基于全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)柴胡醋制前后揮發(fā)油成分的研究

★ 喬欣 陳文彬 馬亞男 葉耀輝（江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004）

柴胡為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinenseDC.）或 狹 葉 柴 胡（Bupleurum scorzonerifoliumWilld.）的干燥根，味辛、苦，性微寒；歸肝、膽、肺經(jīng)；具有疏散退熱、舒肝解郁、升舉陽(yáng)氣等作用，用于治療感冒發(fā)熱、寒熱往來(lái)、胸脅脹痛、月經(jīng)不調(diào)、子宮脫垂、脫肛等［1］。柴胡為常用中藥，其炮制品有生柴胡、醋炙品、鱉血拌品、鱉血炙品、酒柴胡、蜜柴胡等［2］，各炮制品功效也不盡相同。一般認(rèn)為生品柴胡升散作用較強(qiáng)，臨床多用于解表退熱；而醋炙柴胡可緩解升散之性，增加疏肝止痛作用；鱉血柴胡能填陰滋血，抑制其浮陽(yáng)之性，增強(qiáng)清肝退熱的功效；酒炙柴胡能升舉脾陽(yáng)、舒筋通絡(luò)；蜜炙柴胡能減緩藥性、矯正氣味，增強(qiáng)止咳潤(rùn)肺功效。

揮發(fā)油是柴胡主要有效成分之一，現(xiàn)代研究表明柴胡揮發(fā)油不僅具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、保肝等作用［3-6］，還有一定的抗腫瘤、抗病毒、增強(qiáng)記憶的功效［7］。研究表明，柴胡醋制品中揮發(fā)油成分組成較為復(fù)雜，化合物種類多，且存在大量同分異構(gòu)體，采用傳統(tǒng)的GC-MS進(jìn)行檢測(cè)存在局限性［8］。全二維氣相色譜（GC×GC）是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型多維色譜分離檢測(cè)技術(shù)，與飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF/MS）聯(lián)用，適合對(duì)組分復(fù)雜試樣準(zhǔn)確分離鑒定及微量有效成分結(jié)構(gòu)的研究，廣泛應(yīng)用于石油、煙草、茶類、酒類、食品安全、環(huán)境檢測(cè)、香料香精、中藥提取物［9-12］，近些年也逐步應(yīng)用于植物揮發(fā)油的分析［13-14］。

本實(shí)驗(yàn)以柴胡生品及柴胡醋制品為研究對(duì)象，采用全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（GC×GCTOF/MS）技術(shù)對(duì)柴胡醋制前后揮發(fā)油成分變化進(jìn)行分析，旨在為柴胡醋制品的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，為柴胡炮制的減毒增效規(guī)律提供成分依據(jù)。

1 材料

1.1 原材料及試劑

柴胡購(gòu)于河北安國(guó)藥材市場(chǎng)（批號(hào)：20171201），鑒定人為江西中醫(yī)藥大學(xué)龔千鋒教授；無(wú)水硫酸鈉購(gòu)于西隴科學(xué)股份有限公司，分析純；無(wú)水乙醚購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；米醋購(gòu)于山西紫林醋業(yè)股份有限公司（批號(hào)：20150809） 。

1.2 主要儀器與設(shè)備

GC×GC-TOF/MS系統(tǒng)、7890B氣 相 色 譜 儀、DB-Wax（30 m×250 μm×0.25 μm）色譜柱、DB-17HT（2.0 m×100 μm×0.1 μm）色 譜 柱，美 國(guó)Agilent公司；Pegasus 4D飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國(guó)LECO公司；Heraeus Fresco17離心機(jī)、Forma 900 series型超低溫冰箱，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；SQP型萬(wàn)分之一電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；中藥粉碎機(jī)，瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司。

2 方法

2.1 柴胡炮制品制備

2.1.1 凈制柴胡根據(jù)《中國(guó)藥典》（2020年版），取去除雜質(zhì)和殘莖的柴胡藥材，洗凈，潤(rùn)透，切厚片，干燥，即得。

2.1.2 醋制柴胡根據(jù)《中國(guó)藥典》（2020年版），取柴胡飲片，加米醋拌勻（柴胡每100 kg用米醋20 kg），悶透，置炒制容器內(nèi)，炒至表面呈棕黃色時(shí)，取出，放涼，即得。

2.2 柴胡炮制品揮發(fā)油制備

將柴胡生品和柴胡醋制品粉碎后過(guò)四號(hào)篩，取15 g柴胡粉末，參照《中國(guó)藥典》（2020年版）四部通則的水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油［1］。收集到的揮發(fā)油用少許乙醚分?jǐn)?shù)次萃取，加入適量無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行除水，低溫?fù)]去乙醚，裝入色譜瓶，-80 ℃低溫冰箱保存。

2.3 GC×GC-TOF/MS分析方法

2.3.1 GC×GC條件柱系統(tǒng)由兩根色譜柱組成：色譜柱1：DB-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm），色譜柱2：DB-17HT（2.0 m×100 μm×0.1 μm），柱子之間通過(guò)毛細(xì)管柱連接器連接。載氣為氦氣，流速1.0 mL/min。操作條件：升溫程序從40 ℃開始，保持3 min，以10 ℃/min速率升到150 ℃，再以5 ℃/min速率升到250 ℃，保留26 min。進(jìn)樣口采用分流模式，進(jìn)樣量為1.0 μL，隔墊吹掃流速為3 mL/min。

2.3.2 MS條件采用電子電離源，電子轟擊能量為-70 eV；前進(jìn)樣口溫度為260 ℃，傳輸線溫度為270 ℃，離子源溫度為220 ℃；質(zhì)量掃描范圍為20～500m/z，掃描速率為100 spectrum/s，溶劑延遲為0 min。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)處理使用Chroma TOF軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對(duì)齊等分析［15］。

3 結(jié)果

3.1 GC×GC-TOF/MS方法的建立

與傳統(tǒng)的一維氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)相比，GC×GC-TOF/MS集成了全二維氣相色譜技術(shù)和飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，具有高分辨率、高靈敏度、高峰容量及高采集速率等優(yōu)勢(shì)。全二維氣相色譜是將兩根不同極性不同長(zhǎng)度的氣相色譜柱通過(guò)一個(gè)環(huán)形調(diào)制器串聯(lián)在一起，選用非極性柱作為第一維柱，組分按沸點(diǎn)高低分離；以中等極性柱作為第二維柱，組分以極性大小分離，第一根色譜柱上分離后的樣品在經(jīng)過(guò)環(huán)形調(diào)制器時(shí)被迅速冷卻聚焦，然后被脈沖式熱氣迅速氣化，進(jìn)入第二根色譜柱快速分離，經(jīng)由快速的高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)器進(jìn)行全二維譜圖的準(zhǔn)確構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜組分的分析。由于柴胡揮發(fā)油成分種類較多，沸程較寬，實(shí)驗(yàn)選擇升溫速率為10 ℃/min，化合物主要分布在中段和后段時(shí)間出峰，避免降低第一維柱的分辨率，后段選擇較慢的升溫速率5 ℃/min。

3.2 柴胡醋制前后揮發(fā)油成分定性分析

通過(guò)GC×GC-TOF/MS譜圖所計(jì)算得到的結(jié)果對(duì)柴胡醋制前后揮發(fā)油進(jìn)行定性分析，得到柴胡醋制前后揮發(fā)油的二維輪廓圖，見(jiàn)圖1。通過(guò)Pegasus 4D色譜分析工作站，結(jié)合Mainlib譜庫(kù)、Replib譜庫(kù)、NIST譜庫(kù)以及Wiley譜庫(kù)對(duì)柴胡醋制前后揮發(fā)油總離子流圖進(jìn)行自動(dòng)解卷積和檢索分析（選擇RSN＞50的色譜峰進(jìn)行分析），再結(jié)合全二維包含結(jié)構(gòu)信息的二維譜圖，通過(guò)族分離和結(jié)構(gòu)譜圖鑒定，以及文獻(xiàn)對(duì)照，選取匹配度大于750、含量大于0.010%的化合物。從在兩種柴胡炮制品揮發(fā)油中共檢測(cè)到了85種化合物，可將鑒定出的化合物分為8類，其中有機(jī)酸類14種，烴類22種，醛酮類11種，酯類5種，醇類11種，醚類7種，含氮類9種，其他類6種，見(jiàn)表1。兩種柴胡炮制品揮發(fā)油中有28種共有成分，其中有機(jī)酸類7種，烴類3種，醛酮類6種，酯類1種，醇類5種，醚類3種，含氮類1種，其他類2種。柴胡經(jīng)醋制后，亞麻酸等35種化學(xué)成分消失，新增加2，4-壬二烯醛等22種化學(xué)成分。

表1 柴胡揮發(fā)油GC×GC-TOF/MS分析鑒定的主要成分

圖1 柴胡炮制品揮發(fā)油的GC×GC二維點(diǎn)陣圖

（續(xù)表）

3.3 柴胡醋制前后揮發(fā)油成分定量比較分析

柴胡醋制后，揮發(fā)油成分含量發(fā)生了明顯的變化，如表1所示，有機(jī)酸類、醛酮類、醇類及酯類化合物相對(duì)含量降低；而烴類、醚類和含氮類化合物相對(duì)含量有所升高。醇類化合物是柴胡生品中相對(duì)含量較高的一類化合物，其中2-乙烯氧基乙醇的相對(duì)含量最高，達(dá)到10.534%，其在柴胡醋制品中相對(duì)含量只有2.194%。含氮類化合物是柴胡醋制品中相對(duì)含量最高的一類化合物，其中Tetramethylammonium及D-氨基葡萄糖酸相對(duì)含量分別達(dá)到8.004%和9.677%，而在柴胡生品中未檢測(cè)出這兩個(gè)化合物，且含氮類化合物柴胡生品中相對(duì)含量只有0.348%。此外，柴胡醋制前后烴類化合物相對(duì)含量變化也較大，在柴胡生品中只有0.621%，經(jīng)醋制后增加到7.541%。柴胡生品檢測(cè)到的有機(jī)酸類化合物中亞油酸（1.729%）、亞麻酸（3.915%）、硬脂炔酸（1.430%）、硬脂酸（1.375%）等化合物相對(duì)柴胡醋制品中相對(duì)含量較高。在柴胡生品中檢測(cè)到的4-甲基苯丁酮（2.411%）、正己醛（0.345%）和戊醛（0.302%）等物質(zhì)相對(duì)柴胡醋制品中相對(duì)含量較高。

4 討論

中藥材揮發(fā)油成分組成復(fù)雜，主要為月桂烯和己醛等短鏈烯醛［16］，經(jīng)現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，柴胡揮發(fā)油具有清熱解表、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用?；魤?mèng)逸等［17］對(duì)柴胡揮發(fā)油中有效解熱成分進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明柴胡揮發(fā)油的主要解熱物質(zhì)為月桂醛、γ-古蕓烯和2，4-葵二烯醛等。柴胡醋制品相比生品，具有更大的潛在肝保護(hù)作用［18］。現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，醋制柴胡有益于膽汁分泌，在治療黃疸，肝炎，肝硬化和肝癌等肝相關(guān)疾病方面效果明顯，但醋制柴胡肝保護(hù)作用的確切分子機(jī)制仍不清楚，還需要進(jìn)行更加深入的研究。

傳統(tǒng)的氣相色譜-質(zhì)譜的靈敏度和分辨率較低，檢測(cè)出的成分較少；而全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜具有更高靈敏度和和更大的峰容積，使得定性分析結(jié)果更準(zhǔn)確［19］，并可鑒定出更多的成分。運(yùn)用全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)柴胡醋制前后揮發(fā)油成分進(jìn)行定性分析，有效解決了柴胡炮制品中復(fù)雜揮發(fā)油組分定性定量分析難題，為后續(xù)醋制柴胡代謝組學(xué)研究提供了數(shù)據(jù)支持。