血漿外泌體源性miR-1224-5p與潰瘍性結(jié)腸炎患者炎性反應(yīng)狀態(tài)及預(yù)后的關(guān)系

林笑晗，賁 騰，馬 林，田 堯

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種原因不明的慢性結(jié)腸炎癥，具有發(fā)病率高、病程長(zhǎng)以及反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)，已逐漸成為影響我國(guó)群眾身體健康的疑難病[1]。有研究認(rèn)為，早期確診并給予治療對(duì)改善預(yù)后具有重要意義[2]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）屬于非編碼單鏈RNA 分子，參與機(jī)體調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、胚胎發(fā)育等多個(gè)過(guò)程[3]。外泌體是一種攜帶非編碼RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等多種物質(zhì)的小囊泡，是血漿miRNA 富集體[4]。已有研究證實(shí)，血漿外泌體源性miRNA 是預(yù)測(cè)疾病的診治及預(yù)后的有效標(biāo)志物[5]。既往已有研究發(fā)現(xiàn)miR-1224-5p在非酒精性脂肪性肝病的潛在治療中發(fā)揮重要作用[6]，但目前關(guān)于血漿外泌體源性miR-1224-5p 在UC 中表達(dá)水平以及與患者預(yù)后關(guān)系的研究結(jié)果尚不清楚。因此，本研究擬分析血漿外泌體源性miR-1224-5p 與UC 患者炎性反應(yīng)狀態(tài)及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2018年1月-2019年10月海安市人民醫(yī)院收治的103例UC患者，根據(jù)病情活動(dòng)程度分為活動(dòng)期組（指慢性炎細(xì)胞明顯浸潤(rùn)，上皮內(nèi)有中性粒細(xì)胞增多、伴或不伴隱窩破壞及糜爛）57例和緩解期組（指腸道黏膜無(wú)質(zhì)脆、出血、糜爛、潰瘍）46 例?；顒?dòng)期組：男性30 例，女性27；年齡25~65（43.36±3.65）歲；體質(zhì)指數(shù)（21.66±3.74）kg/m2；病變位置：直腸、乙狀結(jié)腸25例，左半結(jié)腸20例，全結(jié)腸12例。緩解期組：男性25例，女性21；年齡26~66（43.75±3.45）歲；體質(zhì)指數(shù)（21.57±3.68）kg/m2；病變位置：直腸、乙狀結(jié)腸21例，左半結(jié)腸16例，全結(jié)腸9例。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①UC患者均符合《中國(guó)炎癥性腸病組織病理診斷共識(shí)意見》中的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；②患者/家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重心肝腎功能障礙或惡性腫瘤疾病者；②存在結(jié)腸大出血等UC 相關(guān)并發(fā)癥或伴有結(jié)腸狹窄、梗阻其他結(jié)腸疾病者；③近期內(nèi)服用抗炎藥物或免疫抑制劑藥物者；④臨床資料不全者。選擇同期來(lái)我院體檢的60 例健康人群作為對(duì)照組，男性30例，女性30例；年齡25~66（43.44±3.70）歲；體質(zhì)指數(shù)（21.52±3.65）kg/m2。三組年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.162、χ2=0.205、F=0.023，P=0.851、0.902、0.978）。

1.2 方法

1.2.1 血漿采集與外泌體的鑒定 采用含EDTA 抗凝管抽取空腹外周靜脈血5 mL，4 ℃靜置2 h 后以3 300 g離心15 min后取上清，分裝至微型離心管并并存放至-80 ℃冰箱內(nèi)備用。取700 μL 血漿按外泌體試劑盒exoRNeasy Serum（美國(guó)Qiagen 公司）說(shuō)明書提取外泌體，并進(jìn)行外泌體鑒定。鑒定：將外泌體懸浮于無(wú)酶水中，滴200 目銅網(wǎng)，靜置1 min 并于干燥后用1%磷鎢酸染色20 s，隨后待樣本干燥后通過(guò)H7650 透射電鏡（日本日立公司）觀察外泌體形態(tài)。粒徑檢測(cè)：使用納米粒徑分析儀（ZETA‐SIZER Nanoseries-Nano-ZS，英國(guó)Malvern 公司）檢測(cè)外泌體的顆粒大小和濃度。采用流式細(xì)胞儀（美國(guó)ABI 公司）檢測(cè)外泌體標(biāo)志物CD63 和CD81 表達(dá)水平。表面標(biāo)志物檢測(cè)：采用流式細(xì)胞儀對(duì)樣本表面特異性標(biāo)志蛋白CD63 和CD81 進(jìn)行檢測(cè)。本研究具體步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative re‐al-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)采用TRIzol試劑盒（Invitrogen公司）提取UC與健康對(duì)照組患者血漿外泌體源性RNA，使用Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit 試劑盒（Invitrogen公司）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。通過(guò)exoRNeasy Midi試劑盒（美國(guó)Qiagen 公司）提取外泌體RNA。隨后使用qRT-PCR試劑盒及AppliedBiosystems7500熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）進(jìn)行進(jìn)行qRT-PCR分析，內(nèi)參為U6，上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5'-ACGCTTCACCGAATTTGVGA-3′。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃、15 s，60℃、30 s，72 ℃、30 s，共計(jì)35 個(gè)循環(huán)。并利用CFX manager 3.0 軟件對(duì)CT 值進(jìn)行計(jì)算，用2-△△Ct計(jì)算miRNA 相對(duì)表達(dá)量。

1.3 炎性反應(yīng)程度評(píng)價(jià)及分組 采用改良Baron 評(píng)分[8]評(píng)估UC 鏡下炎性反應(yīng)程度，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0 分（黏膜血管紋理清晰可見），1 分（輕度病變，血管紋理模糊，黏膜充血但未出血），2 分（中度病變，黏膜顆粒樣變化且出血），3 分（重度病變，黏膜潰瘍且出血）。采用Mayo 內(nèi)鏡評(píng)分（MES）[9]評(píng)估UC 臨床活動(dòng)度并將活動(dòng)期組分為輕、中、重組，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：≤2分表示癥狀緩解，3~5 分表示輕度活動(dòng)（輕度組22例），6~10分表示中度活動(dòng)（中度組19例），11~12分表示重度活動(dòng)（重度組16例）。

1.4 隨訪 本研究所有患者出院后通過(guò)電話隨訪及復(fù)診等方式進(jìn)行為期2年的隨訪，每月隨訪1次，隨訪率100%。并在隨訪期間通過(guò)結(jié)直腸鏡檢查評(píng)估患者復(fù)發(fā)情況，根據(jù)復(fù)發(fā)情況分為復(fù)發(fā)組29 例、未復(fù)發(fā)組74 例，其中復(fù)發(fā)指黏膜愈合后再次出現(xiàn)UC 相關(guān)癥狀，如腸黏膜血管紋理不清、出血、糜爛或潰瘍等。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資以用例數(shù)、百分比表示，組間比較采用四格表χ2檢驗(yàn)；采用Pearson 相關(guān)分析探討血漿外泌體源性miR-1224-5p 與Mayo 評(píng)分、Baron 評(píng)分的相關(guān)性；同時(shí)采用多因素Logistic 逐步回歸分析探討影響UC 患者預(yù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)因素，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體鑒定結(jié)果 H7650 透射電鏡下觀察外泌體的直徑為106 nm；納米粒徑分析儀粒徑檢測(cè)外泌體的平均粒徑為42.2 nm，粒徑分布系數(shù)為0.479；流式細(xì)胞儀檢測(cè)外泌體標(biāo)志物CD63 陽(yáng)性表達(dá)率為86.8%，CD81 陽(yáng)性表達(dá)率為63.9%。以上結(jié)果表示所提取外泌體符合正常特征。

2.2 血漿外泌體源性miR-1224-5p 相對(duì)表達(dá)量比較 活動(dòng)期組UC患者血漿外泌體源性miR-1224-5p相對(duì)表達(dá)量明顯高于緩解期組、對(duì)照組，緩解期組UC 患者血漿外泌體源性miR-1224-5p 相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。表1。

表1 各組血漿外泌體源性miR-1224-5p相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

表1 各組血漿外泌體源性miR-1224-5p相對(duì)表達(dá)量比較(±s)

與活動(dòng)期組比較，*P<0.05；與緩解期組比較，#P<0.05

組別活動(dòng)期組緩解期組對(duì)照組FP n 57 46 60外泌體源性miR-1224-5p 2.42±0.52 1.96±0.20*1.21±0.14*#10.126<0.001

2.3 活動(dòng)期不同程度UC 血漿外泌體源性miR-1224-5p、Mayo 評(píng)分、Baron 評(píng)分比較 活動(dòng)期重度組UC 患者血漿外泌體源性miR-1224-5p、Mayo 評(píng)分、Baron評(píng)分均明顯高于中度組和輕度組，中度組UC 患者血漿外泌體源性miR-1224-5p、Mayo 評(píng)分、Baron評(píng)分均明顯高于輕度組（P<0.05）。表2。

表2 活動(dòng)期不同嚴(yán)重程度UC血漿外泌體源性miR-1224-5p、Mayo評(píng)分、Baron評(píng)分比較(±s)

表2 活動(dòng)期不同嚴(yán)重程度UC血漿外泌體源性miR-1224-5p、Mayo評(píng)分、Baron評(píng)分比較(±s)

與輕度組比較，*P<0.05；與中度組比較，#P<0.05

組別輕度組中度組重度組FP n 22 19 16外泌體源性miR-1224-5p 1.96±0.25 2.50±0.50*2.96±0.58*#8.571<0.001 Mayo評(píng)分4.50±0.63 7.36±1.02*11.18±0.66*#98.300<0.001 Baron評(píng)分1.18±0.18 2.12±0.25*3.06±0.33*#27.830<0.001

2.4 活動(dòng)期UC 血漿外泌體源性miR-1224-5p 與Mayo、Baron 評(píng)分相關(guān)性分析 經(jīng)Pearson 直線相關(guān)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體源性miR-1224-5p 相對(duì)表達(dá)量與Mayo 評(píng)分、Baron 評(píng)分均呈正相關(guān)（均P<0.05）。見表3，圖1、圖2。

圖1 血漿外泌體源性miR-1224-5p相對(duì)表達(dá)量與Mayo評(píng)分相關(guān)性

圖2 血漿外泌體源性miR-1224-5p相對(duì)表達(dá)量與Baron評(píng)分相關(guān)性

表3 活動(dòng)期UC血漿外泌體源性miR-1224-5p與Mayo、Baron評(píng)分相關(guān)性

2.5 不同預(yù)后UC 患者血漿外泌體源性miR-1224-5p 相對(duì)表達(dá)量與Mayo 評(píng)分、Baron 評(píng)分比較 57例活動(dòng)期UC患者復(fù)發(fā)22例（38.60%），46例緩解期UC 患者復(fù)發(fā)9 例（19.56%），說(shuō)明活動(dòng)期UC 更容易復(fù)發(fā)（χ2=4.382，P=0.036）。復(fù)發(fā)組UC 患者血漿外泌體源性miR-1224-5p 相對(duì)表達(dá)量與Mayo 評(píng)分、Baron評(píng)分均明顯高于未復(fù)發(fā)組（P<0.05）。表4。

表4 不同預(yù)后UC血漿外泌體源性miR-1224-5p及Mayo評(píng)分、Baron評(píng)分比較(±s)

表4 不同預(yù)后UC血漿外泌體源性miR-1224-5p及Mayo評(píng)分、Baron評(píng)分比較(±s)

組別復(fù)發(fā)組未復(fù)發(fā)組t P n 29 74外泌體源性miR-1224-5p 3.48±0.63 2.69±0.47 6.261<0.001 Mayo評(píng)分11.58±0.65 6.88±0.41 43.917<0.001 Baron評(píng)分3.28±0.30 2.35±0.22 17.340<0.001

2.6 UC 患者復(fù)發(fā)的多因素Logistic 逐步回歸分析以UC 患者是否復(fù)發(fā)為因變量（否=0、是=1），以血漿外泌體源性miR-1224-5p 相對(duì)表達(dá)量、Mayo 評(píng)分、Baron評(píng)分、年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、病變位置、病情活動(dòng)程度為自變量，采用多因素Logistic 逐步回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體源性miR-1224-5p 相對(duì)表達(dá)量、Mayo 評(píng)分、Baron 評(píng)分、活動(dòng)期均為影響UC復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素（P<0.05）。見表5。

表5 UC患者復(fù)發(fā)的多因素Logistic回歸分析

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎是臨床常見的消化科疾病，主要表現(xiàn)為腹瀉、黏液膿血便、腹痛等癥狀，同時(shí)發(fā)作期與緩解期交替出現(xiàn)或呈持續(xù)性并逐漸加重，嚴(yán)重時(shí)可危及患者生命，近年來(lái)UC患病率呈不斷上升，被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一[11]。因此，為了控制疾病進(jìn)展以及改善預(yù)后，早期診斷并給予治療是目前臨床關(guān)注的熱點(diǎn)。目前關(guān)于UC發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但有多數(shù)學(xué)者認(rèn)為UC與基因、免疫功能及外源性物質(zhì)引發(fā)的宿主反應(yīng)等因素有關(guān)[12]。因此，本次研究分析血漿外泌體源性miR-1224-5p與UC患者炎性反應(yīng)狀態(tài)及預(yù)后的關(guān)系。

miRNA 主要由大約21~25 個(gè)核苷酸組成，是在真核生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的短序、內(nèi)源啟動(dòng)的非編碼RNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平具有組織特異性的降解或抑制靶mRNA的翻譯來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，具有參與細(xì)胞代謝、增殖、分化、凋亡、炎癥和免疫應(yīng)答發(fā)生，是目前早期評(píng)估多種疾病預(yù)后的生物標(biāo)志物[13]。既往有研究顯示，多種miRNA 表達(dá)水平與潰瘍性結(jié)腸炎病程相關(guān)，并隨病程呈增高趨勢(shì)[14]。而miR-1224-5p 屬于miRNA 眾多中一員，有研究結(jié)果表明，miR-1224-5p在結(jié)直腸腫瘤中異常表達(dá)，且與臨床預(yù)后相關(guān)[14]，外泌體是多囊泡體（multivesicular‐body，MVBS）與細(xì)胞膜接觸融合而釋放的納米級(jí)圓形或橢圓形生物活性小囊泡，內(nèi)含RNA、DNA 片段、蛋白質(zhì)等多種生物活性物質(zhì)，具有信息攜帶功能，向靶細(xì)胞傳遞生物信息等作用[16]。既往研究顯示，外泌體miRNAs 可作為早期鑒別診斷結(jié)直腸癌患者的新型候選腫瘤標(biāo)志物[17]，可能是由于血漿外泌體miRNA 相對(duì)其他來(lái)源的miRNA，由于具有易于檢測(cè)、穩(wěn)定性好、不易降解、有效載體等優(yōu)點(diǎn)而逐漸成為評(píng)估疾病病情以及預(yù)后具有潛力的生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)[18]。

本次研究結(jié)果顯示，活動(dòng)期UC 患者血漿外泌體源性miR-1224-5p 相對(duì)表達(dá)量明顯高于緩解期、對(duì)照組（P<0.05），表示血漿外泌體源性miR-1224-5p 相對(duì)表達(dá)量在UC 患者中升高。既往有研究顯示，血漿外泌體源性miR-1224-5p 重癥肌無(wú)力患者中表達(dá)升高[19]，與本研究結(jié)果一致。同時(shí)本研究通過(guò)活動(dòng)期不同程度分組結(jié)果顯示，活動(dòng)期重度組UC 患者血漿外泌體源性miR-1224-5p 相對(duì)表達(dá)量明顯高于中度組、輕度組（P<0.05），說(shuō)明血漿外泌體源性miR-1224-5p 相對(duì)表達(dá)量能夠反應(yīng)UC 患者病情嚴(yán)重程度。為進(jìn)一步驗(yàn)證本研究經(jīng)Pearson 直線相關(guān)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體源性miR-1224-5p相對(duì)表達(dá)量與Mayo評(píng)分、Baron評(píng)分均呈正相關(guān)（均P<0.05），當(dāng)外泌體源性miR-1224-5p 相對(duì)表達(dá)量升高時(shí)，Mayo 與Baron 評(píng)分也升高，說(shuō)明血漿外泌體源性miR-1224-5p 與UC 患者炎癥反應(yīng)程度有關(guān)，可作為評(píng)估UC 病情嚴(yán)重程度以及炎癥反應(yīng)狀況的生物學(xué)標(biāo)志物。本次研究通過(guò)隨訪發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)組UC 患者血漿外泌體源性miR-1224-5p 相對(duì)表達(dá)量與Mayo 評(píng)分、Baron 評(píng)分均明顯高于未復(fù)發(fā)組（P<0.05），說(shuō)明血漿外泌體源性miR-1224-5p 與UC 患者預(yù)后存在關(guān)系。因此，為了解影響UC 患者預(yù)后的因素，本研究多因素Logistic 回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體源性miR-1224-5p 相對(duì)表達(dá)量是影響UC 復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，由此證實(shí)血漿外泌體源性miR-1224-5p 與UC 發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后有關(guān)，能夠作為評(píng)估UC 預(yù)后的有效指標(biāo)。

綜上所述，血漿外泌體源性miR-1224-5p 相對(duì)表達(dá)量在活動(dòng)期UC 患者中升高，并隨著臨床嚴(yán)重程度上升而逐漸升高，且與炎性反應(yīng)程度呈正相關(guān)，同時(shí)與UC患者復(fù)發(fā)密切相關(guān)，有助于臨床治療以及改善預(yù)后情況。但是由于本次研究實(shí)驗(yàn)樣較少，且未進(jìn)行單因素分析，因此更多的研究需進(jìn)一步探索。