犏牛PPP1R11基因的克隆及在睪丸中的表達(dá)規(guī)律研究

閔星宇，楊麗雪，于海玲，胡宇磊，楊滿珍，楊璐瑜，李 鍵,2，熊顯榮,

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041； 2.青藏高原動(dòng)物遺傳育種資源保護(hù)與利用國家教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041； 3.動(dòng)物科學(xué)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

犏牛為母牦牛(Bosgrunniens)與平原牛(Bostaurus)雜交得到的F1代，主要分布于我國青藏高原地區(qū)的優(yōu)良家畜資源。牦牛生產(chǎn)性能低下，已無法滿足青藏高原地區(qū)日益增長的奶肉需求，而平原牛又無法適應(yīng)高原惡劣的高寒低氧環(huán)境。犏牛具有顯著的雜種優(yōu)勢(shì)，產(chǎn)奶性能和產(chǎn)肉性能均優(yōu)于牦牛，并有良好的高原適應(yīng)性[1-3]。然而，雄性犏牛精子發(fā)生阻滯，使得無法通過橫交固定其雜種優(yōu)勢(shì)，這嚴(yán)重制約了雜種優(yōu)勢(shì)的利用[4-5]。因此，開展犏牛繁殖生理的研究對(duì)提高青藏高原畜牧生產(chǎn)水平、改善牧民生活品質(zhì)和發(fā)展青藏高原特色畜牧產(chǎn)業(yè)都具有重要的價(jià)值。

絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶1(serine/threonine protein phosphatase，PP1)是一種去磷酸化酶，能夠通過翻譯后調(diào)控參與多種生物學(xué)過程[6-7]。在哺乳動(dòng)物中共發(fā)現(xiàn)4種亞型，包括PP1α、PP1β、PP1γ1和PP1γ2，其中PP1γ2蛋白由蛋白磷酸酶1催化亞基γ(protein phosphatase 1 catalytic subunit gamma, PPP1CC)基因編碼，主要富集于睪丸組織并參與精子細(xì)胞發(fā)生和成熟[8-9]，敲除PPP1CC基因造成雄性不育[10-11]。蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基11(protein phosphatase 1 regulatory subunit 11，PPP1R11)最早通過酵母雙雜交試驗(yàn)鑒定到是PP1的結(jié)合蛋白，又被稱作INH3、TCTEX5、HCGV、IPP3，能夠抑制PP1γ2的去磷酸化作用[12-13]。前期研究表明，PPP1R11基因是t-complex的重要組成部分，而t-complex 與精子活力受損和雄性不育有關(guān)[14]。Northern印跡雜交和免疫組織熒光染色顯示，PPP1R11 mRNA和蛋白主要分布在小鼠睪丸組織中，其表達(dá)水平顯著高于其他組織，在雄性不育小鼠中檢測(cè)到PPP1R11基因的下調(diào)，推測(cè)該基因的下調(diào)導(dǎo)致生殖細(xì)胞的凋亡[13,15]。可見，PPP1R11基因在調(diào)控雄性配子發(fā)生和精子成熟中有重要作用。

目前，關(guān)于PPP1R11基因的研究主要集中在小鼠上，而在雄性不育犏牛上的研究還尚未報(bào)道。本研究以犏牛為研究對(duì)象，利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得犏牛PPP1R11編碼區(qū)完整序列，并對(duì)該序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)采用qRT-PCR和IHC染色檢測(cè)該基因和蛋白在犏牛各組織及各發(fā)育階段睪丸組織中的表達(dá)，以期為研究PPP1R11調(diào)控精子發(fā)生機(jī)制提供參考，為進(jìn)一步從分子水平解析雄性犏牛不育機(jī)制奠定基礎(chǔ)并提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與樣品采集

將胎牛時(shí)期(5～6月齡)、幼年時(shí)期(1～2歲)、成年時(shí)期(3～4歲)犏牛作為本研究試驗(yàn)對(duì)象，樣品采自成都市周邊屠宰場(chǎng)。健康的犏牛屠宰后迅速采集睪丸、附睪、心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、胃、肌肉和脂肪。以上所有樣品每組各取3頭為生物學(xué)重復(fù)，樣品使用高壓滅菌處理的生理鹽水沖洗剪成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的組織塊，一部分放入凍存管，置于液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃保存；另一部分使用4%多聚甲醛固定，用于IHC染色檢測(cè)。

1.2 犏牛和牦牛組織總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

冷凍的犏牛和牦牛各組織使用高通量組織研磨器研磨后，按照Trizol法，經(jīng)離心、沉淀、清洗和溶解等步驟進(jìn)行總RNA的提取，使用紫外分光光度計(jì)(Biospec-nano，日本)檢測(cè)總RNA的濃度和純度，選取OD260 nm/OD280 nm介于1.8～2.0的RNA，并經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo scientific，美國)說明書合成第一鏈cDNA，置于-20 ℃保存。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與基因克隆

從NCBI數(shù)據(jù)庫中選取野牦牛(Bosmutus)PPP1R11基因預(yù)測(cè)序列(登錄號(hào)：XM_014483599.1)和β-actin基因序列(登錄號(hào)：DQ838049.1)，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，并送至南京金斯瑞公司進(jìn)行合成。以犏牛睪丸組織cDNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)在PCR儀(Applied Biosystems，美國)擴(kuò)增犏牛PPP1R11基因CDS區(qū)序列，PCR擴(kuò)增體系為25 μL：12.5 μL 2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)，1 μL cDNA模板，1 μL上、下游引物，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s， 72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃徹底延伸5 min，4 ℃保存。使用濃度為1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后，在紫外光下切割回收目的產(chǎn)物進(jìn)行純化，交由上海生工生物工程股份有限公司(成都)測(cè)序。

1.4 PPP1R11基因的生物信息學(xué)分析

利用ORF Finder查找犏牛PPP1R11克隆序列開放閱讀框并翻譯成氨基酸序列。采用T-COFFEE在線軟件并結(jié)合DNAMAN 9.0軟件對(duì)不同物種PPP1R11的氨基酸序列同源性進(jìn)行比較，通過MEME在線工具分析查找具有高度保守性的基序，并用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。利用ExPASy ProtParam、TMHMM、PSORTⅡ和SignalP在線軟件進(jìn)行犏牛PPP1R11蛋白基本理化性質(zhì)、跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位和信號(hào)肽分析。糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)使用NetPhos 3.1、NetOGlyc 4.0和NetNGlyc 1.0軟件在線分析。該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和互作蛋白通過SOPMA、VMD 1.9.3和STRING 11.0預(yù)測(cè)。

1.5 犏牛PPP1R11基因的表達(dá)分析

以β-actin為內(nèi)參基因，使用Bio-Rad實(shí)時(shí)熒光定量儀(美國)檢測(cè)PPP1R11 mRNA在犏牛各組織(睪丸、附睪、心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、胃、肌肉、脂肪)中的表達(dá)量并進(jìn)行表達(dá)譜分析，及其在不同年齡組犏牛睪丸組織中的表達(dá)量。qRT-PCR反應(yīng)體系如下：2×NovaStart SYBR qPCR Super Mix plus 10 μL，cDNA 1 μL,上、下游引物各0.5 μL，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。PCR擴(kuò)增條件如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線為65～95 ℃每10 s增加0.5 ℃。

1.6 免疫組織化學(xué)染色

將不同時(shí)期睪丸組織從固定液中取出，制作石蠟切片。切片經(jīng)二苯甲中脫蠟，酒精洗滌，EDTA抗原修復(fù)，PBS洗滌后，放入3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；5%胎牛血清室溫封閉30 min，滴加一抗(多克隆兔抗PPP1R11，1∶200稀釋，博奧森)后4 ℃孵育過夜，陰性對(duì)照不加一抗；滴加二抗(多聚化山羊抗兔IgG，辣根過氧化物酶標(biāo)記)，室溫孵育50 min；滴加DAB顯色液顯色，自來水沖洗切片終止顯色；蘇木精復(fù)染3 min左右，復(fù)染細(xì)胞核；中性樹膠封片。使用激光共聚焦顯微鏡(Zeiss，德國)觀察并拍照。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用2-ΔΔCt法分析qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果使用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± SEM)”表示。使用SPSS 19.0軟件的T-test檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05代表差異顯著，P<0.01代表差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 犏牛PPP1R11基因克隆及生物信息學(xué)分析

2.1.1 犏牛PPP1R11克隆 以犏牛睪丸組織cDNA為模板，F(xiàn)1、R1為上、下游引物，PCR擴(kuò)增犏牛PPP1R11基因編碼區(qū)序列，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，目標(biāo)條帶與預(yù)期結(jié)果相符(圖1A)。經(jīng)測(cè)序得到893 bp的核苷酸序列，其中犏牛PPP1R11基因CDS為324 bp，共編碼107個(gè)氨基酸(圖1B)。

2.1.2 犏牛PPP1R11同源性比較與系統(tǒng)進(jìn)化樹 對(duì)不同哺乳動(dòng)物PPP1R11的氨基酸序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，PPP1R11在不同哺乳動(dòng)物中高度保守，其中犏牛與牦牛和黃牛同源性最高(100%)，其次為瘤牛(99.07%)、水牛(99.07%)、綿羊(99.07%)、山羊(99.07%)、羊駝(98.06%)、豬(97.09%)、馬(97.09%)、大狐蝠(96.12%)、藍(lán)鯨(95.28%)、港海豹(95.24%)、智人(95.15%)，與鴨嘴獸的同源性最低(84.88%)(圖2A)。通過MEME軟件在線分析獲得PPP1R11蛋白最保守的2個(gè)基序(圖2B)，分別位于犏牛PPP1R11氨基酸序列N端第6～55和58～107位點(diǎn)?；?5種哺乳動(dòng)物PPP1R11不同氨基酸序列，采用鄰接算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)，發(fā)現(xiàn)犏牛和黃牛聚為一支，在進(jìn)化上與牦牛、瘤牛、水牛、綿羊和山羊親緣關(guān)系較近，與非反芻類動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這與同源性比較結(jié)果一致。

2.1.3 犏牛PPP1R11理化性質(zhì) 犏牛PPP1R11蛋白的分子量、理論等電點(diǎn)和分子式分別為12.014 ku、8.33和C503H803N163O164S8；氨基酸組成中，脯氨酸(Pro)占比最高，其含量為13.1%；帶負(fù)電荷(Asp + Glu)和帶正電荷(Arg + Lys)的氨基酸殘基總數(shù)分別16和18個(gè)，表明該蛋白可能帶正電。糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)表明，犏牛PPP1R11蛋白含1個(gè) N糖基化位點(diǎn)和18個(gè)O糖基化位點(diǎn)；磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，該蛋白有19個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)11個(gè)，蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)7個(gè)，酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)1個(gè)。該蛋白亞細(xì)胞定位主要存在于細(xì)胞核(47.8%)，其次為線粒體(34.8%)和細(xì)胞質(zhì)(17.4%)；不含信號(hào)肽且無跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.1.4 犏牛PPP1R11結(jié)構(gòu)與互作蛋白預(yù)測(cè) 采用SOPMA預(yù)測(cè)PPP1R11蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中18個(gè)氨基酸(16.82%)形成α螺旋，16個(gè)氨基酸(14.95%)形成延伸鏈，9個(gè)氨基酸(8.41%)形成β轉(zhuǎn)角，64個(gè)氨基酸(59.81%)形成無規(guī)則卷曲(圖4A)；通過VMD 1.9.3預(yù)測(cè)到犏牛PPP1R11蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖4B)。采用STRING數(shù)據(jù)庫分析犏牛PPP1R11潛在相互作用蛋白顯示，PPP1R11可能與PPP1R2、PPP1R7、PPP1CA、PPP1CB、PPP1CC、PPA2、CIRH1A和UTP20等10個(gè)蛋白存在相互作用(圖4C)。PPP1R11蛋白處于互作網(wǎng)絡(luò)核心位置，且與PPP1R7、PPP1CB、PPP1R2、UTP20蛋白間的相互作用具有更高可信度。

A: M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000; 1. 犏牛PPP1R11基因擴(kuò)增產(chǎn)物；B.犏牛PPP1R11基因核苷酸及其推測(cè)的氨基酸序列A: M. DL2000 marker; 1.PCR product of cattle-yak PPP1R11 gene；B. Nucleotide sequence and the deduced amino acid sequence of cattle-yak PPP1R11圖1 犏牛PPP1R11基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of cattle-yak PPP1R11 gene

2.2 犏牛PPP1R11基因的表達(dá)模式

2.2.1 犏牛PPP1R11組織表達(dá)譜 以β-actin作為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)PPP1R11 mRNA在犏牛睪丸、附睪、心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、胃、肌肉和脂肪組織中的表達(dá)量(圖5)。結(jié)果顯示，該基因在犏牛12個(gè)組織中均有表達(dá)，在睪丸、脾和胃組織中表達(dá)量較高，其在睪丸中的表達(dá)水平極顯著高于其它各個(gè)組織(P<0.01)。

2.2.2 犏牛睪丸中PPP1R11的表達(dá)規(guī)律 采用qRT-PCR檢測(cè)PPP1R11 mRNA在犏牛不同發(fā)育時(shí)期睪丸組織中的相對(duì)表達(dá)水平(圖6)。結(jié)果顯示，該基因在犏牛睪丸組織中的表達(dá)隨年齡的增加呈上升趨勢(shì)；5～6月齡胎牛睪丸組織中幾乎不表達(dá)，表達(dá)量低于同齡的牦牛，但差異不顯著(P>0.05)；1～2歲和3～4歲犏牛睪丸中的表達(dá)水平極顯著低于同時(shí)期牦牛(P<0.01)。

2.2.3 犏牛PPP1R11的細(xì)胞定位 基于犏牛和牦牛PPP1R11 mRNA在睪丸中的表達(dá)差異極顯著，本試驗(yàn)進(jìn)一步通過免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)PPP1R11蛋白在犏牛和牦牛不同年齡段睪丸組織中的細(xì)胞定位和表達(dá)情況(圖7)。結(jié)果顯示，犏牛和牦牛5～6月齡胎牛睪丸組織生精小管形態(tài)無明顯差異；1～2歲和3～4歲犏牛與牦牛睪丸組織中，犏牛生精小管管徑縮小，空腔增大，生精上皮皺縮，細(xì)胞組成差異顯著，僅有精原細(xì)胞、支持細(xì)胞和少量初級(jí)精母細(xì)胞(PS)松散分布，無次級(jí)精母細(xì)胞(SS)和精子細(xì)胞。IHC染色發(fā)現(xiàn)，PPP1R11蛋白在犏牛和牦牛各年齡段睪丸組織中均有表達(dá)。其中5～6月齡 犏胎牛睪丸組織中，PPP1R11蛋白主要定位于精原干細(xì)胞(SSC)，支持細(xì)胞(SC)幾乎不表達(dá)，與同時(shí)期牦牛具有相同的蛋白定位；1～2歲和3～4歲 犏牛睪丸組織中，PPP1R11蛋白主要定位于初級(jí)精母細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞(IC)，精原細(xì)胞和支持細(xì)胞中蛋白陽性信號(hào)較弱，而牦牛各級(jí)生殖細(xì)胞、支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中均檢測(cè)到PPP1R11陽性信號(hào)。

A. 15種不同哺乳動(dòng)物PPP1R11氨基酸序列的多重比較；B. PPP1R11氨基酸序列中2個(gè)最保守基序A. Multiple alignment of PPP1R11 amino acid sequences from 15 different mammalian species; B. Two of most conserved motifs in PPP1R11 amino acid sequence圖2 不同哺乳動(dòng)物PPP1R11氨基酸序列對(duì)比Fig.2 Alignment of amino acid sequence of PPP1R11 among different mammals

圖3 PPP1R11蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree for PPP1R11 amino acid sequences

A. 犏牛PPP1R11蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；B. 犏牛PPP1R11蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)； C. 犏牛PPP1R11的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)A. Secondary structure of cattle-yak PPP1R11 protein; B. Tertiary structure of cattle-yak PPP1R11 protein; C. Interaction network for cattle-yak PPP1R11 protein圖4 犏牛PPP1R11蛋白的空間結(jié)構(gòu)及互作蛋白Fig.4 Spatial structure and interaction proteins of cattle-yak PPP1R11

3 討 論

雄性生殖力是種畜的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，性狀優(yōu)良的種公畜往往能夠產(chǎn)生更大的經(jīng)濟(jì)效益，故而提高種公畜生殖力對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有促進(jìn)作用。犏牛是牦牛和黃牛的雜交后代，具有雜種優(yōu)勢(shì)顯著和雄性不育的特點(diǎn)[16]，其雄性不育犏?？勺鳛檠芯啃坌陨痴{(diào)控機(jī)理的天然理想模型。據(jù)報(bào)道，蛋白質(zhì)磷酸化與去磷酸化參與了30%～70%的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[6]，精子發(fā)生是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)變化的復(fù)雜過程，需要多種磷酸化酶的參與[17]。其中，去磷酸化酶PP1γ2能夠直接調(diào)控哺乳動(dòng)物的精子發(fā)生，而PPP1R11能夠通過抑制PP1γ2的表達(dá)來維持精子的正常發(fā)生和成熟[15,18]。因此，探索PPP1R11在睪丸中的表達(dá)規(guī)律對(duì)于研究生殖調(diào)控和解析犏牛雄性不育機(jī)制具有重要的價(jià)值。

本研究成功克隆了犏牛PPP1R11基因CDS區(qū)全長序列，由324 bp的核苷酸組成，編碼107個(gè)氨基酸，這與NCBI中提供的野牦牛預(yù)測(cè)序列(XM_014483599.1)和已報(bào)道黃牛[19]的序列完全一致，該基因CDS區(qū)長度與瘤牛、水牛、山羊和綿羊一致。通過氨基酸序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，犏牛PPP1R11蛋白與其它14種哺乳動(dòng)物同源性在95%以上(鴨嘴獸除外)，并識(shí)別到2個(gè)最為保守的基序。這些結(jié)果表明，犏牛PPP1R11與其它哺乳動(dòng)物相比具有高度同源性和進(jìn)化上的高度保守性，PPP1R11可能在不同物種中發(fā)揮較為一致的生物學(xué)功能。鑒于PPP1R11主要通過與相應(yīng)蛋白互作發(fā)揮功能，本研究進(jìn)一步分析了犏牛PPP1R11的互作蛋白發(fā)現(xiàn)，該蛋白與PPP1R2、PPP1CB等10個(gè)蛋白質(zhì)分子存在相互作用。其中PPP1CA、PPP1CB、PPP1CC和PP2A互作為不同類型蛋白磷酸酶，被廣泛報(bào)道能夠參與調(diào)控哺乳動(dòng)物睪丸發(fā)育、精子發(fā)生和成熟[20-23]。有研究表明，在小鼠原始生殖細(xì)胞中特異性敲除PP2A可導(dǎo)致雄性小鼠不育[24]，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)到PP2A在雄性不育犏牛睪丸中也表現(xiàn)為下調(diào)[25]，此外PP2A還可以通過調(diào)控減數(shù)分裂來調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的成熟[26]。PPP1R2、PPP1R7和PPP1R11均為PP1的調(diào)節(jié)劑，能夠在小鼠附睪中共同調(diào)控精子的成熟[15]，PPP1R11能夠通過抑制PPP1R7與PP1結(jié)合從而確保有絲分裂過程中動(dòng)粒與紡錘體的結(jié)合[27]，而PPP1R11與PPP1R2能否直接互作還未見報(bào)道。有研究表明，UTP20能激活RNA聚合酶Ⅰ轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)細(xì)胞增殖[28]，推測(cè)PPP1R11可能與UTP20互作從而參與調(diào)控細(xì)胞增殖。綜上，這些潛在與犏牛PPP1R11互作的蛋白分子均在睪丸發(fā)育和精子發(fā)生中發(fā)揮了重要的作用，這為深入理解PPP1R11在哺乳動(dòng)物睪丸發(fā)育及精子發(fā)生中的分子機(jī)制提供了思路和見解。

不同的字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同Different letters represent the significant differences(P<0.01). The same as below圖5 PPP1R11 mRNA在犏牛中的組織表達(dá)譜Fig.5 Tissue expression profile of PPP1R11 mRNA in cattle-yak

圖6 PPP1R11 mRNA在不同發(fā)育階段犏牛睪丸中的表達(dá)規(guī)律Fig.6 Expression patterns of PPP1R11 mRNA in testes at different developmental stages of cattle-yak

A. 犏胎牛睪丸(5～6月齡)；B. 幼年犏牛睪丸(1～2歲)；C. 成年犏牛睪丸(3～4歲)；D. 牦胎牛睪丸(5～6月齡)；E. 幼年牦牛睪丸(1～2歲)；F. 成年牦牛睪丸(3～4歲)；G. 成年犏牛睪丸(陰性對(duì)照)；H. 成年牦牛睪丸(陰性對(duì)照)。SP. 精原細(xì)胞；PS. 初級(jí)精母細(xì)胞；SS. 次級(jí)精母細(xì)胞；SC. 支持細(xì)胞；IC. 間質(zhì)細(xì)胞；RS. 圓形精子細(xì)胞；ES. 長形精子細(xì)胞A. Fetal cattle-yak testis (5-6 months); B. Juvenile cattle-yak testis (1-2 years old); C. Adult cattle-yak testis (3-4 years old); D. Fetal yak testis (5-6 months); E. Juvenile yak testis (1-2 years old); F. Adult yak testis (3-4 years old); G. Adult cattle-yak testis (Negative control); H. Adult yak testis (Negative control). SP. Spermatogonium; PS. Primary spermatocyte; SS. Secondary spermatocyte; SC. Sertoli cell; IC. Leydig cell; RS. Round spermatid; ES. Elongating spermatid圖7 不同階段雄性犏牛生殖細(xì)胞發(fā)育及PPP1R11蛋白定位Fig.7 The growth of male cattle-yak germ cells and location of PPP1R11 protein at different stages

通過qRT-PCR檢測(cè)了PPP1R11基因在犏牛不同組織中的表達(dá)，組織表達(dá)譜分析顯示，該基因在犏牛各組織中均有表達(dá)，在睪丸組織中表達(dá)最高，這與小鼠[29]、大鼠[30]和綿羊[31]PPP1R11基因組織表達(dá)譜相一致，PPP1R11基因在多種哺乳動(dòng)物睪丸組織中的高表達(dá)表明該基因與雄性生殖相關(guān)，且在犏牛睪丸中也可能發(fā)揮了相似的功能。Goswami等[15]研究表明，PPP1R11基因在小鼠附睪中能夠促進(jìn)精子的成熟，而犏牛附睪中該基因表達(dá)水平較低，推測(cè)是因?yàn)殛＞影l(fā)生阻滯，附睪中無精子細(xì)胞可成熟。此外，本試驗(yàn)還檢測(cè)到該基因在脾和胃中有較高表達(dá)，推測(cè)該基因除參與睪丸發(fā)育、精子生成和成熟外，在其他組織中也可能發(fā)揮作用，其具體功能有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)檢測(cè)到PPP1R11在犏牛睪丸組織中的表達(dá)水平隨睪丸生長發(fā)育呈上升趨勢(shì)，與同時(shí)期牦牛相比均較低，且在幼年和成年時(shí)期差異極顯著。有研究表明，過表達(dá)PPP1R11能夠抑制細(xì)胞的凋亡[32]，在T-單倍型突變雄性不育小鼠模型中，PPP1R11也表現(xiàn)為下調(diào)[33]，由此推測(cè)PPP1R11在睪丸中的表達(dá)水平與雄性生殖力成正相關(guān)，而雄性犏牛不育也可能與此有關(guān)聯(lián)。為進(jìn)一步探討PPP1R11基因在犏牛睪丸中發(fā)揮的作用，利用IHC染色檢測(cè)PPP1R11蛋白在犏牛3個(gè)時(shí)期睪丸中的表達(dá)和細(xì)胞定位。成年期犏牛生精小管內(nèi)只觀察到精原細(xì)胞、支持細(xì)胞和少量初級(jí)精母細(xì)胞，未觀察到次級(jí)精母細(xì)胞和精子細(xì)胞，說明雄性犏牛精子發(fā)生阻滯于初級(jí)精母細(xì)胞，這與前人研究結(jié)果一致[34-36]。在幼年期和成年期犏牛睪丸組織中，PPP1R11蛋白主要定位于犏牛初級(jí)精母細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，其蛋白陽性信號(hào)強(qiáng)度顯著低于同時(shí)期牦牛，這與qRT-PCR的結(jié)果一致。正常生殖力小鼠睪丸中，PPP1R11蛋白主要定位于圓形期精子和長形期精子，其他各級(jí)生殖細(xì)胞和支持細(xì)胞亦有表達(dá)[13-15]，正常生殖力牦牛生精小管中各級(jí)生殖細(xì)胞均檢測(cè)到PPP1R11蛋白陽性信號(hào)，本試驗(yàn)中犏牛精原細(xì)胞幾乎不表達(dá)PPP1R11蛋白，這與小鼠和牦牛的結(jié)果不一致，推測(cè)該蛋白在犏牛精原細(xì)胞中的下調(diào)導(dǎo)致初級(jí)精母細(xì)胞生成的減少，從而造成精子發(fā)生阻滯。綜上，PPP1R11基因可能參與調(diào)控哺乳動(dòng)物精子發(fā)生，其mRNA和蛋白在犏牛睪丸中的差異表達(dá)可能是造成雄性犏牛減數(shù)分裂阻滯的原因之一。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功克隆了犏牛PPP1R11基因序列，該基因在犏牛與牦牛睪丸組織中的mRNA表達(dá)水平和蛋白定位存在差異，提示PPP1R11可能與維持雄性正常生殖力相關(guān)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究雄性犏牛不育的機(jī)制和PPP1R11在雄性生殖系統(tǒng)中的生理功能和調(diào)控機(jī)制提供了理論依據(jù)。