外源Zn對土壤抗生素抗性基因及細(xì)菌群落的誘導(dǎo)作用

楊統(tǒng)一，李 靜，唐國騰，楊 芬，唐玉斌

(1.江蘇科技大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212100；2.鎮(zhèn)江海關(guān)綜合技術(shù)中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212003)

抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的水平基因轉(zhuǎn)移風(fēng)險被世界衛(wèi)生組織確定為21世紀(jì)衛(wèi)生安全領(lǐng)域的主要挑戰(zhàn)[1]，其可通過禽畜糞肥、污泥農(nóng)用及污水灌溉等方式大量進(jìn)入農(nóng)田土壤，并可能傳播至人類致病菌，嚴(yán)重威脅公共安全[2]。目前發(fā)現(xiàn)在臨床和自然環(huán)境中減少抗生素的使用有時不能有效地控制ARGs在環(huán)境中的傳播[3]，表明環(huán)境中還存在其他因素驅(qū)動ARGs的傳播擴(kuò)散。

在重金屬污染的土壤環(huán)境中，細(xì)菌不僅具有重金屬抗性，而且通過共選擇、間接選擇等機(jī)制還可能激發(fā)抗生素抗性，進(jìn)而提高ARGs水平轉(zhuǎn)移的風(fēng)險[4]。重金屬污染作為一種長期、廣泛的選擇壓力，難以被降解，使土壤中ARGs得以維持和增強(qiáng)[5]。重金屬Zn離子作為土壤中細(xì)菌生長所必需的微量元素，當(dāng)濃度較低時可以促進(jìn)細(xì)菌的生長，但是一旦超過一定的閾值就會對細(xì)菌有害，降低生物多樣性，甚至殺死菌體[6]。歐盟在2010年評估土壤Zn累積污染的影響時發(fā)現(xiàn)，農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)在未來10～50 a內(nèi)Zn濃度可能超過安全閾值[7]。2014年《土壤重金屬污染公報》顯示，我國土壤Zn污染以輕微和輕度污染為主，點位超標(biāo)率為0.9%。而農(nóng)田土壤的Zn污染風(fēng)險較高，因為我國每年向土壤施用6.18億t以上糞肥，是土壤Zn污染的重要來源，對農(nóng)田土壤生態(tài)安全構(gòu)成了巨大風(fēng)險[8]。研究發(fā)現(xiàn)，施用糞肥的土壤Zn、Cu及Pb含量顯著增加，與sul1、sul2、tetG、tetW、ermF和ermB等ARGs呈顯著正相關(guān)，表明重金屬參與ARGs共選擇過程；且與整合子intl1呈顯著正相關(guān)，揭示重金屬可能誘導(dǎo)可移動遺傳元件(mobile genetic elements，MGEs)參與土壤ARGs的擴(kuò)散[9]。

土壤中包括溫度、含水量、重金屬離子及pH值等多種因素共同影響細(xì)菌群落和ARGs，進(jìn)而影響ARGs的產(chǎn)生和傳播[3,10]。目前土壤重金屬對ARGs影響的研究中多存在其他干擾因素，無法準(zhǔn)確評估重金屬的直接效應(yīng)[8,11]，且重金屬Zn作為單一因素影響土壤ARGs的閾值、濃度效應(yīng)及遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律未見報道，阻礙了Zn在土壤環(huán)境中風(fēng)險的準(zhǔn)確評估。筆者基于室內(nèi)培養(yǎng)實驗，采用Miseq高通量測序分析和熒光定量PCR技術(shù)，分析Zn對土壤中氨基糖苷類ARGs及MGEs相對豐度的影響，研究Zn誘導(dǎo)ARGs與細(xì)菌群落的濃度效應(yīng)，以期為預(yù)測及治理土壤ARGs污染提供科學(xué)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 Zn處理土壤實驗設(shè)計與取樣

實驗土壤來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所試驗站(鎮(zhèn)江)的桑樹苗圃，為長江近代石灰性新沖積物母質(zhì)發(fā)育的黃棕壤(pH=7.4)[12]，w(有機(jī)碳)為2.95 g kg-1，w(總氮)為765.37 mg·kg-1，w(總磷)為23.57 mg·kg-1，黏土、粉土和砂的含量比例為42∶36∶22。土壤重金屬含量由ICP-OES法測定(Varian,720-ES,美國)，Zn、Cr、Cd、Cu、Ni及Pb的w分別為91.48、64.7、2.36、30.75、32.3及38.37 mg·kg-1。Zn處理前將土壤風(fēng)干過2 mm孔徑篩，攪拌使土壤均質(zhì)化。根據(jù)調(diào)研農(nóng)田土壤中廣泛存在的Zn污染水平來設(shè)計Zn處理的濃度[8,10]。提前準(zhǔn)備ZnSO4母液，處理土壤時按照處理濃度稀釋。Zn處理濃度分別為0(對照)、100、200、400、800和1 000 mg·kg-1，每處理裝150 g干土，3個生物學(xué)重復(fù)。整個處理過程放置在培養(yǎng)箱中，瓶口覆蓋保鮮膜，土壤含水量(稱重法)保持在30%左右，溫度25 ℃，光周期夜晚(L)∶白天(D)= 12 h∶12 h。處理30和60 d時取土樣分析。土壤取樣后置于-20 ℃條件下保存。

1.2 MiSeq 測序及數(shù)據(jù)分析

土壤DNA的提取及高通量測序委托江蘇中益金達(dá)分析檢測有限公司(中國宜興)進(jìn)行。采用土壤提取試劑盒Fast DNA SPIN Kit(MP Biomedicals, USA)，從1 g土壤混合樣品(3個重復(fù)樣混合)中提取DNA，然后利用w為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。采用分光光度法(NanoDrop ND-1000,Thermo Scientific, USA)對提取的DNA定量。以16S rRNA基因V1～V2高變區(qū)為靶點，利用引物F:5′-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3′、R:5′-TGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增在25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行，該反應(yīng)體系包含1 μL正向引物(10 μmol·L-1)和1 μL反向引物(10 μmol·L-1)、12.5 μL 2×EasyTaq PCR Super Mix(Transgene，北京)、1 μL(10 ng·μL-1)模板DNA和9.5 μL超純水。PCR反應(yīng)的程序為:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s共20個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

用UCHIME識別測序數(shù)據(jù)并去除非特異擴(kuò)增及嵌合序列，用UPARSE 7.1軟件對相似性為97%的操作分類單元(OTU)進(jìn)行聚類。根據(jù)序列最少的樣本，使用序列數(shù)標(biāo)準(zhǔn)對OTU數(shù)進(jìn)行歸一化，用Mothurv.1.35.1軟件計算多樣性指數(shù)[13]。測序數(shù)據(jù)已提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號NO.SRP117127。

1.3 qPCR分析

根據(jù)前期PCR擴(kuò)增結(jié)果，選擇4個氨基糖苷類ARGs:aac、aacC1、aacA/aphD和aac6′-II，3個轉(zhuǎn)座酶基因(tnpA、IS613和Tp614)和1個整合酶基因intI1(表1)。使用7300型qPCR儀(Applied Biosystems，USA)執(zhí)行以下程序：95 ℃ 預(yù)變性 5 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s、72 ℃ 40 s共40個循環(huán)。反應(yīng)體系為 20 μL，包含10 μL SYBR PremixEx TaqTM (大連Takara)， 0.6 μL引物(10 μmol·L-1)，7.8 μL去離子水，1 μL模板DNA。同時檢測無DNA模板的陰性對照。每個樣品的擴(kuò)增反應(yīng)由3個重復(fù)組成，根據(jù)熔解曲線計算每個靶基因的拷貝數(shù)，并歸一化為16S rDNA 拷貝數(shù)[8]。相對豐度為ARGs/16S rDNA。

表1 供試基因的實時定量PCR引物

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2016版及Origin 9.3等軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。在Gephi平臺上使用MGEs、ARGs和細(xì)菌群落(基于OTU)的相對豐度進(jìn)行基于Spearman秩相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)分析；冗余分析(RDA)采用Canoco5軟件進(jìn)行分析[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基糖苷類抗生素抗性基因?qū)n脅迫的響應(yīng)

qPCR分析表明，不同Zn濃度誘導(dǎo)氨基糖苷類ARGs相對豐度的差異顯著(圖1)。

同一組直方柱上方英文小寫字母不同表示不同處理間ARGs差異顯著(P<0.05)。

Zn脅迫60 d比30 d時對ARGs的影響更大，且對不同的基因影響程度不一樣；從濃度效應(yīng)來看，高濃度的Zn對ARGs的影響更大，且不同基因?qū)n的響應(yīng)濃度不同。從Zn離子對acc的影響來看，處理30 d時100、200和400 mg·kg-1Zn對其沒有顯著影響，而800 mg·kg-1時提高到對照的3.4倍；處理60 d時，100 mg·kg-1Zn處理是對照的2.6倍，1 000 mg·kg-1Zn處理是對照的4.1倍。與對照相比，不同Zn離子處理30 d時aacC1都顯著降低；處理60 d時aacC1顯著高于對照，1 000 mg·kg-1Zn處理時達(dá)到對照的9.7倍。與對照相比，100和200 mg·kg-1Zn處理30 d時對aac(6′)-II沒有顯著影響，而400 mg·kg-1時提高到2.1倍；100 mg·kg-1Zn處理60 d時與對照也有顯著差異，達(dá)到3.7倍；800 mg·kg-1Zn處理時達(dá)到最大，為對照的13.7倍，而1 000 mg·kg-1Zn處理時下降為對照的11.6倍。與其他基因相對豐度大幅提高不同，Zn處理使aacA/aphD基因的相對豐度不斷下降，最低為對照的0.14倍。

2.2 可移動遺傳元件對Zn脅迫的響應(yīng)

使用qPCR檢測所有樣本中的3個(tnpA、IS613和Tp614)和1個整合酶基因(int11)(圖2)。Zn處理30 d對tnpA相對豐度的影響顯著高于60 d；低濃度Zn也能顯著提高其相對豐度，且1 000 mg·kg-1Zn處理時最高，為對照的10.9倍。與對照相比，處理30 d時100、200、400和800 mg·kg-1Zn處理時顯著降低IS613的相對豐度，而1 000 mg·kg-1時提高到對照的1.1倍，差異不顯著；60 d時，100 和200 mg·kg-1Zn處理與對照沒有顯著差異，而400、800和1 000 mg·kg-1Zn處理顯著高于對照。與對照相比，30 d時所有Zn濃度處理顯著降低Tp614的相對豐度； 60 d時所有Zn濃度處理都顯著提高其相對豐度，最高達(dá)對照的4.7倍，但1 000 mg·kg-1Zn處理時降為對照的2.1倍。與對照相比，30 d時100和200 mg·kg-1Zn處理有降低int11相對豐度的趨勢，但差異不顯著，而400、800和1 000 mg·kg-1Zn處理就顯著提高了其相對豐度； 60 d時， 200、400、800和1 000 mg·kg-1Zn處理都顯著高于對照，最大為對照的3.7倍。

同一組直方柱上方英文小寫字母不同表示不同處理間MGEs差異顯著(P<0.05)。

2.3 Zn脅迫對土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

為進(jìn)一步了解土壤細(xì)菌受到的影響，利用Illumina MiSeq高通量測序?qū)ν寥罉悠分械募?xì)菌群落進(jìn)行分析。不同處理土壤樣品的OTU從4 109到5 984 不等(表2)。

表2 土壤中細(xì)菌多樣性指數(shù)

2.4 Zn脅迫對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1在門水平上的影響

Zn脅迫對土壤細(xì)菌群落門水平影響的高通量測序結(jié)果(圖3)表明，在已鑒定的26個細(xì)菌門中，在所有處理土壤樣品中的主要菌群是變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，其平均總相對豐度占比分別為26.5%～45.1%、9.8%～19.7%、10.3%～15.9%、5.4%～13.4%和3.1%～16.6%。其中變形菌門所占比例最大，Zn處理大幅度提高了該門的占比，特別是高濃度處理(400～1 000 mg·kg-1)時，最大提高了12.8%。但60 d時，1 000 mg·kg-1Zn處理比對照低4.6%。Zn處理對芽單胞菌門的影響表現(xiàn)為短期(30 d)呈下降趨勢;隨著處理時間的延長(60 d)，1 000 mg·kg-1Zn處理時增加了1倍。

圖3 Zn處理對土壤細(xì)菌群落門水平上的影響Fig.3 Bacterial communities at phylum level in all soil samples under Zn stress

2.4.2在屬水平上的影響

對Zn處理土壤細(xì)菌(屬水平)的熱圖分析反映了Zn脅迫影響屬水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性(圖4)。總體來看，在屬水平上各樣品細(xì)菌群落熱圖分為2個主要的簇。簇1主要是Zn處理濃度為400～1 000 mg·kg-1的樣品聚類在一起;簇2是Zn處理濃度為0～200 mg·kg-1的樣品聚類在一起。但1 000 mg·kg-1Zn處理60 d時，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與其他濃度處理的結(jié)構(gòu)差異較大。30 d時，芽單胞菌屬(Gemmatimonas)的相對豐度隨著處理濃度的增加逐漸降低；1 000 mg·kg-1Zn處理60 d時提高了芽單胞菌屬的相對豐度，為原來的2倍。所有樣品中Flavisolibacter、Arthrobacter、Lysobacter屬和Acidobacteria_Gp4、Acidobacteria_Gp6的相對豐度都超過1%。此外，隨著Zn濃度的增加，Ohtaekwangia、Sphingomonas、Luteimonas、Micromonospora和Streptomyces屬的相對豐度增加，表明這些屬可能適應(yīng)了高濃度Zn引起的脅迫壓力。

圖4 屬水平上細(xì)菌群落相對豐度(>1%)熱圖分析Fig.4 Heat map analysis of the relative abundance of bacteria (>1%) at genus level

2.5 抗生素抗性基因水平轉(zhuǎn)移相關(guān)因子對Zn脅迫的響應(yīng)

2.5.1土壤細(xì)菌群落、抗生素抗性基因及可移動遺傳元件與Zn濃度的相關(guān)性

為了明確Zn脅迫對ARGs水平轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的影響，采用RDA分析了土樣、細(xì)菌群落(屬水平)、ARGs及MGEs的關(guān)系，RDA分析時選取相對豐度在1%以上的12個菌群，結(jié)果見圖5。RDA1(Zn處理)能夠解釋22.6%的總變異，RDA2能夠解釋65.7%的總變異，大于Zn處理的影響。從樣品的細(xì)菌群落分布來看，Zn處理土壤30和60 d對細(xì)菌結(jié)構(gòu)的影響明顯不同，且隨著Zn濃度的提高影響程度加深；從處理濃度來看，中等濃度(100～400 mg·kg-1)Zn處理的土壤群落結(jié)構(gòu)相似性更強(qiáng)，而高濃度(800～1 000 mg·kg-1)Zn處理對土壤群落結(jié)構(gòu)的影響更強(qiáng)。多種細(xì)菌群落包括Nocardioides、Adhaeribacter和Arthrobacter等與Zn脅迫具有負(fù)相關(guān)性；而Flavisolibacter、Sphingomonas及Solirubrobacter與Zn脅迫具有正相關(guān)性。Zn處理30 d時，Zn主要減少Nocardioides、Adhaeribacter、Arthrobacter、Lysobacter和Anaeromyxobacter菌群的相對豐度；60 d時減少Gemmatimonas、Gp4、Gp6和Gp7菌群的相對豐度。

圖5 土壤樣品、細(xì)菌群落、ARGs及MGEs與外源Zn的RDA分析Fig.5 RDA of soil samples, the microbial community, ARGs, MGEs and added Zn

RDA分析還表明，Zn脅迫對acc、aac(6′)-II及aacC1具有明顯的影響，特別是在處理60 d時。Zn處理與int11、IS613及tnpA具有正相關(guān)性，且與處理時長有關(guān)。此外，acc、aac(6′)-II及aacC1與int11、IS613具有較強(qiáng)的相關(guān)性，也就是說在Zn的脅迫壓力下，這些ARGs水平轉(zhuǎn)移的風(fēng)險可能增加了。

2.5.2Zn脅迫壓力下細(xì)菌群落、抗生素抗性基因及可移動遺傳元件網(wǎng)絡(luò)分析

為了分析ARGs水平轉(zhuǎn)移的潛在風(fēng)險，揭示Zn脅迫影響土壤ARGs與潛在宿主菌、MGEs變化的內(nèi)在聯(lián)系，對其進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析(圖6)。在Zn脅迫的壓力下，Adhaeribacter、Arthrobacter和Gemmatimonas與其他細(xì)菌連接數(shù)較多，說明活躍度較高，是響應(yīng)Zn脅迫的敏感菌群。acc、aac(6′)-II與intI1、IS613這些MGEs具有較多的連接度，這說明在Zn脅迫的影響下，整合子intI1攜帶多個抗性基因水平轉(zhuǎn)移的可能性提高了。網(wǎng)絡(luò)分析還揭示Steroidobacter與Tp614存在連接，可能是Tp614的潛在宿主菌。

每個節(jié)點的大小與連接數(shù)成正比。

3 討論

與抗生素相比，重金屬的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在土壤中難以被降解。Zn作為細(xì)菌生長所必需的微量元素，可以被細(xì)菌吸收利用，但累積超過一定閾值，也可以產(chǎn)生脅迫壓力，威脅細(xì)菌的生存[6]。土壤重金屬和抗生素的協(xié)同選擇增加了ARGs傳播擴(kuò)散風(fēng)險，降低了遏制ARGs傳播政策的有效性[11,14]。農(nóng)業(yè)土壤中經(jīng)常檢出氨基糖苷類、四環(huán)素類和氯霉素類ARGs[15]，這些ARGs持久性傳播并通過發(fā)移動遺傳元件轉(zhuǎn)移到臨床病原菌中，導(dǎo)致抗生素治療失效。LI等[16]的研究表明，Cu處理不僅增強(qiáng)了抗生素抗性，而且促進(jìn)了抗性從堆肥肥料轉(zhuǎn)移到農(nóng)田土壤。HU等[4]通過高通量qPCR發(fā)現(xiàn)，Cu污染4～5 a的土壤含有多耐藥性抗性基因和內(nèi)酰胺類ARGs；Cu污染程度顯著影響ARGs的多樣性和相對豐度, 在中度污染(100～200 mg·kg-1)的紅土和重度污染(400～800 mg·kg-1)的潮土中最高。對上海多個禽畜養(yǎng)殖場周邊土壤的研究發(fā)現(xiàn)，土壤Zn含量與磺胺類ARGs的豐度具有顯著的正相關(guān)性[17]。該研究實驗用的土壤來源于桑蠶研究所苗圃基地，重金屬Zn的濃度為91.48 mg·kg-1，較高的Zn濃度可能來源于多年施用糞肥導(dǎo)致，但低于GB 15618—2018《農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控標(biāo)準(zhǔn)》中Zn濃度(250 mg·kg-1)。土壤中不同的氨基糖苷類ARGs對Zn脅迫響應(yīng)不同，Zn脅迫對acc的影響存在一個閾值濃度，處理30 d時約為891.48 mg·kg-1；隨著時間的延長，60 d時即使低濃度(100 mg·kg-1)Zn處理，其相對豐度也能達(dá)到對照的2.6倍。aacC1對Zn脅迫的響應(yīng)比較特別，30 d時不同濃度處理都有不同程度的下降，而60 d時又大幅度升高，最多時提高到對照的13.7倍。ZHU等[8]研究中國禽畜養(yǎng)殖場周邊土壤時發(fā)現(xiàn)，氨基糖苷類抗性基因與重金屬Zn、Cu具有很強(qiáng)的相關(guān)性。JI等[17]發(fā)現(xiàn)，施入豬糞的土壤中sul3、sulA與Cu、Zn、Hg之間存在顯著相關(guān)性。

可移動遺傳元件在土壤中廣泛存在，包括質(zhì)粒、插入序列、轉(zhuǎn)座子及整合子等。ARGs通常借助MGEs進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移，在土壤細(xì)菌進(jìn)化和適應(yīng)特定環(huán)境壓力的過程中扮演重要角色[11,18]。作為整合子Ⅰ類家族的一員，intl1被認(rèn)為是一種環(huán)境污染的敏感生物標(biāo)記，來指示抗性基因的傳播風(fēng)險[19-20]。BINH等[21]研究表明，隨著豬糞中重金屬含量的增加，氨基糖苷類抗性基因aadA與Intl1結(jié)合并提高其遷移率。ROSEWARNE等[14]的研究表明，intl1的相對豐度與淡水沉積物中Zn的含量呈顯著正相關(guān)。Zn處理的濃度和時長對intl1的影響不同，隨著處理時間的延長，intl1的相對豐度有增加的趨勢，最多為對照的3.7倍。然而，intI1基因不能在細(xì)菌間調(diào)動和轉(zhuǎn)移，它們通常與其他MGEs結(jié)合，如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和插入序列[22]。網(wǎng)絡(luò)共存分析顯示intI1和aac、IS613連接，說明其可能結(jié)合在一起形成復(fù)合轉(zhuǎn)座子，進(jìn)而提高aac的可移動性。RDA和網(wǎng)絡(luò)分析還表明，aacC1與轉(zhuǎn)座子IS613、Tp614顯著相關(guān)，且與Adhaeribacter具有顯著的相關(guān)性，說明這些菌群可能攜帶這個抗性基因，傳播風(fēng)險較高。在土壤中檢測到的最豐富的轉(zhuǎn)座酶基因就屬于IS6家族，IS613、Tp614是IS6家族的2種常見的轉(zhuǎn)座子，通常與多種ARGs相關(guān)，如氯霉素、氨基糖苷和β-內(nèi)酰胺抗性基因，能協(xié)助ARGs發(fā)生水平轉(zhuǎn)移擴(kuò)散[23]。

先前的宏基因組學(xué)和qPCR分析發(fā)現(xiàn)，ARGs豐度及多樣性與微生物結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)，表明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是ARGs的重要決定因素[24-25]。變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、酸桿菌門是土壤中最常見的細(xì)菌，其中放線菌和變形菌還具有產(chǎn)生多種抗生素的遺傳潛力，含有多種ARGs[26]和具有較強(qiáng)的重金屬耐受性[4,27]。這與筆者的研究結(jié)果一致。研究還發(fā)現(xiàn)，在Zn脅迫下細(xì)菌多樣性下降，抗性種屬的相互關(guān)系比較復(fù)雜，這可能大大提高ARGs的遷移率，增加這些基因向其他細(xì)菌傳播的風(fēng)險。但隨著Zn處理濃度的增加，多樣性逐漸降低，到800 mg·kg-1Zn處理時OUT數(shù)和Chao1指數(shù)多樣性達(dá)最低點，而1 000 mg·kg-1Zn處理時多樣性增加了。一種解釋是Zn可能對特定的敏感細(xì)菌有毒，導(dǎo)致細(xì)菌結(jié)構(gòu)和多樣性發(fā)生改變，隨著抗性菌群適應(yīng)了高濃度Zn脅迫的環(huán)境，種類和數(shù)量都有所提高。RDA分析表明，Zn脅迫提高了抗性菌群Flavisolibacter、Sphingomonas及Solirubrobacter的豐度，這些結(jié)果說明Zn脅迫下幸存的抗性菌群攜帶的抗性基因增加，這可能提高其抗生素抗性。

4 結(jié)論

基于室內(nèi)培養(yǎng)實驗，結(jié)合高通量測序和qPCR技術(shù)，評估了Zn作為單一因素驅(qū)動氨基糖苷類ARGs和細(xì)菌群落的動態(tài)變化，表明30～60 d的Zn處理土壤會顯著影響氨基糖苷類ARGs及遷移潛力。盡管抗生素可能是驅(qū)動ARGs傳播擴(kuò)散的主要因素，但Zn誘導(dǎo)的氨基糖苷類ARGs相對豐度和多樣性的變化可能也是一個重要的途徑。低濃度Zn離子長時間脅迫也能提高部分ARGs的相對豐度，而且重金屬還可以在土壤中累積，達(dá)到最小選擇閾值并觸發(fā)更多ARGs的增殖和擴(kuò)散。重金屬Zn充當(dāng)直接的選擇性壓力，迫使土壤中抗生素抗性的擴(kuò)散和傳播，未來控制土壤ARGs的水平基因轉(zhuǎn)移風(fēng)險應(yīng)充分考慮重金屬污染的共選擇作用。