滑液支原體WVU1853株熱不穩(wěn)定延伸因子的表達(dá)及黏附特性分析

岳亞輝，邢小勇，武小椿，溫峰琴，張宏燕，龍翠琴，張 立，馬海云，包世俊

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000)

滑液支原體(Mycoplasmasynoviae，MS)是禽類的一種重要的致病性支原體，主要感染雞和火雞，導(dǎo)致呼吸道病癥、腱鞘炎、關(guān)節(jié)炎及關(guān)節(jié)滑膜炎[1-2]。病禽常表現(xiàn)為生長遲滯、脫水、消瘦、跛行，蛋雞產(chǎn)蛋減少、蛋殼異常且蛋品質(zhì)量差，種雞種蛋孵化率低下，肉雞胴體降級[3-4]。更為嚴(yán)重的是，MS感染雞免疫力下降，常引發(fā)繼發(fā)感染或混合感染，從而使病情加劇、診療困難，淘汰率和病死率大幅增加[5-6]。MS感染呈世界性流行，大部分地區(qū)蛋雞場中MS血清陽性率高于70%，其危害性或?qū)⒊诫u毒支原體(Mycoplasmagallisepticum，MG)，從而給世界造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并嚴(yán)重制約了全球養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展[7-9]。因此，開展MS相關(guān)的研究，將為其感染的預(yù)防、診斷和有效防治奠定理論基礎(chǔ)。

EF-Tu是蛋白質(zhì)生物合成過程中的關(guān)鍵因子之一，在多種生物中廣泛存在[10-11]。研究表明，EF-Tu還參與細(xì)胞的多種生理和病理過程，如細(xì)胞骨架的組成、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤的發(fā)生等[12-13]。此外，EF-Tu亦是一種新型病原相關(guān)模式分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，其與其他蛋白結(jié)合后被分泌到細(xì)胞表面，從而被宿主細(xì)胞識別和捕獲[14-15]。王艷芳等[16]證實牛支原體(Mycoplasmabovis，Mb)EF-Tu為其膜表面免疫原性蛋白，并基于此建立了相關(guān)檢測方法。Yu等[17]發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)可通過EF-Tu與補體系統(tǒng)的調(diào)節(jié)劑H因子結(jié)合從而逃脫補體的殺傷。Balasubramanian等[18]研究證實肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，Mp)EF-Tu通過其羧基端區(qū)域與胞外基質(zhì)成分纖連蛋白結(jié)合，促進(jìn)肺炎支原體與宿主細(xì)胞的黏附，激活炎性反應(yīng)。但迄今為止，尚無MS EF-Tu生物學(xué)功能相關(guān)的研究報道。因此，本研究擬在MS WVU1853 EF-Tu原核表達(dá)的基礎(chǔ)上，通過對rMS EF-Tu免疫原性和EF-Tu在MS內(nèi)分布的分析，以及對rMS EF-Tu抗血清的補體介導(dǎo)殺支原體活性和MS EF-Tu細(xì)胞黏附特性的研究，為MS EF-Tu生物學(xué)功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株、載體、細(xì)胞與動物 MS WVU1853株購自中國獸醫(yī)微生物菌株保藏管理中心；pET-InaZN-EGFP(+)膜表面展示載體、DF-1細(xì)胞為本實驗室保存；pET-28a(+)購自寶生物工程(大連)有限公司；新西蘭兔購自蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 支原體培養(yǎng)基基礎(chǔ)購自青島海博生物技術(shù)有限公司；PrimeSTAR Max Premix(2×)、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ均購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA Marker購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；預(yù)染蛋白Marker購自Thermo公司；Ni-NTA His Bind購自QIAGEN公司；胎牛血清(FBS)購自BI公司；DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶-EDTA溶液購自上海源培生物有限公司；山羊抗兔HPR-IgG、FITC-IgG、Cy3-IgG均購自北京博奧森公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、DiI (細(xì)胞膜紅色熒光探針)、DAPI染色液購自碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗MS血清為本實驗室制備。

1.2 方法

1.2.1 MS基因組DNA提取 MS培養(yǎng)及提取其基因組DNA參照任峰等[19]所述方法。

1.2.2 MSEF-Tu基因的擴(kuò)增 參考GenBank 中MS WVU1853株(NZ_CP011096.1)EF-Tu基因序列，設(shè)計引物對(Tu-F:GCGGGATCCATGGCAAAATTAGATTTTG/Tu-R：CGCCTCGAG- TTATTTAACGATTTTTGTA；分別引入BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點)。取MS基因組溶液4 μL，Tu-F與Tu-R溶液各1 μL，PrimeSTAR Max Premix(2×)20 μL，無菌水補足40 μL后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延伸80 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸7 min，產(chǎn)物回收備用。

1.2.3 pET-EF-Tu原核表達(dá)載體的構(gòu)建 回收產(chǎn)物與pET-28a(+)質(zhì)粒分別經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)感受態(tài)細(xì)胞DH5α，37 ℃過夜培養(yǎng)后挑取單菌落經(jīng)PCR和酶切鑒定，陽性克隆測序，正確質(zhì)粒命名為pET-EF-Tu。

1.2.4 重組蛋白的原核表達(dá) 重組質(zhì)粒pET-EF-Tu轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，以終濃度1.0 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)16 h后8 000 r·min-1離心10 min，棄上清，菌體經(jīng)超聲裂解后按Ni-NTA His Bind試劑盒說明純化重組蛋白(rMS EF-Tu)并用SDS-PAGE分析。

經(jīng)SDS-PAGE分離的rMS EF-Tu轉(zhuǎn)印至NC膜，依次經(jīng)5%的脫脂乳4 ℃過夜封閉、1∶1 000稀釋的MS 抗血清室溫孵育2 h、1∶5 000稀釋的羊抗兔HRP-IgG室溫孵育1.5 h，ECL試劑盒顯色。

1.2.5 rMS EF-Tu抗血清的制備 取純化的重組蛋白rMS EF-Tu適量，參考Bao等[20]方法免疫新西蘭兔以制備多克隆抗體。按0.5 μg·孔-1MS菌體蛋白包被酶標(biāo)板，應(yīng)用間接ELISA 檢測抗血清效價。

1.2.6 MS EF-Tu在MS中分布的分析 取培養(yǎng)至對數(shù)生長后期的MS菌液 100 mL，參考劉佳等[21]所述的方法提取MS細(xì)胞膜蛋白及細(xì)胞質(zhì)蛋白。將提取的MS菌體蛋白、胞膜蛋白和胞質(zhì)蛋白分別包被酶標(biāo)板，以1∶400稀釋的rMS EF-Tu抗血清為一抗，應(yīng)用ELISA方法分析EF-Tu在MS中的分布。同時，將提取的MS細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及其菌體蛋白制樣后取15 μL上樣，按“1.2.4”所述進(jìn)行Western blot分析，一抗為1∶1 000稀釋的rMS EF-Tu抗血清，牛血清白蛋白(BSA)為陰性對照，純化的rMS EF-Tu為陽性對照。

以免疫熒光試驗分析EF-Tu在MS表面的分布，步驟如下：取對數(shù)生長期的MS液體培養(yǎng)物1 mL， 8 000 r·min-1離心10 min，棄上清，沉淀用50 μL無菌PBS重懸后取適量涂片，自然風(fēng)干后用4%多聚甲醛固定，PBST洗滌后用1∶1 000稀釋的rMS EF-Tu抗血清室溫孵育2 h，經(jīng)PBST洗滌后用1∶500稀釋的羊抗兔FITC-IgG 于37 ℃避光孵育1 h，PBST充分洗滌后封片觀察。

1.2.7 補體殺菌試驗 試驗所用血清56 ℃滅活30 min。取2 mL對數(shù)生長期的MS菌液(1.5×108CFU·mL-1) 經(jīng)8 000 r·min-1離心10 min后棄上清，沉淀用無菌PBS懸浮洗滌3次后重懸于1 mL PBS。取血清60 μL與180 μL MS菌體懸液混合，37 ℃孵育30 min后加入60 μL的補體，充分混勻，37 ℃孵育1 h后10倍比稀釋，選取103、104、105稀釋度的懸液按分別涂布60 mm固體培養(yǎng)基(100 μL·板-1)，每個稀釋度平行重復(fù)3個。37 ℃、5% CO2的溫箱中培養(yǎng)3～5 d后計數(shù)菌落。試驗設(shè)rMs EF-Tu抗血清組、MS菌體抗血清組、免疫前血清組、補體對照組(用60 μL PBS替代血清)，重復(fù)3次后按照以下公式計算殺支原體率(%)：

100%

1.2.8 黏附及抑制試驗 黏附及抑制試驗參考Bao等[22]所述：構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-InaZN-EGFP-EF-Tu后轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)并誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)菌經(jīng)無菌PBS洗滌后以無抗無血清DMEM重懸。按100 MOI的量取樣，無抗無血清DMEM定容至1 mL后加入六孔板中單層DF-1細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育2 h后用37 ℃預(yù)熱的PBS洗滌，除去未黏附菌體，用4%多聚甲醛固定后應(yīng)用細(xì)胞膜紅色熒光探針和DAPI染色液分別對細(xì)胞膜和細(xì)胞核染色，最后經(jīng)PBST洗滌后封片觀察。黏附抑制試驗時于表達(dá)菌中加入50 μL血清(1∶20)，混勻并于37 ℃孵育1 h后加入 DF-1細(xì)胞，按前述步驟完成黏附試驗。以pET-InaZN-EGFP轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)的菌株作為陰性對照。試驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 MS EF-Tu基因的擴(kuò)增及pET-EF-Tu載體的構(gòu)建

MSEF-Tu基因經(jīng)PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物回收、雙酶切后與pET-28a(+)連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α后涂布卡那霉素抗性平板，挑取長出的單菌落菌液PCR鑒定后以BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，目的條帶約1 185 bp(圖1)，測序結(jié)果均與MS WVU1853株EF-Tu序列一致，表明pET-EF-Tu載體構(gòu)建成功。

M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. pET-EF-Tu經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切的產(chǎn)物M. DNA marker; 1. Product from pET-EF-Tu digested with BamHⅠ and XhoⅠ圖1 pET-EF-Tu雙酶切鑒定Fig.1 Identification of pET-EF-Tu by double endonucleases digestion

2.2 rMS EF-Tu的原核表達(dá)

pET-EF-Tu轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)后以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果表明，重組蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)，大小約為43 ku(圖2)；經(jīng)Western blot分析，重組蛋白rMS EF-Tu可與MS菌體抗血清發(fā)生特異性反應(yīng)，說明其具備反應(yīng)原性(圖3)。

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. IPTG誘導(dǎo)pET-28a (+) 表達(dá)菌；2. IPTG誘導(dǎo)pET-EF-Tu表達(dá)菌；3. IPTG誘導(dǎo)pET-EF-Tu表達(dá)菌上清；4. IPTG誘導(dǎo)pET-EF-Tu表達(dá)菌沉淀；5. 純化的重組蛋白rMS EF-TuM. Protein molecular weight marker; 1. Expression from pET-28a (+) after IPTG induction; 2. Expression from pET-EF-Tu after IPTG induction; 3. Supernatant of product from pET-EF-Tu after IPTG induction; 4. Sediment of product from pET-EF-Tu after IPTG induction; 5. Purified recombinant protein rMS EF-Tu圖2 原核表達(dá)pET-EF-Tu的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis about prokaryotic expression of pET-EF-Tu

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. IPTG誘導(dǎo)pET-28a (+) 表達(dá)菌；2. 純化的重組蛋白rMS EF-TuM. Protein molecular weight marker; 1. Expression from pET-28a (+) after IPTG induction; 2. Recombinant protein rMS EF-Tu圖3 Western bolt分析rMS EF-TuFig.3 Western bolt analysis of rMS EF-Tu

2.3 rMS EF-Tu多克隆抗體的制備

以純化的重組蛋白免疫新西蘭白兔，經(jīng)四次免疫，間接ELISA檢測rMS EF-Tu抗血清效價高于1∶16 000，表明重組蛋白具有免疫原性。

2.4 EF-Tu在MS細(xì)胞中的分布

將提取的MS細(xì)胞膜蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白以及菌體蛋白等體積包被酶標(biāo)板后應(yīng)用ELISA分析EF-Tu在MS的分布，同時將其等體積上樣后進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果表明，EF-Tu在MS細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)蛋白中均有分布(圖4、圖5)，免疫熒光試驗亦證實EF-Tu在MS膜表面有分布(圖6)。

圖4 ELISA檢測EF-Tu在MS細(xì)胞中的分布Fig.4 Determination of the distribution of EF-Tu in MS cell by ELISA

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. BSA；2. MS菌體蛋白；3. MS細(xì)胞膜蛋白；4. MS細(xì)胞質(zhì)蛋白；5. 純化的重組蛋白rMS EF-TuM. Protein molecular weight marker; 1. BSA; 2. Total cellular proteins of MS; 3. The membrane proteins of MS; 4. The cytosolic proteins of MS; 5. Purified recombinant protein rMS EF-Tu圖5 Western blot檢測EF-Tu在MS細(xì)胞中的分布Fig.5 Determination of the localization of EF-Tu in MS cell by Western blot

2.5 補體殺菌試驗

補體殺菌試驗中，殺菌率計算結(jié)果顯示，MS菌體抗血清補體介導(dǎo)的殺支原體率為48.4%，而rMS EF-Tu抗血清補體介導(dǎo)的殺支原體率為16.15%，表明rMS EF-Tu抗血清具有補體介導(dǎo)的殺支原體活性(表1)。

表1 rMS EF-Tu抗血清的殺菌率

A. 陰性對照(免疫前血清)；B. 陽性對照(MS菌體抗血清)；C. 試驗組(rMS EF-Tu抗血清)A. Negative control (Pre-immune serum); B. Positive control (Anti-MS serum); C. Experimental group (Anti-rMS EF-Tu serum)圖6 免疫熒光試驗驗證EF-Tu在MS細(xì)胞膜表面的分布Fig.6 Verification of the distribution of EF-Tu on MS cell membrane surface by immunofluorescence tests

2.6 黏附及黏附抑制試驗

pET-InaZN-EGFP-EF-Tu轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組蛋白約為96 ku(圖7)；免疫熒光試驗結(jié)果顯示，經(jīng)rMS EF-Tu抗血清處理的大腸桿菌能被紅色熒光標(biāo)記的二抗特異性結(jié)合(圖8)，表明MS EF-Tu成功展示在大腸桿菌膜表面，即獲得E.coli-InaZN-EGFP菌株；黏附及抑制試驗結(jié)果表明，E.coli-InaZN-EGFP-EF-Tu可有效黏附至DF-1細(xì)胞(圖9A)，E.coli-InaZN-EGFP菌株對DF-1無黏附作用(圖9B)，且E.coli-InaZN-EGFP-EF-Tu對DF-1細(xì)胞的黏附可被rMS EF-Tu抗血清或MS菌體抗血清有效抑制(圖9C、D)，表明EF-Tu是MS的一種黏附相關(guān)蛋白。

M. 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2. IPTG誘導(dǎo)pET-InaZN-EGFP、pET-InaZN-EGFP-EF-Tu表達(dá)菌M. Protein molecular weight marker; 1,2. Expression from pET-InaZN-EGFP, pET-InaZN-EGFP-EF-Tu after IPTG induction圖7 原核表達(dá)pET-InaZN-EGFP-EF-Tu的SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE analysis about prokaryotic expression of pET-InaZN-EGFP-EF-Tu

A. 通過GFP觀察的E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu；B. rMS EF-Tu抗血清和Cy3-IgG偶聯(lián)物標(biāo)記的E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu；C. E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu熒光圖像的合并；D. 通過GFP觀察的E. coli-InaZN-EGFP；E. rMS EF-Tu抗血清和Cy3-IgG偶聯(lián)物標(biāo)記的E. coli-InaZN-EGFP；F. E. coli-InaZN-EGFP熒光圖像的合并A. The E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu was observed by GFP; B. E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu labeled with anti-rMS EF-Tu serum and Cy3-IgG conjugate; C. Fluorescence images of E. coli-InaZN-EGFP were merged; D. The E.coli-InaZN-EGFP was observed by carried GFP; E. E. coli-InaZN-eGFP marked with anti-rMS EF-Tu serum and Cy3-IgG conjugate; F. Fluorescence images of E. coli-InaZN-EGFP were merged圖8 免疫熒光試驗檢測pET-InaZN-EGFP-EF-Tu在大腸桿菌膜表面的表達(dá)Fig.8 The expression of pET-InaZN-EGFP-EF-Tu displayed on the E.coli surface was detected by immunofluorescence tests

A. E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu黏附DF-1細(xì)胞；B. E. coli-InaZN-EGFP黏附DF-1細(xì)胞；C. rMS EF-Tu抗血清對E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu黏附DF-1細(xì)胞的抑制；D. MS菌體抗血清對E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu黏附DF-1細(xì)胞的抑制A. The E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu adhered to the DF-1 cells; B. The E. coli-InaZN-EGFP adhered to the DF-1 cells; C. The E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu adhered to the DF-1 cells were inhibited by anti-rMS EF-Tu serum; D. The E. coli-InaZN-EGFP-EF-Tu adhered to the DF-1 cells were inhibited by anti-MS serum圖9 表面展示MS EF-Tu的大腸桿菌對DF-1細(xì)胞的黏附及黏附抑制Fig.9 The adhesion and adhesion inhibition of MS EF-Tu displayed E. coli to DF-1 cells

3 討 論

支原體對宿主細(xì)胞的黏附是其感染宿主的先決條件[1]。研究表明，MS膜表面蛋白與其致病性和免疫應(yīng)答有關(guān)。報道最多的有膜表面可變脂蛋白血凝素(variable lipoprotein haemagglutinin，VlhA)，VlhA經(jīng)核糖體翻譯后被切割成羧基端(MSPA)和氨基端(MSPB)兩部分，其中MSPA 主要參與MS對宿主細(xì)胞的黏附，MSPB是高頻可變性抗原，重點參與MS對免疫的逃避[23-25]。而烯醇化酶(enolase，Eno)[26]，丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase，PDC)α、β亞基[20]，NADH 氧化酶(NADH oxidase，NOX)[27]，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)[19]和二硫辛酸脫氫酶(dihydrolipoamide dehydrogenase，DLD)[28]等的黏附功能和抗原性亦陸續(xù)被證實。

EF-Tu是細(xì)菌中最豐富的蛋白之一，在一些病原侵入機體后引起的宿主免疫應(yīng)答等生物過程中發(fā)揮重要作用[29]。研究發(fā)現(xiàn)，牛支原體、布魯氏菌(Brucella)、綿羊支原體(Mycoplasmaovipneumoniae，Mo)、肺炎球菌(Streptococcuspneumoniae)、葡萄球菌(Staphylococcus)等病原菌的EF-Tu可作為相關(guān)疾病預(yù)防的候選抗原和診斷靶標(biāo)[16,30-34]。本研究在MS EF-Tu基因克隆及原核表達(dá)的基礎(chǔ)上，利用Western blot和間接ELISA證實了rMS EF-Tu具有良好的免疫原性和抗原性，為MS的血清學(xué)診斷及亞單位疫苗研制提供理論依據(jù)。補體殺菌試驗證實了rMs EF-Tu抗血清的補體介導(dǎo)殺支原體活性，表明MS EF-Tu在宿主對其免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用。

EF-Tu在病原菌生物被膜形成及與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合等發(fā)揮著重要作用[35-37]。Yu等[38]發(fā)現(xiàn)rMhp EF-Tu能夠黏附于豬氣管上皮細(xì)胞(STEC)，rMhp EF-Tu 抗血清可以有效地抑制其對STEC的黏附。Ramiah等[39]在對植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的研究過程中發(fā)現(xiàn)去除EF-Tu等3個表面蛋白后，其黏附性下降了40%。本研究結(jié)果證實EF-Tu在MS胞膜和胞質(zhì)均有分布，且在MS膜表面有定位。因此，該蛋白可能參與MS對宿主的感染與免疫應(yīng)答。本研究通過黏附及抑制試驗，證實rMS EF-Tu能夠有效介導(dǎo)大腸桿菌黏附DF-1細(xì)胞，確證MS的EF-Tu是其黏附相關(guān)蛋白。

4 結(jié) 論

本研究在構(gòu)建熱不穩(wěn)定延伸因子(EF-Tu)原核表達(dá)載體pET-EF-Tu的基礎(chǔ)上，證實EF-Tu是具有免疫原性的MS膜表面相關(guān)蛋白，rMS EF-Tu產(chǎn)生的抗體具有補體介導(dǎo)的殺支原體作用，且EF-Tu可介導(dǎo)大腸桿菌黏附宿主細(xì)胞DF-1，表明其與MS感染宿主細(xì)胞和引起免疫應(yīng)答有關(guān)。這一研究結(jié)果對進(jìn)一步探究 EF-Tu在MS甚至其他支原體等胞內(nèi)寄生致病菌侵入及其致病機理的研究意義重大。