草地早熟禾蛋白激酶OSK4基因的克隆及對(duì)非生物脅迫響應(yīng)分析

陳 陽(yáng)， 高巖松， 李洪影， 趙清峰， 曹業(yè)萍， 邸浩洋， 金一鋒*

(1.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006； 3.齊齊哈爾大學(xué)理學(xué)院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

草坪草在自然界中面臨著干旱、鹽分、氮、磷脅迫等多種非生物逆境脅迫，植物可啟動(dòng)自身的防御機(jī)制，以適應(yīng)及抵抗逆境脅迫，蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化過(guò)程是植物響應(yīng)環(huán)境脅迫信號(hào)的重要機(jī)制[1-2]。蛋白激酶(Protein kinase)是植物中一種重要的調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)膜受體蛋白感知環(huán)境信號(hào)，激活不同的蛋白磷酸化途徑，調(diào)節(jié)下游抗逆基因的表達(dá)，進(jìn)而抵抗逆境脅迫所帶來(lái)的傷害。近年來(lái)，許多研究報(bào)道了與抗性相關(guān)的蛋白激酶，即受體蛋白激酶(Receptor-like protein kinases，RLK)、絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)、鈣依賴(lài)性蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases，CDPK)和蔗糖非發(fā)酵蛋白1(Sucrose non-fermenting 1，SNF1)激酶家族[3-6]。蔗糖非發(fā)酵1相關(guān)蛋白激酶SnRKs(Sucrose non-fermenting-1 related protein kinases)屬于絲氨酸/蘇氨酸Ser/Thr蛋白激酶(Serine/ threonine protein kinase)。

植物中SnRK家族已經(jīng)擴(kuò)展并分化為三個(gè)亞科：SnRK1(結(jié)構(gòu)和功能上與SNF1和AMPK最相似)、SnRK2和SnRK3[7]。SnRK1蛋白激酶與酵母SNF1和哺乳動(dòng)物中AMPK蛋白激酶高度同源，主要參與碳氮反應(yīng)代謝和能量感應(yīng)[6]，SnRK1在調(diào)節(jié)生物和非生物脅迫反應(yīng)以及植物生長(zhǎng)發(fā)育也起著關(guān)鍵作用[8]。而SnRK2和SnRK3家族基因在信號(hào)通路和基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用[9]，例如SnRK2s主要在ABA信號(hào)通路中發(fā)揮作用，SnRK3s在Ca2+信號(hào)作用下與CBL蛋白相互作用，調(diào)節(jié)各種應(yīng)激反應(yīng)[10-11]。

SnRK1基因家族是一個(gè)相對(duì)較小的亞家族，SnRK1基因已經(jīng)從許多植物中分離出來(lái)，SnRK1是由一個(gè)催化亞基和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基組成的異源三聚體復(fù)合物。研究證明，SnRK1可以調(diào)節(jié)蔗糖合成酶和ADP葡萄糖焦磷酸化酶基因表達(dá)，有助于馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)塊莖中的淀粉生物合成[12]，SnRK1在水稻(Oryzasativa)、高粱(Sorghumbicolor)籽粒以及大麥(Hordeumvulgare)的花粉中起著類(lèi)似的作用[13-14]。水稻包含4個(gè)SnRK1基因家族，根據(jù)氨基酸序列的相似性和表達(dá)模式，將其分為SnRK1a 和SnRK1b兩個(gè)亞家族，其中OSK4和OSK35屬于SnRK1b亞家族[15]。研究證明，水稻萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中SnRK1a蛋白激酶在糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用[16]。Thelander等研究表明，SnRK1在植物應(yīng)對(duì)光周期生長(zhǎng)的代謝過(guò)程中起到一定作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，水稻OSK4激酶可以與調(diào)節(jié)因子HDR1聯(lián)合控制光周期開(kāi)花[18]，OSK35是水稻抗病性的正調(diào)控因子[19]。番茄(Lycopersiconesculentum)冷誘導(dǎo)基因ShCIGT可通過(guò)與SnRK1的相互作用提高番茄的非生物脅迫耐受性[20]。植物生長(zhǎng)過(guò)程中SnRK1蛋白激酶和脫落酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因之間相互作用顯著[21]。綜上可見(jiàn)，SnRK1家族基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性中起著重要作用。

草地早熟禾(PoapratensisL.)是多年生冷季型草坪草，其具有葉色濃綠、坪觀質(zhì)量良好、耐低溫等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于我國(guó)北方地區(qū)的園林建設(shè)[22]。針對(duì)禾本科草坪草的SnRK家族基因功能的研究甚少，研究草地早熟禾SnRK1b亞家族OSK4基因的非生物脅迫表達(dá)模式，將豐富草坪草SnRK1抗逆機(jī)制的相關(guān)研究。本研究克隆得到草地早熟禾O(píng)SK4基因，進(jìn)行了典型結(jié)構(gòu)域、同源進(jìn)化關(guān)系、理化性質(zhì)等生物信息學(xué)分析，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法觀測(cè)不同組織特異性及非生物脅迫下的表達(dá)機(jī)制，為進(jìn)一步研究其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理方法

試驗(yàn)于2021年1—6月在齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院園林遺傳育種研究室進(jìn)行，試驗(yàn)供試材料為草地早熟禾‘午夜2號(hào)’品種。挑選飽滿(mǎn)的種子將其置于培養(yǎng)土中(壤土∶細(xì)沙∶蛭石=3∶1∶1)，播種量為12 g·m-2，將其放置光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件參數(shù)設(shè)置為：晝夜溫度為25℃/15℃，相對(duì)濕度60%，光/暗為14 h/10 h，光照強(qiáng)度為600 μmol·m-2·s-1，待培養(yǎng)3個(gè)月后進(jìn)行取樣及誘導(dǎo)處理。

選取生長(zhǎng)健康、長(zhǎng)勢(shì)一致的草地早熟禾植株，將其根部洗凈后置于沙子中，每日向直徑為19.5 cm，高度為14 cm的盆中澆灌1/2 Hoagland水培營(yíng)養(yǎng)液，待培養(yǎng)14 d后進(jìn)行不同干旱、氮素、磷濃度溶液處理。具體處理分組為：(1)將10% PEG6000(Polyethylene glycol)加入1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中，對(duì)植株進(jìn)行模擬干旱處理，干旱誘導(dǎo)時(shí)間分別為：0 h，2 h，16 h，對(duì)其葉部及根部進(jìn)行取樣，置于—80℃保存;(2)采用NaNO3為氮源，配置3種不同濃度(0 mM，1.5 mM，15 mM)NaNO3的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(見(jiàn)表1)，每天每盆一次性澆灌400 mL培養(yǎng)液，處理21 d后取樣，置于-80℃保存。(3)采用磷酸二氫鉀KH2PO4為磷源，配置3種不同濃度的KH2PO4的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(見(jiàn)表2)，KH2PO4濃度分別為0 mM，0.01 mM，1 mM，每天澆灌1次400 mL培養(yǎng)液，處理21 d后取葉樣，置于-80℃保存。

表1 不同氮濃度的營(yíng)養(yǎng)液Table 1 Nutrient solutions with different nitrogen concentration

表2 不同磷濃度的營(yíng)養(yǎng)液Table 2 Nutrient solutions with different phosphorus concentration

1.2 草地早熟禾O(píng)SK4基因的克隆

選取健康的草地早熟禾植株進(jìn)行總RNA的提取，具體方法參照植物總RNA提取試劑盒(TianGen，Beijing)，采用超微量熒光全功能分光光度計(jì)(DeNovix，USA)進(jìn)行總RNA濃度、純度的檢測(cè)，利用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA完整性。待草地早熟禾總RNA檢測(cè)合格后，以其為模板，采用PrimeScriptTMII 1 st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa，Japan) 獲得草地早熟禾cDNA，用于后續(xù)OSK4基因克隆。根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的草地早熟禾相關(guān)基因序列為基礎(chǔ)，并結(jié)合Genebank公布的二穗短柄草OSK4(OX_024312805.1)、節(jié)節(jié)麥OSK4(XP_02018300.1)，設(shè)計(jì)特異性引物pPOSK4-F,pPOSK4-R引物序列見(jiàn)表3。草地早熟禾cDNA為模板，利用特異性引物pPOSK4-F/R,2xEs Taq MasterMix(CWBIO，CW0690)進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min后，94℃變性30 s、退火56℃ 30 s、延伸72℃ 30 s，共32個(gè)循環(huán)，最終延伸72℃ 2 min，獲得草地早熟禾O(píng)SK4基因序列。特異性引物的合成和PCR產(chǎn)物的測(cè)序均由生工生物工程股份有限公司(上海)完成。

1.3 草地早熟禾O(píng)SK4基因生物信息學(xué)分析

利用NCBI-CDD在線工具分析草地早熟禾O(píng)SK4蛋白保守結(jié)構(gòu)功能域；利用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，比對(duì)其同源性；利用ClustalW進(jìn)行多物種OSK4編碼氨基酸同源性比對(duì)分析；利用ProtParam分析OSK4編碼氨基酸的基本理化性質(zhì)；利用SOPMA在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)草地早熟禾O(píng)SK4基因

本研究分別提取草地早熟禾植株不同部位的RNA，選取部位分別為：根部、莖部、葉部、穗。提取PEG6000模擬干旱處理的植株葉部、根部的RNA，提取氮、磷脅迫后的草地早熟禾葉部RNA。待RNA純度、濃度檢測(cè)合格后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為qRT-PCR模板。采用qRT-PCR相對(duì)定量方法，參照TB GreenTMPremix Ex TaqTMII進(jìn)行試驗(yàn)。qRT-PCR反應(yīng)體系為50 μL，包含：4 μL cDNA，2 μL Q-OSK4-F,2 μL Q-OSK4-R，17 μL ddH2O，25 μL TB Green Premix Ex Taq II。PCR條件為：PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s,60℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)。選擇UBQ為內(nèi)參基因，Q-UBQ-F,Q-UBQ-R引物見(jiàn)表3。該試驗(yàn)生物學(xué)重復(fù)3次，試驗(yàn)重復(fù)3次，利用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)。

表3 所需RT-PCR及qRT-PCR引物Table 3 RT-PCR and QRT PCR primers

2 結(jié)果與分析

2.1 草地早熟禾O(píng)SK4基因編碼區(qū)克隆及生物信息學(xué)分析

RNA凝膠電泳圖結(jié)果顯示28S和18S兩條條帶清晰且比值大于1(圖1)，RNA吸光值OD260/280為1.95，可見(jiàn)，此RNA符合后續(xù)試驗(yàn)要求，保存到—80℃冰箱中備用。利用設(shè)計(jì)的特異性引物OSK4-F/R及草地早熟禾cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，圖2為PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖1 草地早熟禾總RNA瓊脂糖凝膠的電泳圖Fig.1 Total RNA agarose gel electrophoresis picture of kentucky bluegrass

圖2 草地早熟禾O(píng)SK4基因PCR電泳圖Fig.2 PCR electrophoresis of OSK4 gene in kentucky bluegrass

利用NCBI在線分析，草地早熟禾O(píng)SK4基因序列長(zhǎng)度為1 915 bp，ORF包含1 530 bp，共編碼509個(gè)氨基酸。NCBI-CDD在線分析結(jié)果表明，該蛋白為STKc_AMPK_alpha and AMPKA_C典型結(jié)構(gòu)域蛋白，包含典型的結(jié)構(gòu)域STKc_ AMPK_alpha，UBA_SnRK1_plant和AMPKA_C(圖3)。利用MEGA7.0對(duì)多物種OSK4編碼氨基酸進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，發(fā)現(xiàn)草地早熟禾O(píng)SK4編碼氨基酸與二穗短柄草、小麥、節(jié)節(jié)麥OSK4編碼氨基酸同源性最高，分別為94.5%，94.11%，93.91%(圖4)。利用在線軟件MEME進(jìn)行OSK4保守序列區(qū)域分析，MEME設(shè)置成15個(gè)保守基序進(jìn)行比較，由圖4可知出草地早熟禾與水稻、二穗短柄草、節(jié)節(jié)麥等禾本科植物的OSK4蛋白結(jié)構(gòu)域非常相似，同時(shí)可以看到禾本科植物的OSK4與OSK3高度相似。草地早熟禾O(píng)SK4與小麥、節(jié)節(jié)麥、二穗短柄草OSK4氨基酸序列進(jìn)行多序列比較，發(fā)現(xiàn)其包含ATP binding site，Active site，Activation loop結(jié)合位點(diǎn)，及heterotrimer interface，beta subunit interface，gamma subunit interface三種典型的多肽位結(jié)合位點(diǎn)等位置(圖5)。

圖3 草地早熟禾O(píng)SK4的CDD結(jié)構(gòu)域Fig.3 Conserved Domain Database of OSK4 in kentucky nluegrass

圖4 草地早熟禾O(píng)SK4氨基酸序列的進(jìn)化樹(shù)及MEME分析Fig.4 Phylogenetic tree and MEME analysis of amino acid sequence of OSK4 in kentucky bluegrass

圖5 不同植物的OSK4氨基酸多序列比對(duì)圖Fig.5 Comparison of OSK4 amino acid sequences of different plants注：#代表ATP binding site [化學(xué)結(jié)合位點(diǎn)]，藍(lán)色線代表active site [活性位點(diǎn)]，綠色線代表heterotrimer interface [多肽結(jié)合位點(diǎn)]，紫色框代表activation loop (A-loop)，綠色框代表beta subunit interface [多肽結(jié)合位點(diǎn)]，紅色線代表gamma subunit interface [多肽結(jié)合位點(diǎn)]Note：# represents ATP binding site [chemical binding site],blue line represents active site [active site],The green line represents the heterotrimer interface [Polypeptide binding site],the purple box represents the activation loop (A-loop),The green box represents beta Subunit Interface [Polypeptide Binding site] and the red line represents Gamma Subunit Interface [Polypeptide binding site]

利用Netphos對(duì)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)草地早熟禾O(píng)SK4氨基酸磷酸化位點(diǎn)含有18個(gè)Serine(絲氨酸)、9個(gè)Threonine(蘇氨酸)和6個(gè)Tyrosine(酪氨酸)。利用Wolf-Psort亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，分析結(jié)果顯示草地早熟禾O(píng)SK4定位于細(xì)胞質(zhì)中。利用SOPMA程序?qū)SK4蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析(見(jiàn)圖6)，結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋(35.17%)、不規(guī)則卷曲(40.47%)、β-轉(zhuǎn)角(6.09%)和延伸鏈(18.27%)共同構(gòu)成。利用SWISS-MODEL在線軟件對(duì)OSK4蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模(見(jiàn)圖7)，發(fā)現(xiàn)草地早熟禾O(píng)SK4蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)中主要由α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲4個(gè)部分組成，與蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。

圖6 草地早熟禾O(píng)SK4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 Secondary structure of OSK4 protein in kentucky bluegrass注：圖中藍(lán)色表示α-螺旋、紅色表示延伸鏈、綠色表示β-轉(zhuǎn)角、紫色表示不規(guī)則卷曲Note:In the figure,blue represents α-helix,red represents extended chain,green represents β-corner,and purple represents irregular curl

圖7 草地早熟禾O(píng)SK4蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.7 Tertiary structure of OSK4 protein in kentucky bluegrass

2.2 草地早熟禾O(píng)SK4基因表達(dá)水平的分析

2.2.1草地早熟禾O(píng)SK4基因組織特異性 由圖8a可知，草地早熟禾O(píng)SK4基因在不同組織部位中表達(dá)量差異顯著(P<0.05)，OSK4基因相對(duì)表達(dá)量高低順序?yàn)椋焊?莖部>穗>葉部，其中根部表達(dá)量最高，葉部表達(dá)量最低，根部是葉部的3.87倍。

2.2.2干旱脅迫對(duì)草地早熟禾O(píng)SK4基因表達(dá)水平的影響 本研究利用10%PEG6000模擬干旱脅迫處理草地早熟禾植株，檢測(cè)干旱脅迫對(duì)草地早熟禾根部、葉部OSK4基因表達(dá)水平的影響，由圖8b可知，干旱脅迫顯著降低草地早熟禾根部、葉部OSK4基因的相對(duì)表達(dá)量。10% PEG6000模擬干旱期間，草地早熟禾根中OSK4基因相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先極速下降后上升的趨勢(shì)，OSK4基因相對(duì)表達(dá)量為：0 h>16 h>2 h，2 h的OSK4表達(dá)量?jī)H為0 h的24.59%，16 h的OSK4相對(duì)表達(dá)量是0 h的34.65%。10% PEG6000模擬干旱期間，草地早熟禾葉中OSK4基因呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)，OSK4基因相對(duì)表達(dá)量大小順序?yàn)椋? h>2 h>16 h，16 h的OSK4表達(dá)量為0 h的43.44%。

2.2.3氮素脅迫對(duì)草地早熟禾O(píng)SK4基因表達(dá)水平的影響 本研究利用NaNO3水培液處理草地早熟禾植株，觀測(cè)不同氮素濃度誘導(dǎo)對(duì)草地早熟禾植株中OSK4基因表達(dá)水平的影響。由圖8-c可知，不同梯度氮素濃度處理顯著影響草地早熟禾O(píng)SK4基因的相對(duì)表達(dá)量(P<0.05)，OSK4基因相對(duì)表達(dá)量大小順序?yàn)椋?5 mM NaNO3>1.5 mM NaNO3>0 mM NaNO3，草地早熟禾O(píng)SK4基因表達(dá)水平隨著NaNO3濃度的增加而呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。

2.2.4磷素脅迫對(duì)草地早熟禾O(píng)SK4基因表達(dá)水平的影響 本研究利用KH2PO4水培液處理草地早熟禾植株，觀測(cè)不同磷濃度誘導(dǎo)對(duì)草地早熟禾植株中OSK4基因表達(dá)水平的影響。由圖8-d可知，不同KH2PO4濃度處理液對(duì)草地早熟禾O(píng)SK4基因相對(duì)表達(dá)量影響顯著(P<0.05)，OSK4基因相對(duì)表達(dá)量大小順序?yàn)椋?.01 mM KH2PO4>0 mM KH2PO4>1 mM NaNO3。草地早熟禾O(píng)SK4基因的表達(dá)水平隨著KH2PO4濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，0.01 mM KH2PO4處理組中OSK4基因的相對(duì)表達(dá)量分別是0 mM KH2PO4和1 mM KH2PO4的1.82倍和1.56倍?？梢?jiàn)，低磷環(huán)境(0.01 mM KH2PO4)可促進(jìn)草地早熟禾O(píng)SK4基因的表達(dá)。

圖8 草地早熟禾O(píng)SK4基因在組織部位及非生物脅迫下的表達(dá)水平分析圖Fig.8 Expression level analysis of OSK4 gene in Kentucky Bluegrass under tissue and abiotic stress注：不同小寫(xiě)字母表示不同組織部位、氮素溶液、磷素溶液中該基因的表達(dá)量在0.05水平上差異顯著，*表示不同干旱脅迫時(shí)間中該基因的表達(dá)量在0.05水平上差異顯著Note:Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level,* indicates significant difference at the 0.05 level

3 討論

3.1 SnRK1家族基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻和大麥基因組數(shù)據(jù)表明，在水稻中鑒定了50個(gè)SnRK基因(4個(gè)OsSnRK1,11個(gè)OsSnRK2和35個(gè)OsSnRK3)，在擬南芥中鑒定了39個(gè)(3個(gè)AtSnRK1,10個(gè)AtSnRK2和26個(gè)AtSnRK3)，在大麥中發(fā)現(xiàn)了50個(gè)(6個(gè)HvSnRK1亞家族，10個(gè)屬于HvSnRK2，34個(gè)屬于HvSnRK3)[23-24]。研究者將大麥SnRK1亞家族基因劃分為3個(gè)子類(lèi)，包括SnRK1a(SnRK1.1和1.2)、SnRK1b(SnRK1.3和1.4)和SnRK1b*(SnRK1.5和1.6)[23]。通常SnRK1的基因?qū)嶋H上編碼了一個(gè)異三體蛋白的催化亞單位，AMPK也包含三個(gè)亞基，一個(gè)催化亞基α亞單位和附件β以及γ亞單位[6]。因此，SnRK1基因有時(shí)被稱(chēng)為AMPKα，催化劑α亞基包含一個(gè)高度保守的N-末端催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)可變的C-末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，這對(duì)于形成復(fù)雜的相互作用(與β以及γ亞單位)并調(diào)節(jié)激酶活性，與SnRK1不同，其他兩個(gè)亞科(SnRK2s和SnRK3s)在植物中是獨(dú)特的[25]。本研究發(fā)現(xiàn)草地早熟禾SnRK1b亞家族OSK4編碼氨基酸具有STKc_AMPK_alpha，UBA_ SnRK1_plant和AMPKA_C典型的結(jié)構(gòu)域，同時(shí)，草地早熟禾O(píng)SK4編碼氨基酸包含典型的多肽位結(jié)合位點(diǎn)，與圖5中小麥、山羊草、二穗短柄草OSK4編碼氨基酸特征一致，可見(jiàn)禾本科物種之間OSK4典型結(jié)構(gòu)域高度相似度，SnRK1氨基酸結(jié)構(gòu)較為保守。

3.2 草地早熟禾O(píng)SK4基因組織特異性分析

有研究表明水稻OSK4基因在未成熟的水稻種子中相對(duì)表達(dá)量最高[26]，其次是在其圓錐花序、葉鞘、根部，在萌發(fā)的種子及葉部中相對(duì)表達(dá)量最少[13]。本研究中草地早熟禾根部OSK4相對(duì)表達(dá)量顯著高于葉部，這與水稻相應(yīng)研究結(jié)果相似[13]。水稻OSK4基因在不同部位的表達(dá)模式，可能與發(fā)育期穎果和發(fā)生庫(kù)源轉(zhuǎn)換的葉鞘中的蔗糖和淀粉代謝密切相關(guān)[13]。陳潤(rùn)娟研究發(fā)現(xiàn)根莖是草地早熟禾儲(chǔ)存碳水化合物的主要場(chǎng)所，不同部位碳水化合物含量為根莖>莖基>葉片，這與本研究的OSK4在不同組織部位中的相對(duì)表達(dá)量趨勢(shì)相似[27]。草地早熟禾O(píng)SK4基因在不同部位的表達(dá)水平可能與碳水化合物代謝過(guò)程有關(guān)，如蔗糖和淀粉代謝，但仍需進(jìn)一步研究。

3.3 逆境脅迫對(duì)OSK4基因表達(dá)模式的影響

Samarina研究發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)SnRK1b基因隨著干旱程度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，相對(duì)表達(dá)量的變化為：12 h>6 h>24 h>0 h>3 h>48 h[28]。本研究中草地早熟禾葉部OSK4表達(dá)水平與干旱脅迫程度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，干旱脅迫顯著降低草地早熟禾根部、葉部OSK4基因的相對(duì)表達(dá)量，可見(jiàn)，根部受干旱脅迫抑制程度更高。針對(duì)大麥SnRK家族基因的啟動(dòng)子的研究發(fā)現(xiàn)，HvSnRK1.6基因啟動(dòng)子中包含與干旱相關(guān)的調(diào)控元件[23]。蛇舌草(Hedychiumcoronarium)HcSnRK1.3，HcSnRK1.4基因啟動(dòng)子中也包含與干旱相關(guān)的調(diào)控元件[29]。植物SnRK1家族基因積極響應(yīng)干旱脅迫，可能與其啟動(dòng)子包含干旱脅迫調(diào)控元件有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，SnRK1家族基因與植物氮吸收、氮代謝過(guò)程有一定的關(guān)聯(lián)性。Wang等研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)番茄SnRK1基因有利于其碳同化、氮吸收和果實(shí)發(fā)育過(guò)程[30]。Sanagi等研究發(fā)現(xiàn)小麥胚中氮代謝相關(guān)的天冬酰胺合成酶基因表達(dá)水平隨著硫水平的下降而上調(diào)，SnRK1參與這個(gè)調(diào)控過(guò)程[31]。在低氮環(huán)境下擬南芥SnRK1激酶活性下調(diào)，可直接磷酸化成花基因BHLH4，而SnRK1在高氮條件下負(fù)調(diào)控下游成花基因FT的轉(zhuǎn)錄水平[32]?？梢?jiàn)，SnRK1與植物的氮素調(diào)控存在一定的關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)，NaNO3濃度的增加可以提高OSK4基因的相對(duì)表達(dá)量，葉部OSK4表達(dá)水平與氮素濃度程度呈正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)番茄處于磷酸鹽(Pi)饑餓環(huán)境中，番茄SlSnRK3.10a,SlSnRK3.15a和SlSnRK3.26可被激活[33]，磷脅迫顯著影響SnRK家族基因的表達(dá)。有關(guān)于SnRK家族基因響應(yīng)磷脅迫的研究報(bào)道較少，本研究發(fā)現(xiàn)草地早熟禾O(píng)SK4基因適應(yīng)磷脅迫的表達(dá)模式與氮脅迫的表達(dá)不同，草地早熟禾O(píng)SK4基因表達(dá)水平隨著KH2PO4濃度的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，低磷環(huán)境(0.01 mM KH2PO4)可促進(jìn)草地早熟禾O(píng)SK4基因的表達(dá)。

4 結(jié)論

本研究利用RT-PCR方法克隆獲得草地早熟禾SnRK1亞家族OSK4基因，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)禾本科植物的OSK4蛋白具有較高的保守性。草地早熟禾中OSK4基因的相對(duì)表達(dá)量存在組織特異性，抵御干旱脅迫時(shí)OSK4基因在根部、葉部存在不同的響應(yīng)機(jī)制，SnRK家族基因在協(xié)調(diào)植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的作用仍需進(jìn)一步研究。草地早熟禾O(píng)SK4基因?qū)Φ?、磷脅迫環(huán)境中響應(yīng)較為敏感，氮素濃度與其表達(dá)量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，低磷處理(0.01 mM KH2PO4)促進(jìn)OSK4基因上調(diào)表達(dá)。后續(xù)研究可進(jìn)一步挖掘草坪草SnRK家族基因在植物能量代謝、穩(wěn)定碳氮平衡中的作用，為草地早熟禾抗逆機(jī)理的進(jìn)一步研究奠定一定理論依據(jù)。