(jī)制研究提供重要的參考數(shù)據(jù)。