奶牛乳腺上皮細胞的原代培養(yǎng)及其生物學(xué)特性分析

孫培皓，趙鑫哲，吳涵瀟，呂 策，楊利國,2，梁愛心,2*

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070；2.動物遺傳育種與繁殖國際聯(lián)合研究中心，武漢 430070)

乳腺是哺乳動物特有的腺體組織，具有分泌乳汁的功能。腺泡是合成和分泌乳汁的基本單位，腺泡的周圍緊密地排列著乳腺上皮細胞，其能將血液內(nèi)的各種營養(yǎng)物質(zhì)通過一系列過程合成乳汁[1]。同時，奶牛乳腺上皮細胞的來源豐富、采集簡單，易在體外培養(yǎng)、擴增和導(dǎo)入外源目的基因[2]。因此，奶牛乳腺上皮細胞已經(jīng)作為一種重要的細胞模型用于研究泌乳調(diào)控機制以及乳腺炎的發(fā)病機制。

體外獲得奶牛原代乳腺上皮細胞的方法主要有3種，分別為酶消化法、組織塊接種法和乳汁分離法。乳汁分離法由于乳汁中脫落的細胞數(shù)量較少，并且分離過程中對環(huán)境的要求比較高，所以并不常用[3-5]。組織塊接種法能夠保持細胞的二倍體活性，并且不會對細胞的活性造成影響，但獲得細胞的周期較長[6-9]。目前，國外使用較多的是酶消化法，包括膠原酶Ⅰ消化法[10-11]、膠原酶Ⅱ消化法[12-13]、膠原酶Ⅳ消化法[14]、胰酶消化法[15]等。雖然奶牛乳腺上皮細胞在體外分離培養(yǎng)的研究已有很多年，但是體外分離培養(yǎng)的方法尚存在一些問題，比如用組織塊接種法分離細胞時容易污染[16]，而且獲得完整細胞的周期太長，一般都需要14 d左右[17]；酶消化法分離細胞時會浪費較多細胞，并且酶消化法對于消化時間和消化濃度都有著一定的要求，消化時間不足就無法得到足夠的細胞[18-19]，消化時間過長則會對細胞本身造成很大的損傷，無法得到狀態(tài)完好的細胞[20-21]。本研究通過采用改進的膠原酶Ⅰ消化法體外分離培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞，同時對所獲得的細胞的生長特性與分泌功能進行檢測，得到了穩(wěn)定可用的奶牛乳腺上皮細胞，為后續(xù)乳腺功能的相關(guān)研究奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

DMEM/F12培養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清(FBS,fetal bovine serum)和0.25%胰蛋白酶消化液購自Gibco公司，二甲基亞砜(DMSO, Dimethyl sulfoxide)和10×吉姆薩染液購自Sigma-Aldrich公司，RNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司(R6834-01)，2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(貨號Q711-02)HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(貨號R223-01)購自南京Vazyme公司，青霉素和鏈霉素購自Biosharp公司，角蛋白18 (CK18，Cytokeratin 18)抗體購自Abcam公司(ab668)，酪蛋白ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)公司，F(xiàn)ITC山羊抗鼠二抗購自ABclonal公司(AS011)，甘油三酯檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所(A110-1)，乳糖檢測試劑盒Lactose/D-Galactose(Rapid) Assay Kit購自Megazyme公司，膠原酶Ⅰ、透明質(zhì)酸酶、DNASe Ⅰ購自德國biofrox公司，中性蛋白酶購自上海源葉公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 奶牛乳腺上皮細胞的原代培養(yǎng)及純化 從武漢屠宰場健康泌乳奶牛中采集大塊的乳腺組織。采用含有5%雙抗的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)清洗乳腺組織表面的血液后，置于DMEM/F12培養(yǎng)基中迅速帶回實驗室。將乳腺組織置于75%酒精中浸泡5 min，用手術(shù)剪剪除乳腺組織塊中的結(jié)締組織和脂肪組織后，將剩余組織塊剪碎至肉糜狀，移入離心管后，加入含有5%雙抗的PBS溶液，800 r·min-1離心5 min，棄去上清，重復(fù)3次。在離心管中加入含有0.05%膠原酶I和0.05%透明質(zhì)酸酶的DMEM/F12培養(yǎng)基，將其置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中消化7～9 h，然后再用含有1%中性蛋白酶和DNA酶的胰酶消化30 min，加入含有10% FBS和1%雙抗的完全培養(yǎng)基終止消化。隨后，置于70 μm的細胞篩網(wǎng)過濾，將得到的濾液于1 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，重懸后得到沉淀轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)2 ～3 d后，采用差速消化法對奶牛乳腺上皮細胞進行純化，加入胰酶消化3 min后棄去含有成纖維細胞的消化液，隨后加入培養(yǎng)基繼續(xù)對細胞進行培養(yǎng)。

1.2.2 奶牛乳腺上皮細胞的形態(tài)觀察 對體外培養(yǎng)至第6代的奶牛乳腺上皮細胞進行形態(tài)學(xué)觀察，每天定時用顯微鏡觀察細胞的形態(tài)和生長狀況并拍照記錄。

1.2.3 細胞免疫熒光 選取第6代的細胞制作細胞爬片，用4%多聚甲醛固定10 min后，用0.1%的Triton x-100透化10 min，清洗后用5% BSA封閉1 h，隨后加入1∶100稀釋的CK18一抗于4 ℃孵育過夜，之后用1∶200稀釋的FITC標(biāo)記的二抗避光孵育2 h，加入DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚, 4′,6-diamidino-2-phenylindole)染色液避光孵育10 min 后，用抗熒光淬滅封片劑進行封片。最后，在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察CK18的表達并拍照。

1.2.4 染色體核型分析 選取第6代的細胞傳至6孔細胞培養(yǎng)板中，貼壁后用含有0.2 μg·mL-1秋水仙素的培養(yǎng)液繼續(xù)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h，之后用胰蛋白酶消化分離細胞，隨后用0.075 mol·L-1的KCl低滲溶液于37 ℃處理25 min， 再用固定液固定8 min，800 r·min-1離心10 min，重復(fù)固定3次。將預(yù)冷的載玻片傾斜45°滴加細胞懸液，之后將載玻片在酒精燈上掠過，室溫放干，用吉姆薩溶液進行染色，用封片劑進行封片，最后在100×油鏡下觀察染色體數(shù)量和形態(tài)變化。

1.2.5 細胞的生長曲線測定 將傳代至第3、第6、第9代的細胞接種到24孔板中，傳板后1、2、3、4、5、6、7、8和9 d后分別用血細胞計數(shù)板進行計數(shù)，并繪制細胞生長曲線。

1.2.6 細胞群體倍增曲線測定 將傳代至第3、第6、第9代的細胞接種到24孔板中，傳板后1、2、3、4、5、6、7、8和9 d后對細胞進行計數(shù)，按照公式T=t× [lg2/(lgNt-lgN0)][22]計算細胞在對數(shù)生長期間的群體倍增時間。其中，Nt是計算時細胞的最終數(shù)量，N0是細胞的初始數(shù)量，t是細胞的生長時間。

1.2.7 細胞凍存復(fù)蘇活力測定 選取生長狀態(tài)良好的第3、第6和第9代細胞，按照細胞傳代的方法來獲得細胞沉淀，同時采用血細胞計數(shù)方法對凍存的細胞進行計數(shù)。隨后按照每個凍存管1 mL凍存液 (DMSO∶FBS=1∶9)分裝細胞，將凍存細胞復(fù)蘇24 h后進行細胞計數(shù)，按下列公式計算凍存復(fù)蘇活力[23]。

凍存復(fù)蘇活力=(復(fù)蘇后24 h細胞貼壁數(shù)量/凍存前的細胞數(shù)量)×100%。

1.2.8 乳腺上皮細胞分泌功能的檢測 用誘導(dǎo)培養(yǎng)基(成份為10% FBS，1%雙抗，89%的DMEM/F12培養(yǎng)基和10 ng·mL-1催乳素、10 ng·mL-1表皮生長因子、5 mg·mL-1轉(zhuǎn)鐵蛋白、5 mg·mL-1牛胰島素、1 mg·mL-1氫化可的松)對乳腺上皮細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)2 d后，收取細胞上清液。參照ELISA試劑盒說明書測定上清液中α酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白的含量，板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于15%。同時，參照細胞甘油三酯試劑盒說明書測定上清液中甘油三酯的含量；參照Lactose/Galactose(Rapid)乳糖試劑盒說明書測定上清液中乳糖的含量。

1.2.9 熒光定量PCR檢測 使用RNA提取試劑盒提取誘導(dǎo)培養(yǎng)后第3、第6、第9代乳腺上皮細胞的總RNA，根據(jù)HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，最后使用實時熒光定量PCR檢測泌乳相關(guān)基因的表達，參考ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix熒光定量PCR試劑說明書檢測泌乳相關(guān)基因的表達量。采用Primer 5 軟件設(shè)計泌乳相關(guān)基因以及內(nèi)參基因GAPDH的引物序列，由擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成，基因引物序列詳見表1。實時熒光定量PCR的反應(yīng)體系為10 μL：SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 3 μL；反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性1 min； 95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s， 進行40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt的分析方法計算基因的相對表達量。

表1 引物序列

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 每個試驗至少重復(fù)3次，采用GraphPad Prism 8軟件作圖，多組之間樣本采用單因素方差分析中的Turkey檢驗進行多重比較，試驗結(jié)果采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺上皮細胞原代培養(yǎng)及純化

采用改進的酶消化法獲得的細胞在消化后2 d基本上貼壁完全，可見乳腺上皮細胞與成纖維細胞混合生長，其中乳腺上皮細胞呈圓形，符合乳腺上皮細胞的基本形態(tài)；成纖維細胞呈梭形，符合成纖維細胞的基本形態(tài) (圖1A和1B)。用胰酶消化4 min后，可見培養(yǎng)瓶內(nèi)成纖維細胞被消化，剩余細胞大多為乳腺上皮細胞，經(jīng)過多次差時消化后，所獲得細胞基本上全部是乳腺上皮細胞。

A. (10×); B. (20×)。乳腺上皮細胞中混有少量成纖維細胞，箭頭所指為成纖維細胞A.(10×); B. (20×). Mammary epithelial cells mixed with a small amount of fibroblasts, the arrow points to fibroblasts圖1 奶牛乳腺上皮細胞的原代培養(yǎng)Fig.1 Primary culture of bovine mammary epithelial cells

2.2 乳腺上皮細胞的形態(tài)觀察

通過觀察純化后乳腺上皮細胞的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)貼壁3 d后，細胞形態(tài)呈現(xiàn)出“鵝卵石”狀 (圖2A)；貼壁5 d后，細胞相互聚集，出現(xiàn)類似于“拉網(wǎng)狀”結(jié)構(gòu)(圖2B～C)。隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞逐漸出現(xiàn)空泡狀結(jié)構(gòu)(圖2D～E)，直至最后出現(xiàn) “圓頂狀”結(jié)構(gòu)(圖2F)。

2.3 乳腺上皮細胞的鑒定

由熒光共聚焦顯微結(jié)果(圖3)可以看出，分離純化培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞大小清晰，且圖中FITC染色的細胞質(zhì)與DAPI染色的細胞核可以完全重合，表明CK18僅在細胞質(zhì)中表達且該細胞為乳腺上皮細胞。陰性對照細胞質(zhì)中沒有綠色熒光，表明本研究所培養(yǎng)的乳腺上皮細胞具有很高的純度。

2.4 乳腺上皮細胞染色體核型分析

對第6代乳腺上皮細胞進行染色體核型分析，由圖4可以看出，所分離奶牛乳腺上皮細胞的染色體條數(shù)為60條，與奶牛的染色體條數(shù)一致，并且1對X染色體較為明顯(箭頭所指)，表明分離到的乳腺上皮細胞的染色體沒有發(fā)生變異(圖4)。

2.5 乳腺上皮細胞生長曲線

分別取第3、第6和第9代奶牛乳腺上皮細胞，經(jīng)過連續(xù)9 d的細胞計數(shù)后，根據(jù)細胞數(shù)量繪制生長曲線。結(jié)果表明，所取3代細胞的生長曲線都成“S型”，其中，3個代次之間細胞的生長速度差異不顯著(圖5)。

2.6 乳腺上皮細胞群體倍增時間

根據(jù)細胞計數(shù)的結(jié)果并按照公式計算出處于對數(shù)生長期細胞的群體倍增時間。由圖6可知，隨著培養(yǎng)代次的增加，群體倍增時間隨之增加。其中，第3代細胞的倍增時間最短，第9代細胞的倍增時間極顯著高于第3和第6代的倍增時間(P<0.01)。

2.7 乳腺上皮細胞凍存復(fù)蘇活力

分別對3個代次細胞的凍存復(fù)蘇活力進行計算，發(fā)現(xiàn)3個代次細胞復(fù)蘇后24 h貼壁率相近。其中，第3代細胞的24 h貼壁率為92.59%，第6代細胞為88.99%，第9代細胞為90.37%(圖7)，3個代次細胞的凍存復(fù)蘇活力間沒有顯著差異(P>0.05)。

A.細胞培養(yǎng)第3天，呈現(xiàn)出鵝卵石狀(10×)；B.培養(yǎng)第5天，細胞開始形成拉網(wǎng)狀(10×)；C.培養(yǎng)第7天，基本形成拉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(10×)；D.培養(yǎng)第10天，出現(xiàn)大量空泡狀結(jié)構(gòu)(10×)；E.空泡狀結(jié)構(gòu)(20×)；F.圓頂狀結(jié)構(gòu)(40×)A. After 3 days of culture, cells showed a typical cobblestone shape (10×); B. After 5 days of culture, the cells began to form a mesh structure (10×); C. After 7 days of culture, the cells formed the mesh structure (10×); D. After 10 days of culture, cells appeared a large number of alveoli-like structures (10×); E. Alveoli-like structures (20×); F. Dome-like structures (40×)圖2 培養(yǎng)不同天數(shù)乳腺上皮細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.2 Morphological structure of mammary epithelial cells cultured for different days

A.DAPI染色的細胞核(40×)；B.CK18染色(40×)；C.A、B圖的組合圖片 (40×)；D.陰性對照的DAPI染色(40×)；E.陰性對照的FITC染色(40×)；F.陰性對照的組合圖(40×)A. Nucleus stained with DAPI(40×); B. Cell stained with cytokeratin18(40×); C. Merge picture of figure A and B(40×); D. DAPI staining of negative control(40×); E. FITC staining of negative control(40×); F. Merge picture of negative control(40×)圖3 乳腺上皮細胞的角蛋白18染色Fig.3 The CK18 staining of mammary epithelial cells

圖4 奶牛乳腺上皮細胞的染色體核型分析Fig.4 Chromosome karyotype analysis of bovine mammary epithelial cells

圖5 不同代次細胞的生長曲線Fig.5 Cell growth curves of different generations

*. P<0.05, **. P<0.01,下同*. P<0.05, **. P<0.01, the same as below圖6 細胞群體倍增時間Fig.6 Cell population doubling time

圖7 不同代次細胞的凍存復(fù)蘇活力Fig.7 Cell resuscitation rate of different generations

2.8 乳腺上皮細胞分泌功能的檢測

采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)不同代次乳腺上皮細胞48 h后，檢測上清中乳蛋白、乳脂和乳糖的分泌。結(jié)果顯示，所培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞均能誘導(dǎo)α酪蛋白、β酪蛋白、κ酪蛋白、甘油三酯和乳糖的合成與分泌，且3個代次細胞分泌α、β、κ酪蛋白的含量無顯著性差異(P>0.05，圖8A-C)。同樣地，3個代次細胞所分泌的甘油三酯和乳糖的含量均無顯著性差異(P>0.05，圖8D和8E)。

A. 3個代次細胞上清液中α酪蛋白的含量；B. 3個代次細胞上清液中β酪蛋白的含量；C. 3個代次細胞上清液中κ酪蛋白的含量；D. 3個代次細胞上清液中甘油三酯的含量；E. 3個代次細胞上清液中乳糖的含量A. The content of α-casein in the supernatant of 3 generations of cells; B. The content of β-casein in the supernatant of 3 generations of cells; C. The content of κ-casein in the supernatant of 3 generations of cells; D. The content of triglyceride in the supernatant of 3 generations of cells; E. The content of lactose in the supernatant of 3 generations of cells圖8 上清液中酪蛋白、甘油三酯和乳糖的含量Fig.8 The contents of casein, triglyceride and lactose in the supernatant

2.9 泌乳相關(guān)基因的表達

通過RT-qPCR檢測第3、第6、第9代細胞中與乳汁合成相關(guān)基因的表達量。結(jié)果如圖9所示，所檢測的與乳蛋白合成相關(guān)基因CSN3、PRLr的表達量、與乳脂合成相關(guān)基因ACACA、FASN、SCD、FADS1、LPL、PPARγ、ACSS2、INSIG1、SREBP1的表達量和與乳糖合成相關(guān)基因HK-1、HK-2的表達量均無顯著性變化(P>0.05)；在與乳蛋白合成相關(guān)的通路基因中，隨著培養(yǎng)代次的增加，S6K1基因的表達呈現(xiàn)上升趨勢，且第6代和第9代細胞中S6K1基因的表達均極顯著高于第3代細胞(P<0.01)，而JAK2、4EBP1、mTOR、STAT5基因的表達在各代次間并沒有顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

采用酶消化法培養(yǎng)原代細胞時，控制消化酶的濃度和時間是關(guān)鍵。為了能穩(wěn)定高效地從組織塊中消化分離出狀態(tài)良好的細胞，本研究參考了Anand等[23]使用的方法，使用膠原酶Ⅰ和透明質(zhì)酸酶進行第一步消化，而后使用中性蛋白酶和DNA酶進行第二步消化，但是在試驗過程中發(fā)現(xiàn)按照此方法進行分離只能獲得少量的細胞，推測可能是消化時間不足導(dǎo)致難以獲得大量細胞。因此，本研究在消化時間上加以改進，將消化時間從3 h左右延長到8 h，從而穩(wěn)定地獲得了奶牛乳腺上皮細胞，并且細胞的形態(tài)完好，具有良好的生物學(xué)功能。同時發(fā)現(xiàn)，在分離時如果能夠盡量在消化前將乳腺組織周圍的結(jié)締組織和脂肪組織去除，取中心帶有腺泡的小組織塊，獲得的細胞中只有少量成纖維細胞，絕大多數(shù)都為乳腺上皮細胞。

本研究首先對純化后的奶牛乳腺上皮細胞的形態(tài)進行了觀察，所獲得的細胞在剛貼壁時呈現(xiàn)出鵝卵石鋪路狀，貼壁一段時間后就會呈現(xiàn)出拉網(wǎng)狀，結(jié)果與之前有關(guān)乳腺上皮細胞形態(tài)的報道相一致[24-28]。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)了乳腺上皮細胞具有獨特的空泡狀和圓頂狀結(jié)構(gòu)，而這些結(jié)構(gòu)在之前一些研究中也有報道[29-34]。原代乳腺上皮細胞貼壁后會相互聚集在一起，而類似空泡狀的結(jié)構(gòu)則是在培養(yǎng)10 d左右才會大量增多，推測這些特有結(jié)構(gòu)是因細胞老化而產(chǎn)生，圓頂狀結(jié)構(gòu)則是多個空泡狀結(jié)構(gòu)聚集在一起所形成的。角蛋白18(CK18)作為上皮細胞的標(biāo)志性蛋白被廣泛用于鑒定乳腺上皮細胞[23,33]，CK18的大量表達表明了所培養(yǎng)乳腺上皮細胞的純度很高。此外，染色體核型分析的結(jié)果表明所獲得的乳腺上皮細胞的染色體數(shù)目并沒有發(fā)生改變，染色體形態(tài)也符合前人研究結(jié)果[28]。

A. 與乳汁合成相關(guān)基因的表達；B. 與乳蛋白合成相關(guān)通路基因的表達A. Related genes expression of milk synthesis; B. Signaling pathway related genes expression of milk protein圖9 乳汁合成相關(guān)基因的表達Fig.9 mRNA expression of milk synthesis related genes

本研究中，第9代細胞的生長速度與前人通過酶消化法所得4、5代細胞生長速度類似，而本研究所測量的第3、第6代細胞的生長速度則明顯快于前人的結(jié)果[35]，可能是因為本研究所用消化酶的濃度和時間對細胞的損傷比較少，細胞的狀態(tài)完好。本次試驗中的細胞群體倍增時間處于34 ～ 65 h之間，此前有試驗分離的奶牛乳腺上皮細胞群體倍增時間處于38 ～44 h之間[32]，而本次試驗中的第3和第6代的奶牛乳腺上皮細胞的群體倍增時間分別為34.87和41.45 h，與前人所得結(jié)果一致。

酪蛋白是體外培養(yǎng)乳腺上皮細胞是否具有分化功能的重要標(biāo)志，且隨著培養(yǎng)代次的不斷增加，乳腺上皮細胞會逐漸逆分化，形態(tài)會發(fā)生改變，分泌功能也會逐漸降低[36]。為此本研究只選取了9代及之前代次細胞鑒定其分泌功能。研究發(fā)現(xiàn)，3個代次的細胞均可分泌3種酪蛋白(α、β、κ)、甘油三酯以及乳糖，且在3個細胞代次之間無顯著性差異，與前人所報道的奶牛乳腺上皮細胞在10代之前基本上分泌量沒有明顯差異的結(jié)果相一致[36-38]。通過分析與乳成分合成相關(guān)基因的表達，發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因的表達在3個代次間沒有顯著差異，進一步支撐了乳成分在3個代次間沒有變化的結(jié)果。

在對原代乳腺上皮細胞功能的鑒定中，鮮見有對乳汁合成相關(guān)通路基因的報道。在乳汁合成過程中，mTOR信號通路控制著乳蛋白相關(guān)基因的翻譯，mTOR通過負調(diào)控4EBP1、正調(diào)控S6K1促進乳蛋白的合成[39-41]。本研究發(fā)現(xiàn)，mTOR和4EBP1基因的表達量在3個代次之間并沒有明顯的差異，但S6K1的表達量隨著代次的增加呈現(xiàn)上升趨勢。然而，S6K1表達量的上升并未引起α、β、κ酪蛋白的增加，推測可能是S6K1磷酸化水平?jīng)]有變化或S6K1沒有被激活。值得注意的是，與乳汁合成相關(guān)的JAK2-STAT5通路中的JAK2和STAT5的表達量在3個代次間均無顯著性變化。

4 結(jié) 論

本試驗通過改進的酶消化法成功獲得了形態(tài)好、純度高的原代奶牛乳腺上皮細胞，且細胞培養(yǎng)至第9代仍具有良好的生長特性與分泌功能，可為進一步研究乳腺的功能和泌乳機制提供強有力的支撐。