精氨酸對熱應(yīng)激處理的奶牛原代小腸上皮細胞增殖和凋亡的影響

豆夢瑩，張 才，李元曉*，邵 琦，朱佳麗，李 旺，曹志軍

(1. 河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院，洛陽 471023； 2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，北京 100193)

熱應(yīng)激是造成畜禽養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟損失的主要原因之一，而奶牛對熱尤為敏感，熱應(yīng)激是全球奶業(yè)面臨的重要挑戰(zhàn)[1-2]。熱應(yīng)激不僅會導(dǎo)致奶牛生產(chǎn)性能下降，而且還會引起奶牛機體免疫機能下降和繁殖功能障礙等[3-4]。當發(fā)生熱應(yīng)激時，機體會啟動散熱機制，流經(jīng)腸道的血流量減少，導(dǎo)致腸道缺血、缺氧，營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，造成腸上皮細胞損傷且增殖受到影響，使腸道黏膜屏障通透性增加，機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)甚至死亡[5-7]?？梢?，腸道損傷是熱應(yīng)激奶牛的重要病理變化。腸道不僅是奶牛營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的器官，也是在奶牛免疫防御的重要屏障，改善熱應(yīng)激狀態(tài)下奶牛的腸道健康對奶牛的健康和生產(chǎn)性能具有重要的意義。利用營養(yǎng)調(diào)控來緩解或修復(fù)腸道損傷已成為研究者關(guān)注的熱點，其中，氨基酸營養(yǎng)(如谷氨酸、色氨酸等)緩解動物腸道損傷的研究也多有報道[8-9]。

精氨酸是一種條件性必需氨基酸，也是動物機體細胞內(nèi)功能最多的氨基酸，不僅是合成蛋白質(zhì)的原料以及多種生物活性物質(zhì)(如一氧化氮、多胺、肌酸等)的前體物質(zhì)，而且還具有抗炎、抗氧化、促進腸道功能發(fā)育等生理功能[10-13]。在微生物改變、熱應(yīng)激、膿毒血癥等應(yīng)激或疾病狀態(tài)下[14-16]，動物機體對精氨酸的營養(yǎng)需求量還會增加。研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸恢復(fù)細胞正常生長的作用是其他氨基酸不可替代的[17]。通過體外模型研究精氨酸對腸道上皮細胞熱應(yīng)激損傷的保護作用和機制，對生產(chǎn)實踐中合理使用精氨酸以減少熱應(yīng)激造成的損失具有重要的意義。而體外培養(yǎng)小腸上皮細胞熱應(yīng)激模型在鼠、豬、雞、山羊的熱應(yīng)激研究中得到了廣泛應(yīng)用[18-21]。因此，本研究在建立奶牛原代小腸上皮細胞熱應(yīng)激損傷模型的基礎(chǔ)上，通過觀察細胞形態(tài)、檢測細胞增殖以及線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡通路中關(guān)鍵基因Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9(cysteinyl aspartate specific proteinase-9，Caspase-9)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)mRNA和蛋白的表達，探究精氨酸對熱應(yīng)激奶牛腸道上皮細胞損傷修復(fù)效果，以期為精氨酸修復(fù)奶牛腸道屏障損傷提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

精氨酸(L-Arginine，純度>99%)購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司，DMEM培養(yǎng)基、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚鹽酸核苷酸染料(DAPI)以及Ⅰ型膠原酶購自Gibco公司。胎牛血清(FBS)購自德國PAN-Biotech GmbH。磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、青霉素與鏈霉素混合液(100×)以及Cell Counting Kit(CCK-8)活力檢測試劑盒購自Solarbio公司。乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(型號A020-2-2)購自南京建成生物工程研究所。牛Bax、Bcl-2、Caspase-3以及Caspase-9檢測試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司。PrimeScriptTMRT reagent kit(反轉(zhuǎn)錄試劑盒)以及SYBR?Fast qPCR Mix(熒光定量試劑盒)購自TaKaRa公司。細胞培養(yǎng)箱(德國Thermo公司)，Scientific Multiskan FC型酶標儀及超微量核酸蛋白濃度測定儀(美國Thermo公司)，Axio Observer A1倒置熒光顯微鏡(德國蔡司公司)，CFX96熒光定量PCR儀(Bio-RAD公司)，流式細胞儀CytoFLEXS(美國貝克曼公司)。

1.2 奶牛原代小腸上皮細胞分離培養(yǎng)

將1日齡荷斯坦犢牛安樂死后，剪取15 cm長的十二指腸放到預(yù)冷的含4%雙抗的生理鹽水中，盡快轉(zhuǎn)移至實驗室。采用膠原酶消化法獲取奶牛小腸上皮細胞[22]。根據(jù)成纖維細胞和上皮細胞貼壁時間不同[20]，將細胞懸液接種到培養(yǎng)瓶培養(yǎng)1 h后，將細胞上清液吸出，接種到新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，以上步驟重復(fù)3次，此時小腸上皮細胞純度可達90%左右。將分離得到的小腸上皮細胞于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換1次液，細胞鋪滿90%時進行傳代培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化第2代奶牛小腸上皮細胞，細胞出現(xiàn)皺縮變圓時加培養(yǎng)基終止消化，離心后加培養(yǎng)基重懸細胞并將細胞吹打均勻，取少量細胞懸液用細胞計數(shù)板計數(shù)，并計算細胞懸液的總細胞數(shù)，加培養(yǎng)基稀釋細胞懸液，調(diào)整細胞密度，接種于96孔板(1×105個·mL-1)或6孔板(1×106個·mL-1)，用于后續(xù)試驗。試驗用的是第3代奶牛小腸上皮細胞。

1.3 試驗分組和處理

1.3.1 精氨酸添加濃度的篩選 將奶牛小腸上皮細胞分為空白對照組(Con組)和試驗組，試驗組包括熱應(yīng)激組(HS組)和不同濃度精氨酸組(L-Arg組)，每組6個重復(fù)。處理過程如下：1)對照組、試驗組均用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，Con組于37 ℃、試驗組于42 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h[9,23]。2)棄去培養(yǎng)基用PBS洗兩次，Con組、HS組繼續(xù)用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，L-Arg組更換成不同濃度(2、4、6、8、10 mmol·L-1) 的精氨酸培養(yǎng)基培養(yǎng)，所有處理組均于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后檢測細胞活力，篩選出最佳的精氨酸添加濃度，用于后續(xù)試驗。

1.3.2 精氨酸對熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細胞增殖和凋亡的影響 將奶牛小腸上皮細胞分為對照組(Con組)、熱應(yīng)激組(HS組)和6 mmol·L-1精氨酸組(6 mmol·L-1L-Arg組)，每組6個重復(fù)。處理過程如下：1)3組細胞均用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，Con組于37 ℃、HS組和6 mmol·L-1L-Arg組于42 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。2)棄去培養(yǎng)基用PBS洗兩次，Con組、HS組繼續(xù)用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，6 mmol·L-1L-Arg組更換成6 mmol·L-1精氨酸培養(yǎng)基培養(yǎng)，3個處理組均于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后收集培養(yǎng)上清和細胞。

1.4 CCK-8檢測細胞活力

按照“1.3.1”試驗步驟對奶牛小腸上皮細胞進行培養(yǎng)和處理后，棄去培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗1遍，每孔加入100 μL不含血清的培養(yǎng)基和10 μL的CCK-8試劑在37 ℃中孵育2 h，用酶標儀450 nm測OD值以計算細胞活力。選擇細胞活力最高的精氨酸濃度作為后續(xù)試驗的濃度。

1.5 DAPI染色觀察細胞的核形態(tài)變化

按照“1.3.2”試驗步驟對奶牛小腸上皮細胞進行培養(yǎng)和處理后，棄去培養(yǎng)基，每孔加100 μL 4%多聚甲醛固定20 min；棄甲醛，每孔加200 μL PBS液清洗兩次；每孔加DAPI溶液(10 μg·mL-1)，避光作用20 min；用PBS溶液清洗兩次，置于倒置熒光顯微鏡下在相同熒光強度和曝光時間下采集圖像信息，激發(fā)光波長為345 nm，發(fā)射光強度為455 nm。

1.6 微板法檢測乳酸脫氫酶(LDH)含量

按照“1.3.2”試驗步驟對奶牛小腸上皮細胞進行培養(yǎng)和處理后，收集細胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說明書步驟進行測定。

1.7 流式細胞儀檢測細胞周期

按照“1.3.2”試驗步驟對奶牛小腸上皮細胞進行培養(yǎng)和處理后，用預(yù)冷PBS清洗細胞2次，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化細胞，預(yù)冷的PBS洗滌細胞，加入-20 ℃預(yù)冷的75%乙醇固定細胞，4 ℃放置24 h。用冷PBS清洗細胞，2 500×g離心5 min，加入2 μL濃度為1 mg·mL-1的RNase去除RNA。加入100 μL PI染色液，避光染色20 min。用流式細胞儀進行上機檢測，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長585 nm。用Modfit軟件分析細胞周期以確定細胞周期分布。

1.8 RT-PCR檢測基因表達

用PBS清洗細胞兩遍，用TRIzol提取總RNA，超微量核酸蛋白濃度測定儀檢測其濃度和純度，OD260 nm/OD280 nm=1.9～2.0 表示RNA純度較高；用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 于-20 ℃冰箱保存。根據(jù)NCBI公布的牛的目的基因CyclinE1、CyclinB、CyclinG1、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9和內(nèi)參基因GAPDH的mRNA序列，使用Premier 5.0設(shè)計特異性引物，委托生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL:2×SYBR Green Mix 10 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA 2 μL，RNase Free ddH2O 4 μL。每個處理組6個重復(fù)。采用2-△△Ct法計算各組基因的mRNA相對表達量。

1.9 ELISA檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白含量

按照“1.3”試驗步驟對奶牛小腸上皮細胞進行培養(yǎng)和處理后，用預(yù)冷PBS清洗細胞2次，用細胞刮板將細胞從6孔板底部刮下，置于1.5 mL的EP管中。用細胞破碎儀破碎，得到待測樣本。按照試劑盒說明書分別檢測細胞內(nèi)Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的蛋白含量。

1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗原始數(shù)據(jù)先用EXCEL進行整理，然后利用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行組間單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法進行多重比較，P<0.05表示統(tǒng)計學(xué)檢驗差異顯著。結(jié)果用“平均值±標準差”表示。

2 結(jié) 果

2.1 精氨酸對熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細胞活力的影響

如圖1所示，與Con組相比，HS組細胞活力顯著降低(P<0.05)；與HS組相比，精氨酸濃度為2、4 mmol·L-1時，細胞活力差異不顯著(P>0.05)；精氨酸濃度為6 mmol·L-1時，細胞活力顯著高于HS組(P<0.05)，且低于Con組(P<0.05)；精氨酸濃度為10 mmol·L-1時，細胞活力受到抑制(P<0.05)。

2.2 精氨酸對熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細胞生長形態(tài)的影響

如圖2(Ⅰ)和(Ⅱ)所示，與Con組相比，HS組染色質(zhì)濃縮、細胞的核形態(tài)不規(guī)則變化。與HS組相比，6 mmol·L-1L-Arg組染色濃縮、細胞的核形態(tài)不規(guī)則變化減少。

2.3 精氨酸對細胞上清液中乳酸脫氫酶(LDH)含量的影響

由圖2G可知，與Con組相比，HS組上清液中LDH 的含量顯著升高(P<0.05)。與HS 組相比，6 mmol·L-1L-Arg組上清液LDH的含量顯著降低(P<0.05)，與Con組相比差異不顯著(P>0.05)。

表1 引物序列

數(shù)據(jù)柱標含有相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同Value columns with the same small letter mean no significant difference (P>0.05)，while with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below圖1 精氨酸對熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細胞活力的影響Fig.1 Effect of L-Arg on the activity of bovine intestinal epithelial cells challenged by heat stress

2.4 精氨酸對熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細胞周期細胞比率的影響

由圖3和表2可知，與Con組相比，HS組G1期細胞比率升高(P<0.05)，S期細胞比率顯著降低(P<0.05)，G2期細胞比率無顯著差異(P>0.05)；6 mmol·L-1L-Arg組G1期和G2期細胞比率顯著低于Con組和HS組(P<0.05)，S期細胞比率顯著高于Con組和HS組(P<0.05)。

2.5 精氨酸對熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細胞調(diào)控細胞周期相關(guān)因子mRNA相對表達量的影響

如圖4所示，HS組和6 mmol·L-1L-Arg組CyclinE1的mRNA相對表達量差異不顯著(P>0.05)，均顯著高于Con組(P<0.05)。與HS組相比，6 mmol·L-1L-Arg組的CyclinB和CyclinG1的mRNA相對表達量均顯著高于HS組(P<0.05)。 與Con組相比，HS組CyclinB和CyclinG1的mRNA相對表達量均差異不顯著(P>0.05)。

2.6 精氨酸對熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細胞凋亡相關(guān)因子mRNA相對表達量的影響

由圖5可得，HS組Bax、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2 mRNA相對表達量以及Bax/Bcl-2比值均顯著高于Con組(P<0.05)。與HS組相比，6 mmol·L-1L-Arg組Bax、Caspase-3、Caspase-9 mRNA相對表達量以及Bax/Bcl-2比值顯著降低(P<0.05)，而Bcl-2的mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)。

(I).明場圖，(Ⅱ).DAPI染色圖；其中，A、D為對照組；B、E為熱應(yīng)激組；C、F為6 mmol·L-1精氨酸組；紅色箭頭指的是染色質(zhì)濃縮、細胞核形態(tài)不規(guī)則；G.是細胞上清液中乳酸脫氫酶的含量(I) Bright field figure, (Ⅱ) DAPI staining diagram. A, D. Control group; B, E. Heat stress group; C, F. 6 mmol·L-1 L-Arg group. The red arrows refer to chromatin condensation and irregular nuclear morphology. G. The content of lactate dehydrogenase in the supernatant of cells圖2 精氨酸對熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細胞形態(tài)及乳酸脫氫酶含量的影響Fig.2 Effects of L-Arg on morphology and lactate dehydrogenase content of intestinal epithelial cells challenged by heat stress

圖3 各組細胞周期檢測Fig.3 Detection of cell cycle in each group

表2 精氨酸對小腸上皮細胞各期細胞比率的影響

圖4 精氨酸對小腸上皮細胞調(diào)控細胞周期相關(guān)基因表達水平的影響Fig.4 The effect of L-Arg on the expression of cell cycle regulation-related genes in intestinal epithelial cells

圖5 精氨酸對小腸上皮細胞凋亡相關(guān)基因表達水平的影響Fig.5 Effect of L-Arg on the expression of apoptotic-related genes in intestinal epithelial cells

2.7 精氨酸對熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細胞凋亡蛋白含量的影響

由圖6可知，與Con組相比，HS組的Bax、Caspase-3、Caspase-9的蛋白含量以及Bax/Bcl-2比值顯著升高(P<0.05)，HS組Bcl-2蛋白含量顯著降低(P<0.05)。6 mmol·L-1L-Arg組Bax、Caspase-3、Caspase-9的蛋白含量及Bax/Bcl-2比值顯著低于HS組(P<0.05)，而Bcl-2蛋白含量顯著高于HS組(P<0.05)；與Con組相比，6 mmol·L-1L-Arg 組Bax蛋白含量顯著升高(P<0.05)，而Caspase-3、Caspase-9蛋白含量及Bax/Bcl-2比值差異不顯著(P>0.05)，Bcl-2蛋白含量顯著降低(P<0.05)。

圖6 精氨酸對小腸上皮細胞凋亡相關(guān)蛋白表達水平的影響Fig.6 Effect of L-Arg on the expression of apoptotic-related proteins in intestinal epithelial cells

3 討 論

熱應(yīng)激會導(dǎo)致腸上皮細胞凋亡，造成腸道黏膜屏障損傷[24]。預(yù)防或緩解腸道上皮損傷是解決奶牛熱應(yīng)激的有效策略。研究表明，功能性氨基酸精氨酸在胃腸道的生長、發(fā)育、成熟、修復(fù)等方面具有重要的調(diào)節(jié)作用[25]。本試驗結(jié)果顯示，在2～10 mmol·L-1范圍內(nèi)，精氨酸濃度為6 mmol·L-1時，細胞活力達到最高值；精氨酸濃度低于6 mmol·L-1，細胞活力隨著濃度的增加而增加；精氨酸濃度高于6 mmol·L-1時，細胞活力逐漸降低，這可能是過量的精氨酸會對細胞產(chǎn)生毒性[26]。細胞周期是細胞功能的基本過程，分為G1期、S期(DNA合成)、G2期以及M期(有絲分裂)[27]，細胞周期對進一步研究細胞活力是非常重要的。熱應(yīng)激會使細胞阻滯在G0/G1期[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，添加6 mmol·L-1精氨酸后，G1期的細胞比率顯著低于熱應(yīng)激組，且6 mmol·L-1精氨酸組S期的細胞比率顯著高于熱應(yīng)激組和對照組，表明精氨酸可以緩解熱應(yīng)激造成的細胞周期阻滯，促進細胞的增殖，這與前人的研究結(jié)果相符[27,29]。整個細胞周期進程有多種細胞周期特異性蛋白(Cyclins)和蛋白依賴性蛋白激酶家族(CDKs)驅(qū)動，如G1期到S期主要由CyclinD與CDK4/6的復(fù)合物和CyclinE與CDK2的復(fù)合物驅(qū)動，G2期到M期主要由CyclinB與CDK1的復(fù)合物驅(qū)動[29]。本研究中，熱應(yīng)激組S期的細胞比率顯著低于對照組和精氨酸組，但是CyclinE1基因的表達量要高于對照組，而與精氨酸組相比差異不顯著。這可能是熱應(yīng)激組CyclinE1基因在表達翻譯的過程受到了干擾。精氨酸組的CyclinE1和CyclinB基因的相對表達量均高于熱應(yīng)激組，表明精氨酸通過調(diào)節(jié)細胞周期促進了熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細胞的增殖。CyclinG1是新發(fā)現(xiàn)的細胞周期蛋白G家族的重要成員，其對細胞的進程的調(diào)控具有正、負調(diào)節(jié)作用，這可能與CyclinG1作用的細胞和組織不同及其表達水平有關(guān)。有研究顯示，CyclinG1對小鼠子宮細胞增殖產(chǎn)生負面影響[30-31]。柳朝華[32]在研究CyclinG1在小鼠卵巢的表達及其與卵泡發(fā)育和卵母細胞成熟的關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)CyclinG1可能作為細胞周期的正調(diào)節(jié)因子參與了卵泡生長發(fā)育和卵母細胞成熟過程的調(diào)控。Yue等[30]發(fā)現(xiàn)，CyclinG1呈孕激素依賴性表達，參與孕激素對子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞的促增殖作用。本研究中，精氨酸組的CyclinG1基因的相對表達量顯著升高，結(jié)合前面的研究結(jié)果，CyclinG1可能正向調(diào)控了熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細胞的增殖。乳酸脫氫酶(LDH)是一種穩(wěn)定的細胞質(zhì)酶。當細胞膜受損時，LDH會迅速釋放到細胞培養(yǎng)上清中，是細胞發(fā)生損傷的一種重要特征[33]。精氨酸可以促進細胞損傷修復(fù)。Zhang等[34]研究報道，培養(yǎng)基中添加100 μmol·L-1精氨酸能顯著降低脂多糖誘導(dǎo)的綿羊腸上皮細胞LDH的釋放量。梁鑫[35]研究發(fā)現(xiàn)，25 mmol·L-1精氨酸顯著降低了100、300 μg·mL-1丙稀晴染毒大鼠心肌細胞培養(yǎng)上清液LDH的活性。本試驗中，6 mmol·L-1精氨酸組的LDH含量顯著低于熱應(yīng)激組，細胞損傷減少。無論是誘導(dǎo)損傷還是染毒損傷，添加精氨酸可以減少細胞損傷，其添加濃度和損傷程度、作用的靶器官以及物種等的不同均有關(guān)系。這表明不同的動物品種、生長階段、損傷誘因等的精氨酸添加量是不同的，需要在明確其作用機制的前提下，探索精氨酸在生產(chǎn)實踐中的合理應(yīng)用。

凋亡指機體細胞在生長發(fā)育過程中或在一定條件下，通過細胞內(nèi)外因素調(diào)控下而發(fā)生的一種程序性細胞死亡，其特征在于特定的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)變化，在早期屬于可逆過程[19,36]。研究發(fā)現(xiàn)，添加精氨酸可以減少鼠肝缺血再灌注損傷出現(xiàn)的染色質(zhì)濃縮的凋亡細胞[37]。本試驗也發(fā)現(xiàn)，精氨酸組染色質(zhì)濃縮細胞數(shù)要低于熱應(yīng)激組(圖2)，減少了凋亡的發(fā)生。細胞凋亡主要包括兩種途徑：外源性(死亡受體介導(dǎo))和內(nèi)源性(線粒體介導(dǎo))凋亡傳導(dǎo)通路[38]?；魫廴A等[39]研究發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激可導(dǎo)致線粒體凋亡通路的激活。Bcl-2家族的Bax以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族的Caspase-9、Caspase-3在線粒體介導(dǎo)的凋亡通路中起著關(guān)鍵的起始調(diào)控和執(zhí)行作用。黃琳[40]研究表明，精氨酸降低了飼喂氧化魚油仔豬腸道Caspase-3的活性，緩解了仔豬腸道的氧化損傷。王萬鐵等[41]研究報道，精氨酸降低了兔肺缺血-再灌注損傷的肺細胞Bax基因表達，提高了Bcl-2基因的表達，有效地減輕了缺血再灌注損傷。而在晏利瓊等[42]的研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸對熱應(yīng)激肉雞空腸Caspase-3及Bcl-2 mRNA的表達量均無影響。這可能與精氨酸添加量、動物個體差異以及試驗設(shè)計不同有關(guān)。本試驗結(jié)果顯示，小腸上皮細胞經(jīng)過熱應(yīng)激處理后，促凋亡因子Bax、Caspase-3、Caspase-9的相對表達水平和蛋白的含量顯著升高。雖然熱應(yīng)激組Bcl-2基因表達量升高，但Bcl-2蛋白含量是降低，蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，且Bax/Bcl-2的基因比值是顯著升高的，說明熱應(yīng)激導(dǎo)致細胞的凋亡增多[43-44]。通過添加精氨酸進行修復(fù)處理，促凋亡因子Bax、Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白表達量顯著降低，抗凋亡因子Bcl-2 mRNA和蛋白表達量顯著升高。這表明精氨酸可能通過影響細胞內(nèi)Bax和Bcl-2的表達，抑制了線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進Caspase-3酶解級聯(lián)反應(yīng)，減少了細胞的凋亡?？梢?，精氨酸緩解了熱應(yīng)激對奶牛小腸上皮細胞的凋亡損傷，這為精氨酸應(yīng)用于預(yù)防或緩解奶牛熱應(yīng)激提供了體外試驗理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究表明，精氨酸對體外培養(yǎng)的熱應(yīng)激奶牛小腸上皮細胞的活力具有低濃度促進、高濃度抑制的作用效果。其中，添加6 mmol·L-1精氨酸的細胞活力最高，顯著改善細胞在G1期的阻滯；同時，6 mmol·L-1精氨酸可調(diào)控?zé)釕?yīng)激奶牛小腸上皮細胞與細胞凋亡相關(guān)因子的mRNA和蛋白水平的表達，顯著降低熱應(yīng)激導(dǎo)致的小腸上皮細胞凋亡損傷。