麥冬皂苷D 對(duì)大鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

趙玲琳，張勇，薛慧，劉潔

心肌缺血再灌注損傷不僅影響缺血性心血管疾病的治療效果還可影響患者病情轉(zhuǎn)歸[1-2]。大量研究表明，心肌缺血再灌注可能通過(guò)復(fù)雜的病理生理機(jī)制導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，包括細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧自由基增多、鈣超載和血小板聚集等[3-4]。麥冬皂苷D 是從傳統(tǒng)中藥麥冬中提取的一類皂苷類成分，具有抗炎、抗氧化和增強(qiáng)心血管功能等多種生物活性[5-6]。以往研究發(fā)現(xiàn)，麥冬皂苷D 通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體動(dòng)力學(xué)減輕糖尿病心肌損傷[7]。但關(guān)于麥冬皂苷D 在心肌缺血再灌注損傷中的作用鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)缺氧復(fù)氧干預(yù)心肌細(xì)胞H9c2 構(gòu)建心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷模型，觀察麥冬皂苷D 對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠心肌細(xì)胞H9c2 購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，由本實(shí)驗(yàn)室保存；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；低糖DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；麥冬皂苷D 購(gòu)自上海一飛生物科技有限公司，純度≥98%；噻唑藍(lán)檢測(cè)試劑、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司；Annexin Ⅴ/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海翊圣生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司；攜帶磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K）基因過(guò)表達(dá)的pcDNA 3.1-PI3K 質(zhì)粒和作為對(duì)照的pcDNA 3.1 空載體質(zhì)粒購(gòu)自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；RNA 提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；SYBR Green PCR Master Mix 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；PI3K 抗體及二抗購(gòu)自美國(guó)CST 公司；蛋白免疫印跡法（Western blot）所需試劑均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)

心肌細(xì)胞H9c2 培養(yǎng)在含100 ml/L 胎牛血清的低糖DMEM 培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，放置在5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待心肌細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部80%以上時(shí)，以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞，加入2.5 g/L 的胰蛋白酶消化心肌細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組和處理

心肌細(xì)胞接種到96 孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%時(shí)，更換成不含血清的培養(yǎng)液，采用5%CO2、94% N2、1% O2條件下缺氧處理11 h，更換成正常含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液及正常培養(yǎng)條件下復(fù)氧處理4 h，構(gòu)建缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷模型。在復(fù)氧處理4 h 后給予細(xì)胞6 μmol/L 的麥冬皂苷D（根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇的麥冬皂苷D 的實(shí)驗(yàn)濃度）處理24 h。實(shí)驗(yàn)分組：心肌細(xì)胞未行任何干預(yù)的對(duì)照組、缺氧復(fù)氧組(H/R組)、缺氧復(fù)氧+麥冬皂苷D組（H/R+OpD組）、缺氧復(fù)氧+麥冬皂苷D+pcDNA 空載體對(duì)照組（H/R+OpD+pcDNA組）和缺氧復(fù)氧+麥冬皂苷D+PI3K 過(guò)表達(dá)組（H/R+OpD+PI3K組）。心肌細(xì)胞 轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine 2 000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。各組心肌細(xì)胞處理24 h 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 噻唑藍(lán)法檢測(cè)心肌細(xì)胞存活率

心肌細(xì)胞種植到96 孔板中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h，更換成無(wú)血清的培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行同步化處理，按照上述1.3 法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組和處理，如文獻(xiàn)[9]所述，分別向每孔細(xì)胞中添加濃度為5 mg/ml 的噻唑藍(lán)溶液20 μl，于37℃繼續(xù)孵育4 h，吸去上清液，再加入DMSO 150 μl，振蕩10 min，待結(jié)晶物完全溶解后，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm 處各孔的光密度值（OD 值），按照公式計(jì)算各組心肌細(xì)胞的存活率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD 值-空白對(duì)照組OD 值）/（對(duì)照組OD 值-空白對(duì)照組OD 值）×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率

心肌細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種到6 孔板中，按照上述1.3 分組處理后，如文獻(xiàn)[10]所述，加入胰蛋白酶消化并收集各組心肌細(xì)胞，加入結(jié)合緩沖液100 μl 重懸細(xì)胞，隨后加入膜聯(lián)蛋白V 5 μl，混勻，再加入碘化丙啶5 μl，混勻，避光孵育15 min，在1 h 內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡率。

1.6 LDH、MDA 含量及SOD 活力檢測(cè)

心肌細(xì)胞接種到24 孔板中，待心肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，按照1.3 方法分組并處理，如文獻(xiàn)[11]所述，分別收集培養(yǎng)的上清液，以2 400 g 離心10 min，收集上清，黃嘌呤氧化法檢測(cè)SOD 活力，硫代巴比妥酸比色法檢測(cè)MDA 含量，二硝基肼顯色法檢測(cè)LDH 含量。參照LDH、MDA 和SOD 試劑盒使用說(shuō)明書分別檢測(cè)LDH 和MDA 的含量以及SOD 活力。

1.7 ELISA 檢測(cè)CK-MB、TNF-α 和IL-1β 的含量

心肌細(xì)胞接種到24 孔板中，待心肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，按照1.3 方法分組并處理，如文獻(xiàn)[12]所述，收集培養(yǎng)的上清液，采用ELISA 檢測(cè)試劑盒CK-MB、TNF-α 和IL-1β的含量，嚴(yán)格按照ELISA檢測(cè)試劑盒制造商說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)PI3K mRNA 的表達(dá)量

心肌細(xì)胞接種到24 孔板中，待心肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，按照1.3 方法分組并處理，如文獻(xiàn)[13]所述，收集各組心肌細(xì)胞，使用RNA 提取試劑盒提取待測(cè)心肌細(xì)胞的RNA，測(cè)定RNA A260 和A280，選取合格的RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，并以cDNA 為模板，行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)，反應(yīng)條件設(shè)為：95℃ 3 min，隨后95℃ 30 s、退火58℃ 30 s、延伸72℃ 20 s，循環(huán)40 次。獲取Ct 值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組細(xì)胞中PI3K mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 Western blot 檢測(cè)PI3K 蛋白表達(dá)

心肌細(xì)胞接種到24 孔板中，待心肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，按照1.3 方法分組并處理，如文獻(xiàn)[14]所述，待測(cè)心肌細(xì)胞收集后，提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。加入上樣緩沖液加熱致蛋白變性，取40 μg蛋白樣品上樣，行SDS-PAGE 電泳，隨后轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，于5%脫脂奶粉封阻2 h，以TBST 緩沖液洗膜3 次，加入1：800 稀釋的PI3K 一抗，4℃過(guò)夜孵育，洗膜，再加入二抗（1:3 000 稀釋），室溫孵育2 h，顯影后，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描圖像，以GAPDH 為內(nèi)參，使用 Image J 軟件分析蛋白條帶，計(jì)算各組心肌細(xì)胞中PI3K 蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 21.0 分析數(shù)據(jù)。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)至少重復(fù)3 次，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析多組間差異，采用SNK-q 檢驗(yàn)分析組間兩兩差異，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞中心肌損傷標(biāo)志物CK-MB 的含量比較（圖1）

圖1 ELISA 檢測(cè)各組心肌細(xì)胞中CK-MB 的釋放量（n=3，）

ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組[（9.14±0.88）U/L]相比，H/R組心肌細(xì)胞中CK-MB 的釋放量[（19.35±2.13）U/L]明顯升高（P<0.05）；與H/R組比較，H/R+OpD組中CK-MB 的釋放量[（11.23±1.04）U/L] 明顯減少（P<0.05）；與H/R+OpD組比較，H/R+OpD+PI3K組中CK-MB 的釋放量[（17.94±1.81）U/L]明顯增多（P<0.05），H/R+OpD+pcDNA組CK-MB的釋放量[（10.89±1.03）U/L]無(wú)顯著改變（P>0.05）。

2.2 各組心肌細(xì)胞存活率比較（圖2）

圖2 噻唑藍(lán)法比較各組心肌細(xì)胞存活率（n=3，）

噻唑藍(lán)法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組[（100.00±10.21）%]相比，H/R組心肌細(xì)胞存活率[（56.26±5.57）%]明顯降低（P<0.05）；與H/R組比較，H/R+OpD組細(xì)胞存活率[（90.65±8.72）%]明顯升高（P<0.05）；與H/R+OpD組比較，H/R+OpD+PI3K組細(xì)胞存活率[（66.52±5.86）%]明顯降低（P<0.05），H/R+OpD+pcDNA組細(xì)胞存活率[（89.49±8.90）%]無(wú)明顯變化（P>0.05）。

2.3 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較（圖3）

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡情況（n=3，）

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組[（3.75±0.23）%]相比，H/R組心肌細(xì)胞凋亡率[（16.76±1.68）%]明顯升高（P<0.05）；與H/R組比較，H/R+OpD組細(xì)胞凋亡率[（5.27±0.55）%]明顯降低（P<0.05）；與H/R+OpD組比較，H/R+OpD+PI3K組細(xì)胞凋亡率[（15.10±1.49）%]明顯升高（P<0.05），H/R+OpD+pcDNA組細(xì)胞凋亡率[（5.62±0.53）%]無(wú)明顯變化（P>0.05）。

2.4 各組LDH、MDA 含量及SOD 活力比較（表1）

表1 各組心肌細(xì)胞LDH、MDA 含量及SOD 活力比較（n=3，）

表1 各組心肌細(xì)胞LDH、MDA 含量及SOD 活力比較（n=3，）

注：對(duì)照組：心肌細(xì)胞未行任何干預(yù)組；H/R組：缺氧復(fù)氧組；H/R+OpD組：缺氧復(fù)氧+麥冬皂苷D組；H/R+OpD+pcDNA組：缺氧復(fù)氧+麥冬皂苷D+pcDNA 空載體對(duì)照組；H/R+OpD+PI3K組：缺氧復(fù)氧+麥冬皂苷D+PI3K 過(guò)表達(dá)組；LDH：乳酸脫氫酶；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；PI3K：磷脂酰肌醇-3 激酶。與對(duì)照組比*P<0.05；與H/R組比△P<0.05；與H/R+OpD組比▲P<0.05

試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H/R組LDH 和MDA 含量明顯升高（P均<0.05），SOD 活力明顯降低（P<0.05）；與H/R組比較，H/R+OpD組LDH 和MDA 含量明顯降低（P均<0.05），SOD活力明顯升高（P<0.05）；與H/R+OpD組比較，H/R+OpD+PI3K組LDH 和MDA 含量明顯升高（P均<0.05），SOD活力明顯降低（P<0.05），而H/R+OpD+pcDNA組LDH、MDA 含量及SOD 活力無(wú)明顯變化（P均>0.05）。

2.5 各組炎癥因子TNF-α 和IL-1β 含量的比較（表2）

表2 ELISA 法比較各組心肌細(xì)胞上清中TNF-α 和IL-1β 含量（n=3，）

表2 ELISA 法比較各組心肌細(xì)胞上清中TNF-α 和IL-1β 含量（n=3，）

注：對(duì)照組：心肌細(xì)胞未行任何干預(yù)組；H/R組：缺氧復(fù)氧組；H/R+OpD組：缺氧復(fù)氧+麥冬皂苷D組；H/R+OpD+pcDNA組：缺氧復(fù)氧+麥冬皂苷D+pcDNA空載體對(duì)照組；H/R+OpD+PI3K組：缺氧復(fù)氧+麥冬皂苷D+PI3K過(guò)表達(dá)組；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；TNF-α：腫瘤壞死因子α；IL-1β：白細(xì)胞介素1β；PI3K：磷脂酰肌醇-3 激酶。與對(duì)照組比*P<0.05；與H/R組比△P<0.05；與H/R+OpD組比▲P<0.05

ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H/R組TNF-α 和IL-1β 含量明顯升高（P均<0.05）；與H/R組比較，H/R+OpD組TNF-α 和IL-1β 含量明顯降低（P均<0.05）；與H/R+OpD組比較，H/R+OpD+PI3K組TNF-α和IL-1β含量明顯升高（P均<0.05），而H/R+OpD+pcDNA組TNF-α 和IL-1β 含量無(wú)明顯變化（P均>0.05）。

2.6 各組心肌細(xì)胞中PI3K mRNA 和蛋白水平的比較（表3、圖4）

圖4 Western blot 檢測(cè)各組心肌細(xì)胞中PI3K 蛋白表達(dá)的免疫印跡圖

表3 各組心肌細(xì)胞中PI3K mRNA 和蛋白水平的比較（n=3，）

表3 各組心肌細(xì)胞中PI3K mRNA 和蛋白水平的比較（n=3，）

注：H/R組：缺氧復(fù)氧組；H/R+OpD組：缺氧復(fù)氧+麥冬皂苷D組；H/R+OpD+pcDNA組：缺氧復(fù)氧+麥冬皂苷D+pcDNA 空載體對(duì)照組；H/R+OpD+PI3K組：缺氧復(fù)氧+麥冬皂苷D+PI3K 過(guò)表達(dá)組；PI3K：磷脂酰肌醇-3 激酶。與對(duì)照組比*P<0.05；與H/R組比△P<0.05；與H/R+OpD組比▲P<0.05

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 和Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H/R組心肌細(xì)胞中PI3K mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高（P均<0.05）；與H/R組比較，H/R+OpD組PI3K mRNA 和蛋白表達(dá)均明顯降低（P均<0.05）；與H/R+OpD組比較，H/R+OpD+PI3K組PI3K mRNA 和蛋白表達(dá)均明顯升高（P均<0.05），而H/R+OpD+pcDNA組PI3K mRNA 和蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（P均>0.05）。

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是影響缺血性心臟病治療效果的關(guān)鍵因素之一。因此，有效緩解心肌缺血再灌注損傷對(duì)于提高心肌缺血患者治療效果至關(guān)重要。為探究麥冬皂苷D 對(duì)缺血再灌注損傷的影響潛在機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)缺氧復(fù)氧處理心肌細(xì)胞模擬心肌缺血再灌注損傷，結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧后心肌細(xì)胞損傷標(biāo)志物CK-MB 的含量明顯升高，細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高，提示缺氧復(fù)氧可致心肌細(xì)胞損傷。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物之一，其可加劇細(xì)胞膜的損傷，是反映細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的重要指標(biāo)。LDH 是一類胞內(nèi)酶，作為組織損傷的標(biāo)志物之一，其外泄量在一定程度上反映細(xì)胞膜通透性損傷的程度。SOD 是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，其活性越高細(xì)胞抗氧化能力越強(qiáng)。有研究顯示，缺血再灌注損傷的心肌中大量氧自由基累積，導(dǎo)致正常的脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化產(chǎn)生過(guò)量的MDA，增加心肌細(xì)胞膜的通透性，誘發(fā)LDH 等物質(zhì)大量外泄，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[15-16]。本實(shí)驗(yàn)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中LDH 和MDA 含量明顯升高，SOD 活力顯著下降，提示缺氧復(fù)氧能夠引發(fā)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。而麥冬皂苷D 能夠降低LDH 和MDA 的含量，提高SOD 的活力，表明麥冬皂苷D 對(duì)缺氧復(fù)氧誘發(fā)的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷起保護(hù)作用。大量研究顯示，炎癥介質(zhì)如TNF-α、IL-1β、IL-1 和IL-6 等的大量釋放，引發(fā)心肌的炎癥反應(yīng)，參與心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)而影響心肌缺血再灌注的發(fā)病過(guò)程[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，麥冬皂苷D 能夠下調(diào)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中炎癥因子TNF-α 和IL-1β 的含量，對(duì)心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。

PI3K 是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，在各種細(xì)胞中廣泛存在。PI3K受外界信號(hào)刺激后，通過(guò)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)引發(fā)蛋白激酶B（Akt）的激活，實(shí)現(xiàn)信號(hào)通路PI3K/Akt的激活，參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化等多種生物學(xué)過(guò)程[18-19]。目前研究顯示，PI3K 含量與心肌缺血再灌注損傷程度及患者預(yù)后密切相關(guān)，PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)心肌缺血再灌注損傷的進(jìn)展[20-22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧的心肌細(xì)胞中PI3K 含量明顯升高，這與以往研究相符。麥冬皂苷D 能夠逆轉(zhuǎn)缺氧復(fù)氧引發(fā)的心肌細(xì)胞中PI3K 的表達(dá)升高，換言之，麥冬皂苷D 干預(yù)降低了PI3K 的表達(dá)。這些研究結(jié)果提示麥冬皂苷D 對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用可能與抑制PI3K 的表達(dá)有關(guān)。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)轉(zhuǎn)染上調(diào)麥冬皂苷D 干預(yù)缺氧復(fù)氧的心肌細(xì)胞中PI3K 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上調(diào)PI3K 后心肌細(xì)胞損傷標(biāo)志物CK-MB的含量升高，心肌細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高，LDH 和MDA 含量上調(diào)，SOD 活力降低，IL-1 和IL-6 分泌增多。這些結(jié)果表明上調(diào)PI3K 能夠部分抵消麥冬皂苷D 對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，驗(yàn)證了麥冬皂苷D 能夠通過(guò)調(diào)控PI3K 對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷起保護(hù)作用。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示麥冬皂苷D 能夠保護(hù)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞，其作用機(jī)制可能與抑制PI3K 的表達(dá)有關(guān)。但麥冬皂苷D 是否通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt 信號(hào)通路參與缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷，或是否存在其他相關(guān)機(jī)制仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入探究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突