堿脅迫下內(nèi)生真菌對布頓大麥光合性能和生理特性的影響

王 凱， 楊寶鈺， 陳水紅， 席琳喬

(塔里木大學(xué)/塔里木盆地生物資源保護(hù)利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 新疆 阿拉爾 843300)

布頓大麥(Hordeumbogdanii)在新疆分布較廣，沿天山兩側(cè)的平原、綠州、草地、鹽漬化草甸、路邊等均有其野生種的生長[1]。這種草的適應(yīng)性強(qiáng)，產(chǎn)草量高，盛花期干草產(chǎn)量為6 000～9 000 kg·hm-2；營養(yǎng)豐富，花期干草蛋白質(zhì)含量為15.44%，適口性好[2]。在pH值為7.8～8.0的鹽化草甸土上生長良好，產(chǎn)量較高，具有耐寒性強(qiáng)、耐干早、耐鹽堿、再生性強(qiáng)的特點(diǎn)，喜生于較濕潤或帶微堿性的砂質(zhì)土壤上，是牧區(qū)天然草地上一種重要的野生資源，在作為飼用牧草和改良鹽堿地方面有著十分廣闊的前景[2-3]。

土壤鹽堿化不僅危害植物生長，而且會破壞土地結(jié)構(gòu)，致使大多數(shù)植物生長受到不同程度的抑制，甚至?xí)?dǎo)致死亡[4]。而堿脅迫對布頓大麥的傷害主要表現(xiàn)為：使布頓大麥生長緩慢、新枝生長減少，植株株高降低，葉片枯黃萎蔫，使植株光合作用下降，最終導(dǎo)致產(chǎn)量減低，高濃度堿脅迫甚至?xí)怪仓晁劳鯷5]。

禾草內(nèi)生真菌是指其部分或全部生命周期都在禾草體內(nèi)完成，而宿主植物外部卻不顯現(xiàn)任何病害癥狀的一大類真菌[6]。內(nèi)生真菌與禾草形成互惠共生體，可以提高宿主植物抵抗生物脅迫和非生物脅迫的能力。例如：內(nèi)生真菌可以提高寄主的生長能力[7]以及對食草動物[8-10]、昆蟲[11-13]、線蟲[14]、病原真菌、細(xì)菌[15]和競爭性植物[16]等生物脅迫的抗性和對鹽堿[17-18]、干旱[19-20]、重金屬污染[21]等非生物脅迫的抵抗能力。由于新疆是中國最大的鹽土區(qū)，擁有大量鹽堿地，而布頓大麥又在新疆廣泛分布，因此本文研究內(nèi)生真菌與堿脅迫對布頓大麥光合特性和部分理化指標(biāo)的影響，進(jìn)而揭示內(nèi)生真菌對宿主布頓大麥抗堿性影響及其作用機(jī)理，為進(jìn)一步探究布頓大麥、內(nèi)生真菌、耐堿性三者之間的關(guān)系，提供重要的參考依據(jù)；同時為提高鹽堿地利用，提高生產(chǎn)力，增加地面植被覆蓋率，改善畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境建設(shè)，提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 種子來源

布頓大麥種子采集于新疆阿克蘇地區(qū)烏什縣(78°23′41″～80°01′09″E，40°43′08″～41°51′12″N，海拔：1 396 m)，種植于塔里木大學(xué)溫室大棚[白天平均溫度(28±2)℃；夜間平均溫度(12±2)℃]中，待布頓大麥幼苗生長至3～4株分蘗時用苯胺藍(lán)染色法[22]檢測布頓大麥植株的內(nèi)生真菌帶菌情況，并將攜帶內(nèi)生真菌的植株(E+)培養(yǎng)至成熟收獲種子，收集種子后分出一半種子用內(nèi)吸式殺菌劑(甲基托布津，50%有效濃度)浸泡處理5 h，用清水洗干凈殘余藥后，將種子種植于新疆阿拉爾市塔里木大學(xué)溫室中，待其生長6周后，對植株進(jìn)行檢菌，確定都為不帶內(nèi)生真菌的植株(E-)后將其培養(yǎng)至成熟收獲種子。最后將得到的E+與E-種子種植于實(shí)驗(yàn)大田繁殖二代種子，收獲的種子用作本試驗(yàn)的種子。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

將收取的布頓大麥E+和E-的種子各種植25盆，共50盆于溫室大棚中，定期澆Hoaglang營養(yǎng)液使布頓大麥生長至分蘗盛期，對布頓大麥植株進(jìn)行50，100，150，200 mmol·L-1四種濃度的混合堿(碳酸鈉∶碳酸氫鈉=1∶1)處理并以未加混合堿的為對照，每個處理重復(fù)5次。處理方案：為避免堿沖激效應(yīng)的發(fā)生，澆灌混合堿溶液采用漸近式，即除對照外，第1次澆灌濃度均為25 mmol·L-1，之后每天遞增25 mmol·L-1，直至預(yù)定濃度。達(dá)預(yù)定濃度后，根據(jù)氣溫變化進(jìn)行管理，適量澆灌對應(yīng)濃度溶液，但每組澆灌溶液體積相同。在處理結(jié)束前一天，用Li-6400 測定光合特性相關(guān)指標(biāo)，脅迫21 d收樣，鮮樣剪成小段稱量一定重量用錫箔紙包裹并標(biāo)記各處理組，液氮速凍后放入-80℃冰箱保存用于后續(xù)各項(xiàng)指標(biāo)測定。

1.3 指標(biāo)測定方法

1.3.1光合特性相關(guān)指標(biāo)的測定方法 在準(zhǔn)備收取樣品前，用便攜式光合作用測定儀Li-6400，測定不同堿處理濃度下布頓大麥植株的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率和胞間CO2濃度等相關(guān)指標(biāo)。測定時選取植株自上而下第三片葉片，同時測其葉面寬度，采用2 cm×3 cm的葉室，LED紅藍(lán)光源，光強(qiáng)1 500 μmol·m-2·s-1，參數(shù)ΔCO2在±0.5范圍之內(nèi)，溫度室溫(23±2)℃。

1.3.2生理生化相關(guān)指標(biāo)的測定方法 葉綠素含量的測定采用丙酮和酒精萃取法[23]；脯氨酸含量測定采用磺基水楊酸法[24]；過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性測定采用硫代硫酸鈉滴定法[25]；過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[25]；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性的測定采用氯化硝基四氮唑藍(lán)法[25]；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[25]；可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[25]；細(xì)胞質(zhì)膜透性測定采用電導(dǎo)儀法；丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法[26]。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

利用SPSS(IBM SPSS Statistics 19)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，圖中數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。文中圖表用SigmaPlot 14.0繪圖軟件繪制。采用雙因素方差分析方法檢測堿處理和內(nèi)生真菌對布頓大麥光合性能和理化指標(biāo)的影響，其中不同的堿處理濃度對布頓大麥光合性能和理化指標(biāo)的影響采用單因素方差分析，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)來檢測同一堿濃度下E+和E-每個光合指標(biāo)和理化指標(biāo)含量的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿脅迫下內(nèi)生真菌對凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率和胞間CO2濃度影響

由表1可知凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率和胞間CO2濃度都隨堿濃度升高而降低，并且在不同濃度的堿處理的條件下，各組E+植株的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率和胞間CO2濃度都高于E-植株，在50 mmol·L-1和100 mmol·L-1堿濃度處理下E+的植株的凈光合速率顯著高于E-(P<0.05)，植株氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率E+極顯著高于E-(P<0.01)。在不同濃度的堿處理?xiàng)l件下，除對照組的胞間CO2濃度E+、E-對比差異不顯著外，在50 mmol·L-1時E+植株胞間CO2濃度顯著高于E-(P<0.05)，其余各組胞間CO2濃度E+植株極顯著高于E-植株(P<0.01)。

表1 堿脅迫下內(nèi)生真菌對布頓大麥植株光合特性的影響Table 1 Effects of endophytic fungi on photosynthetic characteristics of Hordeum bogdanii under alkaline stress

2.2 堿脅迫下內(nèi)生真菌對葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響

由圖1a和圖1b可知布頓大麥植株葉綠素a和葉綠素b含量隨堿濃度增加總體呈下降趨勢，且E+布頓大麥葉綠素含量均高于E-，在堿濃度為0，150，200 mmol·L-1時，E+植株的葉綠素a和葉綠素b均顯著高于E-植株(P<0.05)，由圖1c可知E-布頓大麥的類胡蘿卜素隨堿濃度的升高而呈現(xiàn)下降趨勢，且各組堿處理E+植株的類胡蘿卜素均高于E-植株，除堿濃度為50 mmol·L-1這一處理組外其余各組E+植株的類胡蘿卜素都顯著高于E-植株(P<0.05)。由表2得出內(nèi)生真菌、堿處理顯著影響葉綠素a，b和類胡蘿卜素的含量(P<0.05)。

圖1 不同濃度混合堿和內(nèi)生真菌對布頓大麥植株葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of mixed alkali and endophytic fungi on chlorophyll and carotenoid contents in Hordeum bogdanii plants注：不同處理濃度混合堿脅迫條件下，在帶內(nèi)生真菌(E+)組或不帶內(nèi)生真菌(E-)組中，標(biāo)注不同小寫字母者差異顯著(P<0.05)。E+和E-在相同處理下，兩兩差異顯著(P<0.05)者用“*”標(biāo)注，其中“*”標(biāo)注在較高一組上，下同Note:Significant differences (P<0.05) between groups with endophytic fungi (E+) or without endophytic fungi (E-) under mixed alkali stress conditions with different treatment concentrations,marked with different lowercase letters. E+ and E- are marked with “*” for two significant differences (P<0.05) under the same treatment,where “*” is marked on the higher group,the same as below

表2 堿脅迫下內(nèi)生真菌對布頓大麥理化指標(biāo)影響的雙因素方差分析Table 2 Two-factor analysis of variance for the effects of endophytic fungi on physical and chemical indexes of Hordeum bogdanii under alkali stress

2.3 堿脅迫下內(nèi)生真菌對布頓大麥抗氧化酶活性影響

由圖2a 得出E+植株的CAT活性隨著堿濃度的升高總體呈下降趨勢，并且除200 mmol·L-1這一處理組外其余各組E+植株的CAT活性都高于E-植株，且在0，50，100 mmol·L-1堿濃度下E+植株的CAT活性顯著高于E-植株(P<0.05)。E+植株的POD活性隨著堿濃度的升高而逐漸降低，并且E+植株的POD活性均顯著高于E-植株(P<0.05)(圖2b)。除對照組以外其余各組E+植株的SOD活性均高于E-植株，且在堿濃度為50 mmol· L-1時E+植株的SOD活性顯著高于E-植株(P<0.05)(圖2c)。由表2可知內(nèi)生真菌和堿處理對植株CAT活性有顯著影響，并且兩者之間存在交互作用(P<0.05)。內(nèi)生真菌對植株P(guān)OD和SOD活性有顯著影響(P<0.05)，內(nèi)生真菌和堿處理兩者之間存在交互作用(P<0.05)。

圖2 不同濃度混合堿和內(nèi)生真菌對布頓大麥植株抗氧化酶活性的影響Fig.2 Effects of different concentrations of mixed alkali and endophytic fungi on antioxidant enzyme activities of Hordeum bogdanii plants

2.4 堿脅迫下內(nèi)生真菌對布頓大麥滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由圖3a可知布頓大麥植株的脯氨酸含量隨堿濃度的升高而呈現(xiàn)升高狀態(tài)，除堿濃度為50 mmol·L-1這一處理組外其余各處理組的E+植株的脯氨酸含量都高于E-植株，在50 mmol·L-1時E-植株的脯氨酸含量顯著高于E+植株(P<0.05)在堿濃度為150，200 mmol·L-1時E+植株的脯氨酸含量顯著高于E-植株(P<0.05)。E+植株的可溶性蛋白含量隨著堿濃度的升高而升高，除堿濃度為200 mmol·L-1其余各處理組E-植株的可溶性蛋白含量均高于E+植株，在200 mmol·L-1時E+植株的可溶性蛋白含量顯著高于E-(P<0.05)(圖3b)。除對照以外E+植株的可溶性糖含量隨著堿濃度的升高而升高，并且各組E+植株的可溶性糖含量都顯著高于E-植株(P<0.05)(圖3c)。由表2可知內(nèi)生真菌和堿處理顯著影響布頓大麥植株脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖含量，并且兩者之間存在交互作用(P<0.05)。

圖3 不同濃度混合堿和內(nèi)生真菌對布頓大麥植株滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響Fig.3 Effects of different concentrations of mixed alkali and endophytic fungi on osmoregulation substances in Hordeum bogdanii plants

2.5 堿脅迫下內(nèi)生真菌對布頓大麥膜透性的影響

由圖4a 可知，E+植株的葉片相對電導(dǎo)率隨著堿濃度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的的趨勢，而E-植株的葉片相對電導(dǎo)率隨著堿濃度的升高而呈現(xiàn)上升趨勢(200 mmol·L-1除外)，并且E-植株的葉片相對電導(dǎo)率在各處理組(除100 mmol·L-1)均顯著高于E+植株(P<0.05)。E-植株的MDA含量隨著堿濃度的升高而升高，并且各處理組E-植株的MDA含量均顯著高于E+植株(P<0.05，圖4b)。由表2可知內(nèi)生真菌和堿處理對布頓大麥植株的葉片相對電導(dǎo)率和MDA含量有顯著影響，并且二者之間存在交互作用(P<0.05)。

圖4 不同濃度混合堿和內(nèi)生真菌對布頓大麥植株細(xì)胞膜透性的影響Fig.4 Effects of different concentrations of mixed alkali and endophytic fungi on cell membrane permeability of Hordeum bogdanii

3 討論

植物抵抗脅迫的方式主要是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢、維持細(xì)胞膜系統(tǒng)的完整、增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)、調(diào)節(jié)激素水平等手段來減輕脅迫所帶來的傷害[17]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)來自于新疆阿克蘇地區(qū)烏什縣布頓大麥葉綠素、類胡蘿卜素、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率、胞內(nèi)CO2濃度、抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、細(xì)胞膜透性都受堿濃度影響，隨著堿濃度由低到高而做出相應(yīng)的變化。通過上述指標(biāo)我們發(fā)現(xiàn)布頓大麥E+植株對不同濃度的混合堿溶液有一定的抗性。

鹽堿環(huán)境對植物的生長影響很大，植物的光合作用在堿脅迫下被打亂，導(dǎo)致植株的凈光合速率降低，并且植株的凈光合速率、胞間CO2濃度等指標(biāo)的降低程度與堿濃度升高之間呈現(xiàn)正相關(guān)[27-28]。本試驗(yàn)中隨著堿濃度不斷加劇布頓大麥植株的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率、胞間CO2濃度變化均呈現(xiàn)下降趨勢，然而，在堿脅迫下E+植株這4個指標(biāo)均高于E-植株(表1)。Morse等[29]人發(fā)現(xiàn)，在重度水分脅迫下，帶內(nèi)生真菌的亞利桑那羊茅(Festucaarizonica)與不帶內(nèi)生真菌的亞利桑那羊茅比較，帶菌植株的凈光合速率和胞間CO2濃度都有升高趨勢，而胞間CO2濃度的增加可能與內(nèi)生真菌的呼吸作用相關(guān)，間接的增加了E+植株的胞間CO2濃度，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。Amalric等[30]發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下內(nèi)生真菌可以顯著提高黑麥草(Loliumperenne)的氣孔導(dǎo)度，本試驗(yàn)中內(nèi)生真菌極顯著提高了布頓大麥的氣孔導(dǎo)度。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隨著堿濃度不斷升高葉綠素a、類胡蘿卜素和葉綠素b含量變化均總體呈下降趨勢(圖1)。葉綠素和類胡蘿卜素是光合作用相關(guān)的主要色素，其含量的變化對布頓大麥植株的耐堿性顯得至關(guān)重要。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)E+植株的葉綠素和類胡蘿卜的含量在各處理組均高于E-植株，任安芝等[31]發(fā)現(xiàn)隨著干旱脅迫的程度增加，內(nèi)生真菌促進(jìn)了黑麥草的葉綠素和類胡蘿卜素的產(chǎn)生，本試驗(yàn)結(jié)果與之一致。說明在外界堿脅迫達(dá)到一定程度，已經(jīng)開始影響宿主植物的光合作用，內(nèi)生真菌會發(fā)揮其保護(hù)作用，維持植物體內(nèi)的色素平衡，使植株更好的面對脅迫環(huán)境。

SOD，CAT和POD等幾種酶共同構(gòu)成了植物體內(nèi)的抗氧化酶保護(hù)系統(tǒng)，這幾種酶相互協(xié)調(diào)作用將直接影響植物對不良環(huán)境的抵抗能力[32]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隨著堿濃度的增大，E+植株的抗氧化酶的活性均高于E-植株，Zhang等[33]發(fā)現(xiàn)水分脅迫下披堿草(ElymusdahuricusTurcz.)E+植株的抗氧化酶活性高于E-植株。王正鳳等[34]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌感染野大麥(Hordeumbrevisubulatium(Trin.)Link)會提高抗氧化酶的活性從而提高野大麥植株的抗鹽性，本研究結(jié)果與其一致。有報道指出，內(nèi)生真菌影響宿主植物的抗逆性是因?yàn)閮?nèi)生真菌可以產(chǎn)生活性氧(ROS)刺激植物產(chǎn)生更多的抗氧化劑保護(hù)共生體免受氧化脅迫的傷害[35]。由此可見，布頓大麥內(nèi)生真菌也能刺激宿主產(chǎn)生更多活性氧，進(jìn)而刺激宿主布頓大麥分泌更多抗氧化劑而幫助其提高耐堿性。

到目前為止，有大量報道證明脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和植物的抗逆有關(guān)[34,36-37]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著堿濃度不斷增大布頓大麥植株脯氨酸含量不斷升高，并且E+植株的脯氨酸含量高于布頓大麥E-植株(圖3a)，這一結(jié)果與王正鳳等[34]內(nèi)生真菌感染可導(dǎo)致野大麥葉內(nèi)脯氨酸含量顯著增加，從而有效減輕野大麥在高濃度鹽脅迫下所受的傷害研究結(jié)果一致；隨著堿濃度的增大布頓大麥E+植株的可溶性蛋白含量呈上升趨勢(圖3b)，與鮑根生等[38]發(fā)現(xiàn)在銹病脅迫下內(nèi)生真菌感染布頓大麥可以提高其可溶性蛋白的含量結(jié)論一致；布頓大麥E+植株的可溶性糖含量隨堿濃度增加呈上升趨勢，并且E+植株的可溶性糖含量顯著高于E-植株(圖3c)，這一結(jié)果與王正鳳等[34]內(nèi)生真菌感染提高了野大麥可溶性糖的含量，進(jìn)而提高了野大麥葉片的滲透調(diào)節(jié)能力并增強(qiáng)其耐鹽能力相吻合?？偟膩碚f內(nèi)生真菌感染布頓大麥可以使其在堿脅迫下積累更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，從而更好的適應(yīng)脅迫環(huán)境。

細(xì)胞膜的穩(wěn)定性可用來判斷不同植物的抗逆性，丙二醛和葉片相對電導(dǎo)率是衡量膜脂過氧化作用強(qiáng)弱的重要指標(biāo)。隨著堿濃度不斷加劇布頓大麥葉片相對電導(dǎo)率變化呈現(xiàn)出先增后降趨勢，并且E+植株的葉片相對電導(dǎo)率顯著低于E-植株(圖4a)。內(nèi)生真菌感染降低了布頓大麥植株葉片相對電導(dǎo)率，從而降低了植株細(xì)胞膜的通透性，其結(jié)果與緱小媛[39]研究結(jié)果一致，即鹽脅迫下內(nèi)生真菌感染可以降低醉馬草葉片相對電導(dǎo)率進(jìn)而減輕鹽脅迫對細(xì)胞膜的傷害；隨著堿濃度的增大，布頓大麥E-植株葉片丙二醛的含量逐漸升高，說明堿脅迫下增加了植株體內(nèi)丙二醛含量，但E+植株葉片丙二醛的含量隨著堿濃度的增大總體呈現(xiàn)一個先升后降的趨勢，并且E+植株的丙二醛含量顯著低于E-植株，試驗(yàn)結(jié)果與鄒暉等[40]的研究結(jié)果相吻合，即干旱脅迫下內(nèi)生真菌感染鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)可以降低其體內(nèi)丙二醛的積累。說明內(nèi)生真菌感染宿主植物，可以緩解宿主植物在堿脅迫下的膜脂過氧化作用，維持了細(xì)胞膜的完整性。

4 結(jié)論

本研究探索了堿脅迫下內(nèi)生真菌對布頓大麥光合性能和生理特性的影響，通過指標(biāo)測定發(fā)現(xiàn)堿脅迫下內(nèi)生真菌可以提高布頓大麥的光合能力，并且可以提高宿主抗氧化酶的活性來消除活性氧的傷害，并促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累來調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，還能降低布頓大麥的葉片相對電導(dǎo)率和丙二醛含量緩解堿脅迫下的膜脂過氧化作用，維持細(xì)胞的完整性。綜上所述，該布頓大麥內(nèi)生真菌可以通過改善宿主的理化指標(biāo)和光合特性指標(biāo)來提高其抗堿性。