Hippo 信號通路在大白豬不同直徑卵泡中的表達特征研究

周 梅,徐成良,王潔茹,李小金,張 威,儲明星,王重龍*

(1 安徽省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,豬分子數(shù)量遺傳學安徽省農(nóng)業(yè)科學院重點實驗室,畜禽產(chǎn)品安全工程安徽省重點實驗室,合肥 230001；2 中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物遺傳育種與繁殖(家禽)重點實驗室,北京 100193)

產(chǎn)仔數(shù)性狀是豬最重要的經(jīng)濟性狀之一,與豬場的效益直接相關。然而,涉及產(chǎn)仔數(shù)的生理調控機制非常復雜,包括卵泡發(fā)育-排卵-分娩等一系列環(huán)節(jié)[1]。據(jù)報道,排卵數(shù)對豬的產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)具有決定性的影響,而哺乳動物原始卵泡的數(shù)量在出生后就已確定且不再發(fā)生改變,卵泡發(fā)育以一批接著一批卵泡波的形式相繼生長和退化,只有發(fā)育成熟的卵泡才能到達排卵位置[2-3]。早在1990年,李汝敏等[4]對高產(chǎn)的二花臉豬研究發(fā)現(xiàn),正常的等級卵泡在總卵泡中所占的比例與豬的產(chǎn)仔數(shù)直接相關,但至今豬卵泡發(fā)育的調控機制仍不夠明晰,故對其調控通路進行研究對于其機制的闡明至關重要。

近年來有研究顯示,Hippo 信號通路可能在哺乳動物卵泡發(fā)育中可能發(fā)揮潛在調控作用,且該通路在物種間高度保守[5]。Xiang 等[6]研究發(fā)現(xiàn),Hippo 通路的核心組分哺乳動物不育系20 樣激酶1(Mammalian sterile 20-like kinase 1,MST1)、大腫瘤抑制激酶2(Large tumor suppressor kinase 1,LATS2)以及YAP的表達隨著小鼠的卵泡發(fā)育而發(fā)生改變,尤其是在原始卵泡激活前后變化顯著,且與原始卵泡池的大小具有時空相關性。Sun 等[7]研究發(fā)現(xiàn),小鼠卵母細胞在排卵前通過抑制Hippo 組分的表達來誘導顆粒細胞增殖,在排卵期間又通過及時激活Hippo 信號傳導活性促進顆粒細胞分化,說明Hippo 信號通路在小鼠顆粒細胞的增殖和分化中均發(fā)揮重要作用。有報道稱,Hippo 信號通路成員MST1∕2、LATS1∕2 以及YAP在綿羊睪丸成熟過程中表達量逐漸增加,且在射出的精子中高度表達,表明該通路在雄性哺乳動物青春期發(fā)育及精子發(fā)生過程中也發(fā)揮著重要作用[8]。Hippo 信號通路影響小鼠卵泡發(fā)育,但是其確切作用仍然未知,在體外或體內滅活小鼠顆粒細胞中的LATS1∕2 會導致顆粒細胞形態(tài)、功能和基因表達的喪失[9]。本試驗以大白豬為對象,研究Hippo 信號通路在其不同直徑卵泡中的表達特征,以期為闡明豬的卵泡發(fā)育調控機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和處理

從長豐農(nóng)牧屠宰場現(xiàn)場采集大白豬新鮮卵巢組織,置于4 ℃無菌的PBS 溶液中盡快帶回實驗室,清洗處理后置于無菌的0.9% NaCl 溶液中。用10 mL 無菌注射器抽取不同直徑卵泡液(小卵泡,＜3 mm；中卵泡,3—5 mm；大卵泡,＞5 mm),經(jīng)400 目(孔徑425 μm)篩網(wǎng)過濾后收集細胞混合液,800 r∕min 離心5 min 后取細胞沉淀,用TRizol 和試劑盒法對不同直徑卵泡細胞進行總RNA 提取,用Nanodrop 2000 核酸測定儀對各RNA 樣品的純度和濃度進行測定,然后置于-80 ℃冰箱備用。

1.2 引物設計

根據(jù)GenBank 提供的豬LATS1、LATS2、MOB1、MST1、MST2、SAV1 以及YAP基因mRNA 序列(登錄號依次為XM_005659149.3、XM_021065128.1、NM_001179454.1、XM_003132215.4、NM_001019167.2、XM_001927720.7 和XM_021062706.1)為模板,利用Primer 3 在線軟件進行跨外顯子引物設計,以β-actin(登錄號為NM_001009784)作為內參基因。引物由合肥欣捷智生物技術有限公司合成,具體信息見表1。

1.3 反轉錄和qPCR 反應

利用TAKARA 反轉錄試劑盒先去除基因組DNA 后再進行反轉錄反應,去除基因組DNA 的體系(50 μL)和反應條件為:5 ×gDNA Eraser Buffer 10.0 μL,gDNA Eraser 5.0 μL,Total RNA 2.5 μg,再用RNase Free dH2O 補至總體積50 μL,42 ℃反應2 min；反轉錄體系(100 μL)和反應條件為去除gDNA 的反應液(50.0 μL),PrimeScript RT Enzyme Mix I 5 μL,RT Primer Mix 5 μL,5 ×PrimeScript Buffer 2 20 μL,RNase Free dH2O 20 μL；37 ℃15 min,85 ℃5 s,4 ℃保存。反轉錄產(chǎn)物進行5 倍稀釋后用于qPCR 反應,反應在Roche Light Cycler?R480 Ⅱ型熒光定量PCR 儀中進行,每個樣品重復檢測3 次。qPCR 體系(25.0 μL)和反應條件為:SYBR Premix Ex Taq II 12.5 μL,PCR Forward Primer 1.0 μL,PCR Reverse Primer 1.0 μL,cDNA 2.0 μL,dH2O 8.5 μL；95 ℃預變性5 s,95 ℃變性5 s,60 ℃30 s,40 個循環(huán)；反應結束后對熔解曲線進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法[10]對qPCR 結果中目的基因的相對表達量進行計算,利用SPSS 20 統(tǒng)計軟件按照分析-比較均值-單因素ANOVA 的方法對不同直徑卵泡之間各基因的表達量進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn),提取的不同直徑卵泡總RNA 完整性良好,無明顯降解,且濃度和純度均符合要求,可直接進行反轉錄。反轉錄成cDNA 后,同時用各基因對應的引物和β-actin引物進行qPCR 擴增,熔解曲線均為單峰,表明引物特異性很好,可用于后續(xù)的qPCR 試驗。根據(jù)qPCR 檢測結果對Hippo 信號通路(LATS1∕2、MOB1、MST1∕2、SAV1 和YAP)在不同直徑卵泡中的表達進行分析,具體結果見圖1。

圖1 Hippo 信號通路核心因子在不同直徑卵泡中的表達Fig.1 Expression of core factors of Hippo signaling pathway in follicles with different diameters

從圖1 可以看出,Hippo 信號通路的7 個核心因子在不同直徑豬卵泡中的表達均達到了差異顯著水平,其中LATS2 的表達量隨著卵泡直徑的增大極顯著增加(P＜0.01),而MOB1、MST1、MST2 以及YAP的表達量則隨著卵泡直徑的增大顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)下降。另外,LATS1 和SAV1 都是在中卵泡中表達量最高,顯著高于小卵泡和大卵泡(P＜0.05)。

3 討論與結論

哺乳動物卵泡發(fā)育過程受多條信號通路調控,如雌激素受體信號通路[11]、轉化生長因子β(Transforming growth factor β,TGFβ) 信 號 通 路[12]、TGFβ∕SMAD 信 號 通 路[13]、骨 形 成 蛋 白(Bone morphogenetic protein,BMP)∕SMAD 信號通路[14]、磷脂酰肌醇3 激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase,PI-3K)∕蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB)信號通路[15]以及Wnt 信號通路[16]等。Hippo 信號通路處于一個復雜的調控通路網(wǎng)絡之中,與TGFβ、BMP∕SMAD 以及Wnt 信號通路間均存在相互作用,暗示該通路可能在哺乳動物卵泡發(fā)育中也發(fā)揮著潛在的重要作用。目前,關于Hippo 信號通路在卵泡發(fā)育中作用的報道多集中在小鼠上[17],本研究是初次對Hippo 信號通路核心因子在豬卵泡發(fā)育過程中的表達特征進行分析,旨在探索影響卵泡發(fā)育的因素及可能的作用方式。

qPCR 結果表明,LATS1∕2、MOB1、MST1∕2、SAV1 以及YAP基因在豬不同直徑卵泡中的表達均達到了差異顯著水平,其中LATS2 基因在大、中、小卵泡之間的表達量差異均達到極顯著水平,且表達量隨著卵泡直徑的增大而增加,表明其可能通過增加自身的表達量來促進卵泡的生長。這與牛小天[18]在雞上報道的研究結果不太一致,可能是因為哺乳動物與家禽在生理生殖調控中存在較大差異有關。MOB1 基因在不同直徑卵泡中幾乎不表達,推測其可能在豬卵泡發(fā)育中作用不是最關鍵的。而MST1、MST2 以及YAP基因的表達特征均與LATS2 基因相反,推測它們表達的增加可能會抑制卵泡的生長。通過以上結果,可以推測Hippo 信號通路的LATS2、MOB1、MST1、MST2 以及YAP基因與豬的卵泡發(fā)育密切相關,但各核心因子的調控方式與在雞[18]和小鼠[19]等物種中的調控模式并不完全一致,具體的調控機制還需要進一步的驗證。下一步計劃將在體外培養(yǎng)的豬卵泡顆粒細胞中驗證各基因敲除或過表達對細胞增殖或凋亡等的影響,以明確其作用的分子機制。

本研究初步得出以下結論:Hippo 信號通路核心因子LATS2 在豬卵泡發(fā)育中發(fā)揮正調控作用,而MOB1、MST1、MST2 以及YAP則發(fā)揮著負調控作用。