棗多糖對(duì)小鼠派氏結(jié)和腸系膜淋巴細(xì)胞增殖的影響研究

劉鵬，馬紅梅，郭超炫，龐欣雨，宋博文，景瀟穎，潘嘉璐，郝艷霜，李樹(shù)鵬★，趙國(guó)先★

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北保定071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河北保定071001；3.西藏大學(xué)理學(xué)院，西藏拉薩850000）

棗是我國(guó)重要傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)食品，因富含糖類、蛋白質(zhì)、維生素等成分，也兼具藥用價(jià)值。 棗中多糖含量最為豐富，占干物質(zhì)的60%～80%[1]，據(jù)報(bào)道將棗多糖添加到日糧中，可影響IgA 形成的過(guò)程進(jìn)而有利于腸黏膜IgA 的大量生成，提高腸黏膜SIgA 的分泌量， 進(jìn)而緩解環(huán)磷酰胺對(duì)腸黏膜免疫屏障的損傷，并有效增強(qiáng)機(jī)體免疫[2]，但其通過(guò)何種途徑激活機(jī)體免疫系統(tǒng)尚不明確。研究認(rèn)為此類多糖分子進(jìn)入小腸后， 可以完整通過(guò)小腸特殊上皮細(xì)胞膜的內(nèi)吞作用跨膜進(jìn)入上皮細(xì)胞下的免疫組織，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，如對(duì)派氏結(jié)中巨噬細(xì)胞的作用， 進(jìn)而引發(fā)腸黏膜免疫反應(yīng)，并激活機(jī)體免疫系統(tǒng)[3,4]。 因此，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠派氏結(jié)和腸系膜淋巴細(xì)胞，觀察棗多糖對(duì)其增殖率的影響，探討棗多糖激活機(jī)體免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與動(dòng)物

棗多糖： 本實(shí)驗(yàn)室自制， 從金絲小棗中提取、精制獲得[5]，得到JP60、JP70、JP80、JP90 共4個(gè)組分。

6 周齡SPF 級(jí)昆明小鼠（NO.110），體重為（21±5）克，雌性，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

95%乙醇、氯仿、正丁醇、D900 大孔陰離子吸附樹(shù)脂、RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖 液（FBS）、LPS、臺(tái) 盼 藍(lán)、青／鏈霉素等均為常用試劑；DG-5032 型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司；二氧化碳培養(yǎng)箱， 德國(guó)賀利氏；TD-4 臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 淋巴細(xì)胞的分離與鑒定

將脫頸處死小鼠于75%乙醇浸泡5～10 分鐘，無(wú)菌剖開(kāi)腹腔， 取適量小腸派氏結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)于培養(yǎng)皿中，去除脂肪和筋膜組織并用PBS沖洗；將選取組織剪成小塊，注射器芯擠壓，PBS沖洗并過(guò)200 目濾網(wǎng)，即得淋巴細(xì)胞混懸液。

淋巴細(xì)胞混懸液離心棄上清， 加入3～5 倍細(xì)胞體積的紅細(xì)胞裂解液作用1～2 分鐘， 離心2～3 次棄上清，以去除紅細(xì)胞和裂解液；離心后淋巴細(xì)胞用RPMI-1640（含100 單位/毫升青鏈霉素和10%FBS） 重懸，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中靜置2 小時(shí)，收集未貼壁細(xì)胞即為淋巴細(xì)胞。

未貼壁細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色、計(jì)數(shù)，要求活細(xì)胞數(shù)達(dá)到90%以上；調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)／毫升，即為淋巴細(xì)胞懸液。

1.4 試驗(yàn)分組及給藥

將制備的5×104個(gè)/毫升淋巴細(xì)胞懸液加入96 孔板，每孔85 微升，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～24 小時(shí)至細(xì)胞貼壁備用。

試驗(yàn)分對(duì)照組、25 微克/毫升JP60 組、50 微克/毫升JP60 組、100 微克/毫升JP60 組和150微克/毫升JP60 組，每個(gè)組4 個(gè)重復(fù)。 將已貼壁好的淋巴細(xì)胞按照對(duì)照組加入15 微升超純水，試驗(yàn)組分別加入10 微升不同濃度的JP60 以及5 微升20 微克/毫升 的LPS， 至多糖終濃度為150 微克/毫升、100 微克/毫升、50 微克/毫升、25微克/毫升、0 微克/毫升，LPS 終濃度為1 微克/毫升。

將處理好的96 孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，作用48 小時(shí)后取出并去上清，重新加入90微升RPMI-1640， 每孔再加入10 微升MTT 溶液，37℃、5%CO2培養(yǎng)4 小時(shí)去上清， 每孔加入110 微升Formazan 溶解液， 置搖床上低速振蕩10 分鐘，490 納米測(cè)OD 值。

JP70、JP80 和JP90 組分試驗(yàn)操作同上。

淋巴細(xì)胞相對(duì)增殖率=試驗(yàn)孔OD 值/對(duì)照孔OD 值。

組別 對(duì)照組 25 微克/毫升+LPS 50 微克/毫升+LPS 100 微克/毫升+LPS 150 微克/毫升+LPS LPS JP60 0.95±0.02a 1.68±0.05c 2.06±0.06d 2.23±0.08e 2.55±0.11f 1.22±0.04b JP70 1.43±0.06c 1.75±0.06d 1.95±0.07de 2.08±0.08e JP80 1.45±0.05c 1.78±0.05d 2.05±0.08de 2.13±0.09e JP90 1.76±0.05c 2.25±0.06d 2.42±0.09e 2.62±0.12f

組別 對(duì)照組 25 微克/毫升+LPS 50 微克/毫升+LPS 100 微克/毫升+LPS 150 微克/毫升+LPS LPS JP60 0.93±0.02a 1.63±0.04c 2.13±0.05d 2.35±0.09e 2.58±0.12f 1.18±0.03b JP70 1.40±0.05c 1.82±0.06d 1.09±0.08de 2.13±0.09e JP80 1.41±0.05c 1.86±0.06d 2.11±0.08de 2.19±0.09e JP90 1.71±0.04c 2.31±0.05d 2.45±0.08e 2.62±0.11f

1.5 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以 “均值±標(biāo)準(zhǔn)差” 表示， 數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS19.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析， P＞0.05 表示差異不顯著， P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

多糖對(duì)派氏結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞增殖的影響結(jié)果見(jiàn)表1 和2。 表中各多糖組和LPS組派氏結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞與對(duì)照組比較，增殖率均有顯著提高（p＜0.05），說(shuō)明棗多糖和LPS 均能明顯刺激淋巴細(xì)胞增殖， 且JP60、JP70、JP80 和JP90 棗多糖混合LPS 促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖作用均明顯強(qiáng)于LPS（p＜0.05）。

另外，隨著棗多糖劑量增加，各組淋巴細(xì)胞增殖率呈上升趨勢(shì)，尤以JP60 和JP90 組效果更為顯著（P＞0.05）。

3 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下， 棗多糖JP60、JP70、JP80和JP90 均發(fā)現(xiàn)顯著增強(qiáng)派氏結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞增殖率， 尤以JP60 和JP90 效果最佳；且棗多糖添加劑量在25～150 微克/毫升時(shí)，其促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖效果與劑量呈正相關(guān)， 故最佳作用劑量為150 微克/毫升。

（基金項(xiàng)目：河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)體系蛋雞創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（HBCT2013090201）；河北省自然科學(xué)基金（C2019204330））