還原型谷胱甘肽調(diào)控Nrf2/iNOS信號對DR大鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)機制

楊馥宇，蘇 杰，王 玲，王林洪，張 蒙

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病的一種微血管并發(fā)癥，是最常見的并發(fā)癥，也是全球主要的致盲性眼病[1-2]，其主要以視網(wǎng)膜血管改變?yōu)椴±硖卣?，眼底多表現(xiàn)為視網(wǎng)膜滲出水腫、新生血管、視物模糊、視力下降、出血及增殖膜形成等，如未能得到及時有效的治療，會嚴(yán)重威脅患者的視覺健康[3]。谷胱甘肽是生物體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)中最重要的小分子活性寡肽，分為氧化型谷胱甘肽（glutathione oxidized,GSSG）和還原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）[4]。GSH是一種合成肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成，參與體內(nèi)糖代謝。GSH作為谷胱甘肽過氧化物酶，參與體內(nèi)氧化還原過程，能和過氧化物及自由基結(jié)合，可清除生物體內(nèi)有害自由基，結(jié)合自由基、有氧自由基、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（Glutathione S-transferases,GSTs）等[5-6]。GSH 生物效應(yīng)廣泛，臨床上主要在肝臟疾病應(yīng)用較多，其在治療神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)疾病也有廣泛的應(yīng)用[7]。有報道芪燈名目膠囊劑有效成分可以減輕糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變程度，主要和抑制氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[8]。一氧化氮（NO）是一種內(nèi)源性血管擴張劑和神經(jīng)遞質(zhì)，在視網(wǎng)膜血流的調(diào)控機制和糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，作為體內(nèi)NO 生成的主要限速因素[9]，誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iN‐OS）在DR 形成中的作用也日益受到關(guān)注。因此，本文探討原型谷胱甘肽調(diào)控Nrf2/iNOS 信號對DR大鼠應(yīng)激反應(yīng)的作用，現(xiàn)研究如下。

1 材料與方法

1.1 實驗大鼠 48只SD大鼠，由南京君科生物工程公司提供，體重190~220 g，溫度（22±1）℃，分4 籠飼養(yǎng)，濕度45%~55%，大鼠活動飲水自由，給予大鼠一周時間習(xí)慣新環(huán)境，按照《實驗動物管理條例》規(guī)定進(jìn)行實驗，動物許可證號：SYXK（蘇）2018-0009。

1.2 主要儀器與設(shè)備 鏈脲佐菌素購買于北京厚嘉生物科技公司；GSH購買于上海聯(lián)碩寶為生物科技有限公司；SOD、MDA、GSH-Px 試劑盒購買于上海金畔生物科技公司；Nrf 抗體購買于無錫云萃生物科技；HO-1 抗體購買于廈門慧嘉生物科技；NO抗體購買于上?？泼羯锟萍?；活性氧(reactive oxygen species,ROS)試劑盒子購自上海圻明生物公司；iNOS抗體購買于上海心語生物科技公司。

1.3 DR 大鼠分組及模型制備 用隨機法將48 只大鼠分為4組，每組12只，健康組、糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠組（病變組）、糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠給予還原型谷胱甘肽干預(yù)組（甘肽組）、糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠給予辛伐他汀干預(yù)組(他汀組)。健康組除外，其余三組建立糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠。用新配制的鏈脲佐菌素溶液按照55 mg/kg 的劑量行大鼠腹腔內(nèi)注射，大鼠注射后72 h 收集尾靜脈測血糖，血糖水平≥16.7 mmol/L，糖尿病大鼠造模成功。分籠飼養(yǎng)4個月后監(jiān)測尾靜脈血糖>16.7 mmol/L的大鼠采用戊巴比妥（40 mg/kg）進(jìn)行腹腔注射麻醉，阿托品雙眼散瞳，鹽酸丙美卡因眼表面麻醉后進(jìn)行眼前照相，并經(jīng)尾靜脈注射0.2 mL 濃度為50 mg/mL 的異硫氰酸葡聚糖熒光素，眼底血管造影檢查眼底情況，同時具備4 個月持續(xù)糖>16.7 mmol/L 且眼底血管造影出現(xiàn)微血管瘤及滲漏的大鼠為DR 大鼠建模成功，本次實驗大鼠均建模成功[9]。

1.4 干預(yù)方法 建模成功后，甘肽組大鼠給予還原谷胱甘肽0.9%生理鹽水溶解后，2 mL/kg 注入大鼠腹腔，他汀組大鼠給予辛伐他汀0.2 mg/kg 灌胃，各組大鼠1/d，連續(xù)干預(yù)14 d。健康組及病變組大鼠不進(jìn)行用藥，給予等體積檸檬酸緩沖液腹腔注射，時間及劑量相同。

1.5 標(biāo)本組織采集 將各組大鼠用戊巴比妥鈉麻醉處死后，十字型剪開眼眶骨組織后暴露眼球，取出整個眼球，立即進(jìn)入PBS 沖洗，放入無菌玻璃器皿，在眼科手術(shù)顯微鏡下用眼科鑷剝離視網(wǎng)膜組織，低溫保存。

1.6 視網(wǎng)膜組織HE染色 將各組大鼠視網(wǎng)膜組織置于4%多聚甲醛液固定24 h，取出已經(jīng)固定好的視網(wǎng)膜組織，梯度酒精脫水，透明，浸蠟包埋、切片取4μm 厚度，用二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，水洗5 min，置于蘇木精染色10 min，水洗，置于伊紅染色10 min，再次梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察染色情況。

1.7 免疫熒光法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織ROS 表達(dá) 取大鼠視網(wǎng)膜組織，用PBS 清洗，共清洗3 次，3%過氧化氫室溫孵育10 min，再用10%山羊血清封閉1 h，滴加一抗ROS（1：200），4 ℃過夜，于次日用PBS 清洗，共3 次，滴加二抗山羊抗兔（1：200），孵育1 h，再次PBS 沖洗3 次，滴加DA-PI 孵育10 min，抗熒光淬滅封片。熒光顯微鏡下觀察，檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織中ROS的表達(dá)。

1.8 檢測大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力以及脂質(zhì)過氧化物丙二醛（malonaldehyde, MDA）蛋白表達(dá) 取各組大鼠視網(wǎng)膜組織50 g 進(jìn)行勻漿后離心，離心速度為1500 r/min，離心時間為10 min，取上清液。SOD 活性檢測采用WST-1 法，GSH-Px 活力檢測使用比色法，MDA 含量的檢測使用TBA 法，嚴(yán)格按照試劑盒操作，每個實驗檢測3次。

1.9 Western blot 檢測大鼠視網(wǎng)膜組織中核因子相關(guān)因子（Nrf2）2、HO-1、NO、iNOS 蛋白的表達(dá) 各組大鼠視網(wǎng)膜加入蛋白裂解液快速混勻，運轉(zhuǎn)離心機后保留上清液，放置在75 ℃水浴10 min使蛋白變性后放入樣孔中灌膠和上樣，每組取5 μg蛋白進(jìn)行電泳實驗。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜TBS浸泡10 min，反復(fù)PBS沖洗，每次5 min，加入1抗Nrf2、HO-1、NO、iNOS抗體(1:1000)，孵育過夜，后放入2抗辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（1:2000）雜交沖洗。浸入ECL工作液，檢測，顯色等步驟，成像系統(tǒng)對印跡條帶的光密度進(jìn)行分析。GAPDH作為內(nèi)參。

1.10 PCR法檢測大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1表達(dá) 各組大鼠視網(wǎng)膜組織研磨，提取總RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄總cDNA，采用Trizol 法提取總RNA，無核酸酶溶解。將提取的RNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄為cDNA，獲得反體系，條件為：42 ℃作用60 min，72 ℃作用5 min，4 ℃終點。每個細(xì)胞設(shè)置6個復(fù)孔，以GAPDH為內(nèi)參，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)作用3 min，95 ℃作用5 s，58 ℃退火，40個循環(huán)。表1。

表1 引物序列

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 眼底熒光血管造影檢查視網(wǎng)膜病變大鼠成模情況 病變組大鼠眼底可見微血管瘤,后期滲漏,呈強熒光,毛細(xì)血管管壁著染,視網(wǎng)膜可見小片出血遮蔽熒光。健康組大鼠眼底未見明顯異常熒光，圖1。

圖1 眼底熒光血管造影檢查

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜HE 染色比較 健康組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)、外核層細(xì)胞排列緊密、規(guī)律，表面光滑平整；病變組內(nèi)外核細(xì)胞的單元間隙明顯縮小，細(xì)胞排列不規(guī)則，內(nèi)在限制膜存在輕微腫脹，表面不光滑；他汀組和甘肽組細(xì)胞排列較規(guī)則，內(nèi)在限制膜表面較光滑，病變明顯改善。圖2。

圖2 各組大鼠HE染色（×200）

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中ROS 表達(dá)水平 與健康組大鼠ROS（1.00±0.00）比較，病變組大鼠視網(wǎng)膜組織中ROS(1.97±0.12)表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）；與病變組比較，他汀組ROS 表達(dá)(1.75±0.11)和甘肽組視網(wǎng)膜組織中ROS 表達(dá)(1.13±0.09)水平明顯降低（P<0.05）；與他汀組比較，甘肽組ROS表達(dá)降低明顯（P<0.05）。圖3。

圖3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中ROS表達(dá)水平（×200）

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激指標(biāo) 與健康組比較，病變組視網(wǎng)膜組織中SOD、GSH-Px 水平降低，MDA水平升高（P<0.01），與病變組比較，他汀組和甘肽組視網(wǎng)膜組織中SOD、GSH-Px 水平明顯降低，MDA水平明顯升高（P<0.01），與他汀組比較，甘肽組SOD、GSH-Px水平升高明顯，MDA水平升高明顯（P<0.01）。表2。

表2 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）

表2 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）

與健康組比較，#P<0.01；與病變組比較，*P<0.01；與他汀組比較，▲P<0.01。

組別健康組病變組他汀組甘肽組FP n 12 12 12 12 SOD（ng/mL）629.21±29.45 401.36±20.14#503.34±15.49*#589.38±20.68*#▲168.30<0.001 GSH-Px（ng/mL）235.56±9.97 86.59±8.45#110.59±19.46*#199.54±14.95*#▲208.20<0.001 MDA（mmol/L）4.78±0.09 15.84±1.47#9.49±1.31*#6.01±0.75*#▲176.90<0.001

2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1 蛋白水平表達(dá) 與健康組比較，病變組視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1 蛋白水平降低（P<0.05），與病變組比較，他汀組和甘肽組視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1蛋白水平明顯升高（P<0.05），與他汀組比較，甘肽組視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1蛋白水平上升明顯（P<0.05）。表3，圖4。

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1水平比較（±s）

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2、HO-1水平比較（±s）

與健康組比較#P<0.05；與病變組比較*P<0.05；與他汀組比較▲P<0.05。

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圖4 各組大鼠Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平

2.6 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中NO、iNOS 的蛋白水平表達(dá) 與健康組比較，病變組NO、iNOS 水平升高（P<0.05），與病變組比較，他汀組和甘肽組NO、iNOS 水平降低（P<0.05），與他汀組比較，甘肽組NO、iNOS水平降低明顯（P<0.05）。表4。

表4 各組大鼠NO、iNOS的水平表達(dá)（±s）

表4 各組大鼠NO、iNOS的水平表達(dá)（±s）

與健康組比較#P<0.05；與病變組比較*P<0.05；與他汀組比較▲P<0.05。

組別健康組病變組他汀組甘肽組FP n 12 12 12 12 NO 0.58±0.07 1.55±0.21#1.23±0.16*#1.05±0.13*#▲57.39<0.001 iNOS 0.46±0.05 1.41±0.19#?1.12±0.14*#0.97±0.11*#▲72.016<0.001

圖5 各組大鼠NO、iNOS蛋白水平表達(dá)

2.7 各組大鼠Nrf2、HO-1mRNA 的表達(dá) 與健康組比較，病變組Nrf2mRNA、HO-1mRNA 水平降低（P<0.05），與病變組比較，他汀組和甘肽組Nrf2mRNA、HO-1mRNA 水平明顯升高（P<0.05），與他汀組比較，甘肽組Nrf2mRNA、HO-1mRNA 水平明顯升高（P<0.05）。表5。

表5 各組大鼠Nrf2、HO-1mRNA表達(dá)的比較（±s）

表5 各組大鼠Nrf2、HO-1mRNA表達(dá)的比較（±s）

與健康組比較#P<0.05；與病變組比較*P<0.05；與他汀組比較▲P<0.05。

組別健康組病變組他汀組甘肽組F P n 12 12 12 12 Nrf2mRNA 1.00±0.03 0.32±0.02#0.55±0.04*#0.84±0.09*#▲123.600<0.001 HO-1mRNA 1.00±0.04 0.15±0.02#0.20±0.03*#0.42±0.02*#▲147.300<0.001

3 討論

糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機制尚無明確結(jié)論，糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)展史復(fù)雜的病理過程，是多種因素共同作用所致，其主要的病理變化包括高血糖、微血管病變和神經(jīng)組織病變等[10-11]。有研究顯示糖尿病引起的視網(wǎng)膜病變、肝臟等疾病，與機體內(nèi)自由基增長和抗氧化能力下降有關(guān)[12-13]。還原型谷胱甘肽(GSH)是一種抗氧化劑同時也是機體內(nèi)重要的還原劑，存在于人體各種組織和細(xì)胞中，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)蛋白質(zhì)和核苷酸合成的作用，并與機體中的抗氧化能力有關(guān)[14]。糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病過程中氧化應(yīng)激占主導(dǎo)位置[15]。辛伐他汀屬于他汀類藥物，對冠心病有較好的治療作用，同時還有降血脂的作用，除此之外，還可以促進(jìn)血管新生，對糖尿病的視網(wǎng)膜病變有一定的治療作用，但是辛伐他汀對患者的肝臟功能及肌肉反應(yīng)有影響。目前研究顯示高血糖引起的活性氧簇增多是DR 發(fā)病的始動因素。ROS將導(dǎo)致多種視網(wǎng)膜細(xì)胞功能障礙，包括視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡及視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的紊亂[16-17]。有學(xué)者通過研究紅斑狼瘡患者發(fā)現(xiàn)，GSH 可以下調(diào)患者中性粒細(xì)胞ROS 的水平，在紅斑狼瘡的治療中起到了積極作用[18]。在糖尿病患者氧化應(yīng)激過程中，各種氧自由基不斷攻擊視網(wǎng)膜，發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用。有研究發(fā)現(xiàn)DR 大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，MDA 水平升高，SOD和GSH-Px活力降低，說明DR大鼠處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，控制機體自由基平衡，有助于糖尿病視網(wǎng)膜病變的控制。SOD 是重要的抗氧化酶,其可清除細(xì)胞內(nèi)過多的活性氧，保護(hù)細(xì)胞免受自由基的氧化損傷。原型谷胱甘肽能和自由基結(jié)合，對抗氧化對巰基的破壞，保護(hù)身體重要臟器，可以免受自由基的破壞。谷胱甘肽參與人體的氧化還原反應(yīng)，同時還可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生。還原型谷胱甘肽是減少細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激作用的重要物質(zhì)，GSH-Px 作用降低時，GSH 的生成會減少，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)增加，造成細(xì)胞損傷[19]。徐輝勇等研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過柚皮素干預(yù)后，糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠的視網(wǎng)膜組織中的MDA 水平明顯下降，SOD 和GSH-Px活力明顯升高，柚皮素可以拮抗氧化應(yīng)激，減輕DR 大鼠視網(wǎng)膜病變[20]。本文研究發(fā)現(xiàn)病變組SOD、GSH-Px水平降低，MDA、ROS 表達(dá)水平升高，經(jīng)過干預(yù)后，甘肽組SOD、GSH-Px 水平升高，MDA、ROS 表達(dá)水平降低明顯。本文研究和上述研究一致。

Nrf2 是一種維持細(xì)胞氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子。正常條件下，Nrf2 存在于細(xì)胞質(zhì)中，ARE 存在于細(xì)胞核內(nèi)，受到自由基刺激時，活化的Nrf2 進(jìn)入細(xì)胞核，并與ARE結(jié)合，從而啟動受Nrf2-ARE調(diào)控的氧化還原酶類，調(diào)控抗氧化酶，進(jìn)而提高細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力。有研究表明葡萄籽原花青素可增加DR大鼠視網(wǎng)膜Nrf2和HO-1的表達(dá)水平，激活Nrf2 來改善氧化應(yīng)激介導(dǎo)的DR 大鼠視網(wǎng)膜損傷[21]。Nrf2 通路具有抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、神經(jīng)保護(hù)等多種作用，同時在糖尿病視網(wǎng)膜病變中起到一定作用[22]。到目前為止很多的實驗和研究亦已證明Nrf2在高氧化應(yīng)激狀態(tài)的疾病中都有保護(hù)作用，并決定了機體對氧化應(yīng)激的敏感性和機體炎性反應(yīng)的嚴(yán)重程度。糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠的GSH-Px活力降低時，GSH 的生成會減少，GSH-Px和Nrf2在糖尿病視網(wǎng)膜病變中成正相關(guān)。原型谷胱甘肽是含有巰基的體內(nèi)最重要的抗氧化物之一，在酶的催化下能與過氧化物和自由基結(jié)合，對抗氧化物的破壞作用。GSH 能激活多種酶，促進(jìn)糖、脂肪及蛋白質(zhì)的代謝。有研究還原谷胱甘肽可以通過P38MAPK 通路誘導(dǎo)HO-1 的表達(dá)來組織腎臟近曲小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的損傷。本文研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜發(fā)生病變時Nrf2、HO-1 水平降低，經(jīng)過原型谷胱甘肽干預(yù)后甘肽組Nrf2、HO-1 水平上升，說明原型谷胱甘肽可干預(yù)Nrf2-ARE 信號通路對DR疾病的發(fā)生發(fā)展有影響。

NO 是體內(nèi)最強的血管擴張因子，同時也是活躍的免疫分子和炎癥介質(zhì)，在糖尿病視網(wǎng)膜病變中不僅參與視網(wǎng)膜血流動力學(xué)和血液流變學(xué)改變，還能增加視網(wǎng)膜血管通透性，參與破壞血-視網(wǎng)膜屏障，還影響視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的功能。NO 的合成有賴于一氧化氮合酶(NOS)，同時多種細(xì)胞表達(dá)誘導(dǎo)型NOS(iNOS)增多，導(dǎo)致cNOS／iNOS 失衡，NO合成過量[23]。NOS 在高糖刺激下可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞中iNOS的表達(dá)增加，導(dǎo)致NO 增加，NO 的過量產(chǎn)生和釋放則具有細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制作用，尤其是源于iNOS 的過度表達(dá)而產(chǎn)生的NO。高血糖時體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，也使iNOS表達(dá)增強，產(chǎn)生一系列自由基引起的氧化及硝化損傷，在視網(wǎng)膜神經(jīng)元以及血管的結(jié)構(gòu)與代謝方面產(chǎn)生損傷作用，從而加速DR 的進(jìn)展。還原谷胱甘肽可以抑制TNF、IL-6 等炎癥因子的活化，減少iNOS 的合成，使NO產(chǎn)生減少，減輕炎癥反應(yīng)對腎臟的損害。還原谷胱甘肽可與白細(xì)胞在氧化應(yīng)激時產(chǎn)生的過氧化酶衍生氧化物，阻止其進(jìn)一步參與氧自由基生成反應(yīng)，減少氧化反應(yīng)和炎癥反應(yīng)相互作用。本研究原型谷胱甘肽可顯著降低iNOS、NO 蛋白水平表達(dá)，增加Nrf2 和HO-1 表達(dá)量，同時降低ROS 和NO 水平，由次推斷說明原型谷胱甘肽能夠通過促進(jìn)Nrf2 和HO-1 表達(dá)，抑制iNOS 表達(dá)，進(jìn)而降低細(xì)胞炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞ROS產(chǎn)生，對細(xì)胞起到保護(hù)作用。

綜上所述：還原型谷胱甘肽可以調(diào)控Nrf2/iNOS 信號通路，改善氧化應(yīng)激反應(yīng)，對糖尿病視網(wǎng)膜病變其保護(hù)作用。