副豬嗜血桿菌qseB、qseC雙基因缺失株的構(gòu)建及生物學(xué)特性

何綠琴，閆雪鋒，文心田，曹三杰，黃小波，伍 銳，趙 勤，文翼平*

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 豬病研究中心，成都 611130； 2. 西南醫(yī)科大學(xué)科技處 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，瀘州 646000； 3. 西南醫(yī)科大學(xué)體育學(xué)院，瀘州 646000)

副豬嗜血桿菌(Glaesserellaparasuis)是一種非運(yùn)動(dòng)性、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 依賴的細(xì)菌[1]，可引起仔豬的豬格氏病(Gl?sser’s disease)[2]，給全世界養(yǎng)豬行業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。副豬嗜血桿菌主要臨床癥狀為發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、跛行、共濟(jì)失調(diào)、皮毛粗糙[5-6]。副豬嗜血桿菌常定植于豬上呼吸道，宿主遇到壓力時(shí)，可穿透黏膜屏障進(jìn)入血流，導(dǎo)致嚴(yán)重的血管病變和多種綜合征[7]。

雙組分系統(tǒng)由位于細(xì)胞膜上的組氨酸蛋白激酶(HK)和細(xì)胞質(zhì)中的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子(RR)組成[8]，參與調(diào)控細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖、代謝、運(yùn)動(dòng)、耐藥和毒力因子的表達(dá)[9]。雙組分系統(tǒng)廣泛存在于副豬嗜血桿菌、大腸桿菌、沙門(mén)菌、流感嗜血桿菌和胸膜肺炎放線桿菌中[10-15]。

QseBC雙組分系統(tǒng)是腸桿菌科細(xì)菌和巴氏桿菌中重要的毒力調(diào)控因子[16]。QseC是一種跨膜蛋白，作為密度感應(yīng)的組氨酸激酶受體[17]，參與體內(nèi)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞侵襲和競(jìng)爭(zhēng)性定植。在大腸桿菌中，QseC誘導(dǎo)autoinducer-3和/或腎上腺素/去甲腎上腺素信號(hào)分子的自磷酸化，并將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到QseB，調(diào)節(jié)毒力相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[18]。qseC基因缺失時(shí)，細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌群落(IBCs)形成的缺陷削弱了副豬嗜血桿菌感染小鼠的能力[11,19-20]。QseC在大腸桿菌中誘導(dǎo)腎上腺素并促進(jìn)生物膜形成。QseB調(diào)控傷寒沙門(mén)菌的生物膜形成和毒力[21]。

在這項(xiàng)研究中，作者通過(guò)自然轉(zhuǎn)化法構(gòu)建了ΔqseBC雙基因缺失株，并對(duì)其在血清抗性、生物膜形成、抗生素抗性和脅迫耐受性中的作用進(jìn)行了研究，以確定QseBC雙組分系統(tǒng)在副豬嗜血桿菌致病過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株、引物及細(xì)菌生長(zhǎng)條件

本研究中使用的菌株見(jiàn)表1，引物見(jiàn)表2。野生型菌株SC1401(血清型11型)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院豬病研究中心提供。ΔqseC、ΔqseBC基因缺失株和互補(bǔ)菌株(C-ΔqseBC)由本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中構(gòu)建并保存[22]。副豬嗜血桿菌在胰蛋白酶大豆肉湯(TSB；Difco，美國(guó))或胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA；Difco NJ，美國(guó))平板上生長(zhǎng)，補(bǔ)充5% 滅活牛血清和0.1% 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD; Sigma-Aldrich, USA)。培養(yǎng)基因缺失株或互補(bǔ)株時(shí)，培養(yǎng)基中添加卡那霉素(50 μg·mL-1)或慶大霉素(20 μg·mL-1)。

表1 本研究所用的菌株

1.2 ΔqseBC缺失株和互補(bǔ)株的復(fù)蘇及鑒定

ΔqseBC基因缺失株和互補(bǔ)株C-ΔqseBC由本實(shí)驗(yàn)室在之前的研究中構(gòu)建和保存[22]。將凍干菌株SC1401、ΔqseBC和C-ΔqseBC從-80 ℃冰箱中取出。用接種環(huán)小心挑取細(xì)菌，放入裝有TSB培養(yǎng)基的試管中，37 ℃培養(yǎng)13 h，吸取菌液進(jìn)行PCR鑒定。用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)基因缺失及鑒定引物(表2)。

表2 本研究所用的引物

1.3 抗血清殺菌試驗(yàn)

抗血清殺菌試驗(yàn)按照之前描述的方法進(jìn)行[23]。取健康仔豬血清，用0.22 μm濾膜過(guò)濾。部分血清在56 ℃下處理30 min，使補(bǔ)體失活。SC1401、ΔqseBC和C-ΔqseBC在TSB中培養(yǎng)至OD600 nm為0.8。然后，80 μL細(xì)菌培養(yǎng)物與20 μL新鮮血清或熱處理血清混合?；旌衔镌?7 ℃下輕輕搖動(dòng)孵育1 h，隨后將混合物稀釋后涂布于TSA板上，37 ℃孵育24 h。通過(guò)測(cè)定新鮮血清和熱處理血清中菌落的比例來(lái)計(jì)算存活率。每個(gè)樣本至少進(jìn)行3次重復(fù)。

1.4 壓力耐受試驗(yàn)

壓力耐受試驗(yàn)根據(jù)之前描述的方法進(jìn)行。將50 μL SC1401、ΔqseBC和 C-ΔqseBC的過(guò)夜培養(yǎng)物以1∶100 的稀釋度傳代培養(yǎng)到 5 mL TSB中，培養(yǎng)至OD600 nm為0.8。對(duì)于滲透壓耐受能力測(cè)定，細(xì)菌分別在50、100、150和 200 mmol·L-1NaCl 的 TSA 板上培養(yǎng)。對(duì)于氧化應(yīng)激耐受試驗(yàn)，將細(xì)菌分別用1、2、4、8、16 mmol·L-1的H2O2處理30 min。對(duì)于熱休克試驗(yàn)，細(xì)菌分別在39、42或 45 ℃中孵育30 min。每個(gè)菌株未處理菌液作為陰性對(duì)照納入每個(gè)試驗(yàn)。培養(yǎng)后，在PBS中連續(xù)稀釋培養(yǎng)物，并通過(guò)平板計(jì)數(shù)測(cè)定CFU?？箲?yīng)激細(xì)胞的百分比計(jì)算為[(應(yīng)激樣品CFU·mL-1)/(對(duì)照樣品CFU·mL-1)]×100%。每項(xiàng)分析單獨(dú)進(jìn)行3次。

1.5 微孔板生物被膜檢測(cè)試驗(yàn)

生物被膜的形成有助于細(xì)菌抵御不良環(huán)境的侵害，幫助其逃避宿主的免疫系統(tǒng)和抗生素的作用，導(dǎo)致細(xì)菌的抵抗能力增強(qiáng)[24]。由于副豬嗜血桿菌野生型菌株CF7066及其突變株ΔclpP可以在48 h形成生物膜[7]，并且流感嗜血桿菌也具有在24 h形成生物膜的能力[25]。參考之前報(bào)道進(jìn)行生物被膜形成試驗(yàn)[14]，通過(guò)96孔微孔板定量檢測(cè)副豬嗜血桿菌的生物被膜形成[26]。利用生物被膜內(nèi)物質(zhì)可與某些染料結(jié)合的特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)生物被膜染色的方法進(jìn)行定性或定量分析。為了確定基因缺失菌株的生物膜形成是否隨著時(shí)間的推移始終低于野生菌株。將生物膜形成觀察時(shí)間延長(zhǎng)至96 h。將SC1401、ΔqseBC和C-ΔqseBC接種96孔圓底微量滴定板，37 ℃分別培養(yǎng)48、72和96 h。去除細(xì)菌懸浮液，流水洗滌松散黏附在微孔板上的細(xì)菌，將微孔板上的生物膜用 99%的甲醇溶液固定15 min，移除甲醇，自然干燥后用0.1%的Hucker’s結(jié)晶紫(CV)溶液染色30 min，再經(jīng)水洗、干燥，33%的乙酸溶解被結(jié)合的結(jié)晶紫。最后在595 nm處測(cè)量光密度(OD)。副豬嗜血桿菌SC1401、ΔqseBC和C-ΔqseBC均設(shè)8個(gè)重復(fù)孔，試驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行3 次。采用t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 抗生素敏感性測(cè)定

抗生素敏感性試驗(yàn)參考文獻(xiàn)[27]進(jìn)行。浮游細(xì)菌的最小抑制濃度(MIC-P)通過(guò)肉湯微量稀釋測(cè)定法測(cè)定，使用新鮮TSB培養(yǎng)基進(jìn)行連續(xù)2倍稀釋。微量滴定板在 37 ℃ 下孵育，并在 24 h后對(duì)生長(zhǎng)或不生長(zhǎng)進(jìn)行目測(cè)評(píng)分。

生物膜細(xì)菌的最小殺菌濃度(MBC-B)按所述方法確定[28]。將 96 孔微量滴定板中過(guò)夜培養(yǎng)的生物膜菌暴露于連續(xù)稀釋的抗生素至少24 h。然后，用新鮮 TSB 替換含抗生素的培養(yǎng)基并培養(yǎng) 24 h。將菌液涂布于TSA 培養(yǎng)觀察菌落個(gè)數(shù)來(lái)評(píng)估生物膜中細(xì)菌的生存能力。所有試驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行3次。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad PRISM 5.0軟件分析，當(dāng)兩個(gè)試驗(yàn)組進(jìn)行比較時(shí)使用t檢驗(yàn)分析，當(dāng)3個(gè)或更多試驗(yàn)組進(jìn)行比較時(shí)使用ANOVA分析。

2 結(jié) 果

2.1 ΔqseBC缺失株和互補(bǔ)株的復(fù)蘇與鑒定

對(duì)復(fù)蘇的細(xì)菌進(jìn)行PCR鑒定(圖1)。只有SC1401和C-ΔqseBC中能擴(kuò)增出qseB(672 bp)和qseC(1 401 bp)條帶，而ΔqseBC中無(wú)法擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)條帶。當(dāng)使用引物Kan-F/R檢測(cè)時(shí)，親本株不產(chǎn)生條帶，缺失株和互補(bǔ)株產(chǎn)生條帶，大小為935 bp。

SC1401、ΔqseBC和C-ΔqseBC均能擴(kuò)增出822 bp 條帶，表明三者均為副豬嗜血桿菌。使用引物 P5 (qseB-F)/P6 (qseB-R) 從野生株和互補(bǔ)株中擴(kuò)增出672 bp的qseB基因片段，但未從基因缺失株中擴(kuò)增出此條帶。使用引物 P7 (qseC-F)/P8 (qseC-R) 從野生株和互補(bǔ)株中擴(kuò)增出1 401 bp的qseC基因片段，但未從基因缺失株中擴(kuò)增出此條帶。使用引物P1(Kan-F)/P2(Kan-R)從基因缺失株和互補(bǔ)株中擴(kuò)增出935 bp的kan片段，但野生型菌株SC1401中沒(méi)有擴(kuò)增出此條帶，表明ΔqseBC基因缺失株及其互補(bǔ)菌株構(gòu)建成功。

M.DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、5、9. 引物HPS-F/ R鑒定；2、6、10. 引物qseB-F/ R鑒定；3、7、11. 引物qseC-F/ R鑒定；4、8、12. 引物Kan-F/ R鑒定M.DL5000DNA marker；1, 5, 9. Identification with primers HPS-F/ R; 2, 6,10. Identification with primers qseB-F/R; 3,7,11. Identification with primers qseC-F/R; 4, 8,12. Identification with primers Kan-F/ R圖1 ΔqseBC基因缺失株和互補(bǔ)株的鑒定Fig.1 Identification of ΔqseBC mutant and complementary strain C-ΔqseBC

試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)，每次重復(fù)設(shè)3個(gè)平行組，誤差線代表3次重復(fù)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差,星號(hào)表示使用雙向方差分析的統(tǒng)計(jì)顯著性(***. P<0.001)Data indicate the means of three independent experiments performed in duplicate, and error bars show standard deviations. Asterisks indicate a statistical significance using a two-way ANOVA (***. P<0.001)圖2 SCl401、ΔqseBC和C-ΔqseBC在豬血清中的存活率Fig.2 Survival rate of SCl401, ΔqseBC and C-ΔqseBC treated with porcine serum

2.2 親本株和缺失株抗血清殺菌能力比較

結(jié)果(圖2)顯示，野毒株SC1401具有更高水平的抗血清殺菌能力(P<0.05)。ΔqseBC、SC1401和C-ΔqseBC的存活率分別為55.12%、83.76%和81.81%。這些結(jié)果表明QseBC可能與副豬嗜血桿菌抗血清殺菌能力相關(guān)。

2.3 野毒株和缺失株對(duì)環(huán)境壓力耐受能力比較

本研究測(cè)定了SC1401、ΔqseBC和C-ΔqseBC在不同脅迫條件下的存活率。當(dāng)細(xì)胞暴露于50、100和150 mmol·L-1NaCl，ΔqseBC的存活率分別為84.12%、45.35%和15.75%，遠(yuǎn)低于SC1401(92.96%、82.85% 和35.5%)(圖3A)。細(xì)胞用1、2、4、8和16 mmol·L-1H2O2處理30 min時(shí)，ΔqseBC的存活率為50.71%～68.90%，遠(yuǎn)低于SC1401(67.14%～94.70%)(圖3B)。在熱休克試驗(yàn)中也觀察到類似結(jié)果，ΔqseBC的存活率在39、42 ℃分別為94.57%和82.12%，與SC1401(94.57%和82.12%)相比顯著降低。在45 ℃下孵育時(shí)，SC1401、ΔqseBC和C-ΔqseBC菌株無(wú)法存活(圖3C)。C-ΔqseBC恢復(fù)了對(duì)滲透壓、氧化應(yīng)激和熱休克的耐受能力。這些結(jié)果表明，qseBC雙基因的缺失削弱了副豬嗜血桿菌對(duì)氧化、高滲和熱休克應(yīng)激的耐受力，證實(shí)qseBC是副豬嗜血菌中的脅迫相關(guān)基因。

2.4 野毒株和缺失株生物被膜形成能力比較

本研究采用生物被膜結(jié)晶紫染色法對(duì)其含量進(jìn)行定量測(cè)定。如圖4所示，缺失株ΔqseBC的生物被膜經(jīng)過(guò)Hucker’s結(jié)晶紫(CV)染色后著色較淺，然后用33%的乙酸溶解被結(jié)合的結(jié)晶紫，發(fā)現(xiàn)ΔqseBC的OD595 nm顯著低于野毒株SC1401和互補(bǔ)株。結(jié)果表明QseBC直接或間接參與了生物膜形成的調(diào)控。

2.5 野毒株和缺失株對(duì)抗生素的敏感性比較

如表3所示，野毒株SC1401對(duì)對(duì)頭孢噻呋、氨芐青霉素、多黏菌素B和強(qiáng)力霉素的MIC分別是△qseBC相應(yīng)值的16、8、4、4倍，而對(duì)恩諾沙星、慶大霉素、青霉素、林可霉素和替米考星的MIC分別是△qseBC相應(yīng)值的2倍。然后，作者使用 MBC-B來(lái)檢查 QseBC是否參與生物膜細(xì)胞的抗生素抗性(表3)，缺失株與野毒株表現(xiàn)出相似的抗性水平。QseBC在浮游細(xì)胞和生物膜細(xì)胞中均對(duì)同一類抗生素產(chǎn)生抗性，但氟苯尼考除外，△qseBC的MBC-B較SC1401降低了50%(表3)。與新霉素的MIC-P結(jié)果相似，△qseBC對(duì)新霉素的抗性較SC1401增加100%。大多數(shù)抗性在互補(bǔ)菌株C-△qseBC中恢復(fù)，表明基因缺失株的抗生素敏感性不是由極性效應(yīng)引起的。綜上，這些結(jié)果表明QseBC 參與了副豬嗜血桿菌的浮游和生物膜細(xì)胞對(duì)多種抗生素藥物的耐藥性。

A. 滲透壓(50、100 和150 mmol·L-1 NaCl)；B. 氧化應(yīng)激(1、2、4、8和 16 mmol·L-1 H2O2)；C. 高溫(39和42 ℃水浴)。存活百分比計(jì)算為在應(yīng)激條件下處理的細(xì)菌數(shù)量與在無(wú)應(yīng)激條件下存活的細(xì)菌數(shù)量的比值。數(shù)據(jù)表示3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。星號(hào)表示使用雙向方差分析的統(tǒng)計(jì)顯著性(**. P<0.01; ***. P<0.001)A. Osmotic pressure (50, 100 and 150 mmol·L-1 NaCl); B. Oxidative stress (1, 2, 4, 8 and 16 mmol·L-1 H2O2)；C. High temperature (Incubated in 39 and 42 ℃ water baths). Percent survival was calculated as the ratio of the number of bacteria that treated with stress conditions to the number that survived without stress conditions. Data indicate the means of three independent experiments performed in duplicate, and error bars show standard deviations. Asterisks indicate a statistical significance using a two-way ANOVA (**. P<0.01; ***. P<0.001)圖3 副豬嗜血桿菌SCl401、ΔqseBC和C-ΔqseBC對(duì)滲透壓、氧化應(yīng)激和高溫的耐受力Fig.3 Analysis of the stress tolerance of Glaesserella parasuis strains SC1401, ΔqseBC and C-ΔqseBC

3 討 論

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)報(bào)道的副豬嗜血桿菌的基因組，主要有4對(duì)雙組分系統(tǒng)，分別是CpxA/R、UhpA/Uhpb、QseB/C和ArcA/B。先前研究中，qseB(cheY) 或qseC單基因的缺失影響了副豬嗜血桿菌的部分生物學(xué)特性[10,29]。然而，這可能是由于不同雙組分系統(tǒng)之間的強(qiáng)串?dāng)_所致，并不能直接表明是qseB或qseC基因的作用。為進(jìn)一步研究QseBC 雙組分系統(tǒng)與副豬嗜血桿菌致病機(jī)制的關(guān)系，本研究采用自然轉(zhuǎn)化法探究從副豬嗜血桿菌SC1401基因組中同時(shí)敲除qseB和qseC基因獲得ΔqseBC雙基因缺失株。繼而比較了缺失株和野生株的抗血清殺菌能力、壓力耐受能力、生物被膜形成能力和對(duì)部分抗生素的敏感性。

細(xì)菌分別培養(yǎng)48(A)、72(B)和96 h(C)。通過(guò)測(cè)量OD595 nm對(duì)生物膜生成情況進(jìn)行定量。左圖為生物膜染色結(jié)果，右圖為采用33%的乙酸溶解結(jié)晶紫的脫色結(jié)果。試驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行3次，誤差線代表3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。星號(hào)表示使用雙向方差分析 (***. P<0.001)的統(tǒng)計(jì)顯著性Biofilms were cultured for 48 (A), 72 (B) and 96 h (C), respectively. The remaining biofilms were quantitated by OD595nm measurement. The left picture shows the result of biofilm staining, and the right picture shows the decolorization result of crystal violet dissolved with 33% acetic acid. The experiments were performed three times independently in triplicates. Quantification of biofilm production. Error bars represent the standard deviations of three independent experiments. Asterisks indicate statistical significance using a two-way ANOVA (***. P<0.001)圖4 副豬嗜血桿菌SC1401、ΔqseBC和C-ΔqseBC在96孔微量滴定板中形成的生物被膜Fig.4 Detachment of biofilm colonies of G.parasuis WT, ΔqseBC and C-ΔqseBC grown in 96-well microtiter plates

細(xì)菌生物被膜的形成會(huì)增加病原菌對(duì)抗生素的抵抗力, 生物被膜形成對(duì)于引起持續(xù)感染至關(guān)重要[30-32]。QseBC雙組分系統(tǒng)參與了伴放線菌和大腸桿菌的生物被膜形成[3,19,33-35]，并通過(guò)修飾毒力相關(guān)的表面結(jié)構(gòu)，如鞭毛、菌毛和分泌系統(tǒng)等，調(diào)節(jié)遲發(fā)性大腸桿菌的細(xì)胞內(nèi)毒力[5]。副豬嗜血桿菌中PotD、galU、galE、ClpP等基因均參與了該菌生物被膜等形成[7,23,36]，在先前研究中發(fā)現(xiàn)，副豬嗜血桿菌的ΔqseB和ΔqseC基因缺失株與野毒株相比，生物被膜形成能力明顯減弱[10,29]。在本研究中，副豬嗜血桿菌qseB和qseC雙基因缺失后，形成的生物被膜明顯弱于野毒株。

抗血清殺菌能力是病原菌抵抗宿主殺傷作用，引起宿主全身性感染的重要工具。Ding等[37]通過(guò)自然轉(zhuǎn)換敲除ArcA/B雙組分系統(tǒng)中的arcA基因，發(fā)現(xiàn)arcA基因參與副豬嗜血桿菌的血清抗性和毒力。謹(jǐn)瑾等[36]構(gòu)建了副豬嗜血桿菌potD基因缺失株，發(fā)現(xiàn)potD基因的缺失導(dǎo)致該菌的抗血清殺菌能力顯著降低。Zou等[23]發(fā)現(xiàn)galU和galE基因在副豬嗜血菌 SC096 菌株的血清抗性中起關(guān)鍵作用。本研究顯示，與野毒株SC1401相比，ΔqseBC對(duì)豬血清殺菌活性的敏感性明顯增加。

表3 副豬嗜血桿菌野生菌株SC1401、△qseBC缺失株和互補(bǔ)株對(duì)不同抗菌物質(zhì)的敏感性

細(xì)菌侵入宿主面臨巨大的生存壓力。副豬嗜血桿菌通常定植于豬的上呼吸道和肺部以及其他富含活性氧的部位，對(duì)細(xì)菌的生存是巨大挑戰(zhàn)。QseBC與腸出血性大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)菌適應(yīng)宿主環(huán)境有關(guān)，可通過(guò)感應(yīng)腎上腺素、去甲腎上腺素和自誘導(dǎo)劑 3 來(lái)調(diào)節(jié)毒力相關(guān)基因的表達(dá)[30, 38]。為了研究QseBC是否影響副豬嗜血桿菌對(duì)外界壓力的耐受能力，作者在體外使用H2O2、高濃度 NaCl和高溫對(duì)SC1401、ΔqseBC和C-ΔqseBC進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn) ΔqseBC對(duì)高溫、氧化應(yīng)激和滲透壓的耐受能力明顯下降，表明QseBC參與了副豬嗜血桿菌對(duì)外界壓力的耐受能力。

迄今為止，大多數(shù)已發(fā)表的關(guān)于細(xì)菌耐藥性的研究主要集中在浮游細(xì)菌，而對(duì)生物膜細(xì)菌知之甚少。Cao等[33]研究發(fā)現(xiàn)Cpx雙組分系統(tǒng)與副豬嗜血桿菌應(yīng)激耐受和對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性相關(guān)。Feng等[39]發(fā)現(xiàn)acrB基因缺失后副豬嗜血桿菌對(duì)新生霉素、紅霉素、克拉霉素和阿奇霉素敏感性增強(qiáng)。眾所周知，生物膜中的細(xì)菌比浮游細(xì)菌對(duì)抗生素的耐受力更強(qiáng)。然而，其耐藥機(jī)制仍不完全清楚，需進(jìn)一步研究。本研究表明，與親本菌株相比，ΔqseBC基因缺失株的浮游細(xì)菌和生物膜細(xì)菌對(duì)抗生素藥物的敏感性顯著增加。作者推測(cè)QseBC可能參與了一些耐藥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，導(dǎo)致ΔqseBC較野生菌株SC1401增加了藥物敏感性。而具體的耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

qseB/C雙基因的缺失影響副豬嗜血桿菌對(duì)滲透壓、氧化應(yīng)激和高溫的耐受性，導(dǎo)致該菌生物被膜形成能力、抗血清殺菌能力和對(duì)抗生素的耐藥性減弱。QseBC雙組分系統(tǒng)可能與副豬嗜血桿菌的致病性相關(guān)。