艾灸預(yù)處理改善哮喘大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸抑制肺損傷

★ 鄭海珍 邱祺 陳駿 管靈聰 熊?。?江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 南昌 330006；.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 南昌 330004）

哮喘是一種以慢性氣道炎癥為特征，并伴有可逆性呼氣氣道梗阻的疾病，臨床表現(xiàn)為喘息、呼吸困難、咳嗽、胸悶等間歇性癥狀，發(fā)病時(shí)伴發(fā)哮鳴音［1］。目前，針對(duì)哮喘的藥物治療主要是吸入皮質(zhì)類(lèi)固醇、長(zhǎng)效β激動(dòng)劑和哮喘生物制劑等。但由于藥物的副作用、依賴(lài)性和耐藥性等原因，患者服藥依從性欠佳，導(dǎo)致哮喘控制欠佳，增加相關(guān)住院率和死亡率，給患者和社會(huì)醫(yī)療系統(tǒng)帶來(lái)重大負(fù)擔(dān)［2］。因此，尋找非藥物療法幫助控制哮喘有重要意義。研究表明，艾灸能顯著控制哮喘發(fā)作，被推薦于慢性持續(xù)期和臨床緩解期的單獨(dú)或輔助治療［3］。糖皮質(zhì)激素是干預(yù)哮喘的有效藥物，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)下丘腦—垂體—腎上腺軸（HPAA）在哮喘患者中下調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)哮喘的病程進(jìn)展［4］；哮喘動(dòng)物模型氣道炎癥和肺損傷明顯與HPAA功能紊亂有關(guān)［5-6］。目前尚未見(jiàn)從調(diào)節(jié)HPAA方面觀察艾灸機(jī)制的研究。因此，對(duì)艾灸預(yù)處理改善哮喘大鼠HPAA抑制肺部炎性反應(yīng)進(jìn)行研究，以期為艾灸防治哮喘的內(nèi)在機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20只5周齡、180～220 g SPF級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，分籠飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物房溫度（25±2）℃，相對(duì)濕度（50±15）%，自由進(jìn)食水，光暗周期12 h/12 h（光照從6 am到6 pm），保持環(huán)境安靜。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（JZLLSC20210036）。

1.2 主要試劑與儀器

卵白蛋白（OVA，GradeⅡ和Ⅴ，Sigma），氫氧化鋁干粉（天津市大茂化學(xué)試劑廠），戊巴比妥鈉（上海西唐生物科技有限公司），ECL化學(xué)發(fā)光試劑（武漢科銳思），自制密閉霧化箱（40 cm×30 cm×30 cm），小動(dòng)物艾條（長(zhǎng)度12 cm，直徑6 mm，江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院），醫(yī)用超聲霧化器（江蘇富林醫(yī)療設(shè)備有限公司），正置光學(xué)顯微鏡（Nikon Eclipse E100，日本），促腎上腺激素釋放激素（CRH）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）和皮質(zhì)酮（CORT），ELISA試劑盒（Elabscience，武漢），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式低速離心機(jī)（上海安亭），BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（武漢科銳思），轉(zhuǎn)印電泳儀（北京六一），PVDF膜（Millipore，Billerica，MA，USA），化學(xué)發(fā)光儀、轉(zhuǎn)膜裝置（上海天能科技），超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物）。

1.3 分組、造模與艾灸

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，根據(jù)體重分層，采用計(jì)算機(jī)隨機(jī)方式，將大鼠分為正常組（C）、模型組（M）、懸灸10 min（SM10）和懸灸40 min組（SM40），每組各5只。哮喘模型建立方法［7］：第4 d到第10 d，第18 d到第24 d，造模組大鼠每日給予腹腔注射OVA（Grade Ⅴ）40 mg和氫氧化鋁干粉2 mg混懸致敏液1 mL，第25 d到第32 d，每日給予2.5% OVA（Grade Ⅱ）霧化激發(fā)30 min，正常組大鼠給予同等量生理鹽水。艾灸結(jié)束后30 min進(jìn)行造模，每次施灸持續(xù)10 min或40 min，包括在致敏期（第4 d到第10 d，第18 d到第24 d）、激發(fā)期（第25 d到第32 d），每階段分別艾灸5次，共施灸15次。施灸穴位為雙側(cè)肺俞，定位：位于第三胸椎棘突下緣外的凹陷處［8］。將特制的艾條固定在距穴位表面垂直距離3 cm處，艾灸時(shí)每隔2 min清理艾灰，每次不超過(guò)10 s，并調(diào)整距離以保持皮膚溫度。

1.4 取材

在末次激發(fā)后24 h內(nèi)大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（45 mg/kg），待大鼠深度麻醉后，腹主動(dòng)脈取血2 mL，置于普通采血管內(nèi)，室溫靜置2 h后，在4 ℃、1 000 rpm離心20 min后提取血清上清液，置于凍存管內(nèi)，-80 ℃保存。打開(kāi)胸腔，取下右肺，生理鹽水沖凈表面血液，4%多聚甲醛4 ℃固定24 h備用；取下左肺，沖凈血液，裝入凍存管，-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 蘇木素-伊紅染色

參考Ju M等［9］的方法，將固定后的肺組織脫水浸蠟、包埋切片，厚4 μm，石蠟切片脫蠟至水、蘇木素、伊紅染色、脫水封片。顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.6 ELISA

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)肺組織ACTH、CRH、CORT濃度。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度（OD值）。

1.7 蛋白印跡

參照Z(yǔ)hang J等［10］實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)量。將10 mg肺用預(yù)冷PBS洗滌3次，去除血漬，切成塊，在RIPA裂解緩沖液中按1∶10的比例勻漿，4 ℃15 000 rpm離心10 min，收集總蛋白上清。采用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。然后將所有樣品的蛋白濃度調(diào)整到3 μg/μL，以4∶1的比例加入蛋白加載緩沖液，水煮5 min。將制備的蛋白溶液在-80 ℃保存。用12%的SDS-PAGE凝膠電泳分離30 μg蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在5%脫脂牛奶中室溫封閉60 min后，用制備的一抗：抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）多克隆抗體（兔，44KD，1∶1 000，Boster，武漢），抗β-actin 單克隆抗體（小鼠，43KD，1∶5 000，Proteintech，武漢），在4 ℃下孵育過(guò)夜。在二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔和抗小鼠IgG（均1∶8 000，武漢科銳思）室溫孵育60 min后，將ECL化學(xué)發(fā)光試劑加入印跡膜30～60 s，瀝干ECL后，由成像分析儀自動(dòng)成像。采用Image J軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行量化。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)三次。使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Graphpad Prism 7軟件進(jìn)行繪圖。使用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估正態(tài)分布。在數(shù)據(jù)正態(tài)分布的情況下，采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。否則采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)和Mann-Whitney U檢驗(yàn)。以P＜0.05，P＜0.01和P＜0.001表示統(tǒng)計(jì)學(xué)具有差異，顯著差異和極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)變化

與C組比較，M組大鼠在第一次激發(fā)后就出現(xiàn)不同程度的哮喘癥狀，活動(dòng)減少，哮鳴音明顯，隨著激發(fā)次數(shù)的增加，程度逐漸加重。SM10組在第3次激發(fā)后開(kāi)始出現(xiàn)哮喘癥狀，每次喘息發(fā)作時(shí)間較模型組短，精神較好，哮鳴音較少；SM40組第5次激發(fā)開(kāi)始出現(xiàn)哮喘，與SM10組相比，哮喘癥狀更輕，精神狀態(tài)與C組類(lèi)似，飲食飲水量最多。

2.2 肺組織形態(tài)學(xué)變化

與C組比較，M組大鼠支氣管周?chē)写罅垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)。支氣管平滑肌肥大，基底膜增厚，支氣管管腔梗阻，內(nèi)可見(jiàn)大量分泌物。肺泡萎縮塌陷，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔變窄。與M組比較，SM10組支氣管周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)、支氣管管腔阻塞、氣道壁厚度明顯減輕，支氣管分泌物減少。與M組比較，SM40組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)結(jié)果接近正常，具有顯著改善。見(jiàn)圖1。

圖1 艾灸預(yù)處理對(duì)OVA誘導(dǎo)哮喘大鼠肺組織損傷的影響（HE，放大倍數(shù)× 400，比例尺= 80 μm）

2.3 艾灸預(yù)處理對(duì)哮喘大鼠HPAA的干預(yù)作用

與C組比較，M組大鼠血清CRH、ACTH、CORT含量均明顯下降（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001），與M組比較，SM10和SM40組大鼠的血清CRH、ACTH、CORT含量顯著上升（P＜0.001），SM40組大鼠的血清CRH、ACTH、CORT含量顯著高于SM10組（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.001）。見(jiàn)圖2。

圖2 艾灸預(yù)處理對(duì)OVA誘導(dǎo)哮喘大鼠血清ACTH、CORT、CRH的影響

2.4 肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)變化

與C組比較，M組大鼠肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.001），SM10和SM40組大鼠的TGF-β1蛋白表達(dá)較模型組顯著下降（P＜0.05，P＜0.001），SM40組與SM10組比較，TGF-β1蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 艾灸預(yù)處理對(duì)肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)影響

3 討論

哮喘是全球各年齡段均會(huì)罹患、易反復(fù)發(fā)作的慢性疾病。隨著人們對(duì)哮喘發(fā)病機(jī)理和治療現(xiàn)狀的認(rèn)識(shí)，針對(duì)哮喘的非藥物治療也日漸受到關(guān)注。中醫(yī)認(rèn)為，哮喘屬于“哮證”“喘證”范疇，病機(jī)多為肺脾腎功能失調(diào)，氣血津液運(yùn)行失常，導(dǎo)致宿痰伏肺，受外感內(nèi)因引動(dòng)即發(fā)為哮喘。中醫(yī)強(qiáng)調(diào)治病求本，治病要著眼于調(diào)動(dòng)機(jī)體自身潛能，整體調(diào)治，促進(jìn)機(jī)體的康復(fù)。艾灸在治療哮喘方面療效突出，已被廣泛用于臨床哮喘各個(gè)階段的干預(yù)［3，11-12］。既往研究表明，艾灸通過(guò)抑制磷脂酰肌醇-3-激酶信號(hào)通路［13］、CC趨化因子蛋白表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)換器和轉(zhuǎn)錄激活因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)干預(yù)氣道炎癥［14］，通過(guò)調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡恢復(fù)免疫穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而控制哮喘［15］。但尚未見(jiàn)從基于HPAA來(lái)研究艾灸防治哮喘的文獻(xiàn)報(bào)道。

HPAA指下丘腦、垂體和腎上腺內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)，控制著內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素（GC）的釋放，是炎癥反應(yīng)內(nèi)源性調(diào)節(jié)主要途徑。慢性氣道炎癥是哮喘的主要特征，研究發(fā)現(xiàn)，哮喘早期階段，由于炎性因子釋放興奮HPAA，促進(jìn)GC釋放，進(jìn)而抑制氣道炎癥發(fā)展［16］。此外，GC的分泌，還可以促進(jìn)外周血單核細(xì)胞分泌IgE，推動(dòng)氣道炎癥發(fā)展［17］。隨著哮喘病程的進(jìn)展，GC的持續(xù)釋放可反向抑制HPAA功能，積累的致炎因子也逐漸會(huì)抑制HPAA功能，對(duì)抗GC的釋放［18］。

研究表明，支氣管哮喘患者HPAA分泌激素在冬季顯著升高，機(jī)能呈現(xiàn)虛性亢奮的現(xiàn)象［19］。對(duì)于存在HPAA功能低下的哮喘大鼠，改善HPAA可有效控制哮喘發(fā)作［5］。當(dāng)HPAA被激活時(shí)，下丘腦室旁核神經(jīng)元分泌CRH，CRH作用腦下垂體前葉誘導(dǎo)ACTH分泌，ACTH信號(hào)通過(guò)血液循環(huán)傳遞到腎上腺，腎上腺合成并釋放CORT，協(xié)同發(fā)揮抗炎效應(yīng)［20］。高駿等［21］研究表明，艾灸可能通過(guò)調(diào)節(jié)HPAA功能，從而抑制核轉(zhuǎn)錄因子炎性信號(hào)通路而發(fā)揮抗炎作用；章海鳳等［22］發(fā)現(xiàn)，熱敏灸可能通過(guò)調(diào)節(jié)HPAA，改善胃腸運(yùn)動(dòng)功能，從而治療腸易激綜合征。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘模型組大鼠肺組織損害嚴(yán)重，支氣管、肺泡內(nèi)分泌物較多，管腔狹窄，符合哮喘病理特征。大鼠HPAA功能低下，血清CRH、ACTH和CORT含量顯著下降，與前期其他學(xué)者研究較吻合。不同的是，本研究周期較短，激發(fā)時(shí)間較短，不同于其他研究采用的4周激發(fā)期［5］?？紤]與造模方法、大鼠體質(zhì)不同有關(guān)。艾灸預(yù)處理后，大鼠肺損害顯著改善，血清HPAA指標(biāo)顯著上調(diào)，哮喘癥狀也得到顯著抑制。細(xì)胞因子TGF-β可調(diào)控上皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、肺泡上皮細(xì)胞分化、成纖維細(xì)胞活化、細(xì)胞外基質(zhì)組織等多種細(xì)胞過(guò)程，TGF-β也是T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的核心，并與哮喘氣道炎癥、氣道重塑密切相關(guān)［23-24］。TGF-β1基因-509C/T多態(tài)性可能是中國(guó)人群，特別是中國(guó)兒童哮喘的危險(xiǎn)因素［25］。本研究模型組肺組織TGF-β1水平顯著高于正常組，促進(jìn)氣道炎癥和氣道重塑。經(jīng)過(guò)艾灸預(yù)處理后，肺組織TGF-β1蛋白顯著下降，可能與HPAA顯著上調(diào)有關(guān)。

肺俞是肺的背俞穴，艾灸肺俞穴可溫肺散寒、調(diào)和營(yíng)衛(wèi)、祛痰散結(jié)，是常用的治療哮喘的熱敏腧穴［26］。本研究中，懸灸肺俞40 min組改善HPAA的效果要顯著優(yōu)于懸灸肺俞10 min組，肺損害也較后者明顯減輕、大鼠哮喘癥狀和精神狀態(tài)明顯優(yōu)于后者，提示灸效與灸時(shí)顯著相關(guān)。對(duì)懸灸時(shí)間的重視也是陳日新教授創(chuàng)立的熱敏灸理論的重要內(nèi)容，即灸量，最佳灸量為個(gè)體化的熱敏感消失時(shí)的艾灸量［26］。陳教授認(rèn)為，懸灸15 min內(nèi)尚處于艾灸發(fā)揮效果的潛伏期，不能達(dá)到最佳的灸效要求。研究表明，艾灸9 min內(nèi)的灸時(shí)與灸效關(guān)系不密切［27］，艾灸30 min與10 min的灸效差異顯著［28］，這與本研究結(jié)果一致。此外，采用艾灸預(yù)處理干預(yù)哮喘，強(qiáng)調(diào)艾灸的預(yù)防效果，也是本研究的亮點(diǎn)之一。

綜上所述，艾灸預(yù)處理可顯著抑制哮喘大鼠的肺組織病理改變，或與上調(diào)HPAA、下調(diào)促炎因子TGF-β1，進(jìn)而抑制氣道炎癥和氣道重塑有關(guān)。