基于網(wǎng)絡藥理學的養(yǎng)精種玉湯改善種植窗期子宮內(nèi)膜容受性機制分析

段培培， 葉振沖， 范 文， 李天強， 于聰聰， 相如蘭

(南陽理工學院 河南 南陽 473004)

0 引言

種植窗期，良好的子宮內(nèi)膜狀態(tài)是胚胎能否順利植入母體的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。處于激活狀態(tài)的囊胚，通過黏附、侵襲、植入子宮蛻膜，開啟母胎循環(huán)。同時要求母體子宮內(nèi)膜同步建立良好的接受態(tài)，此狀態(tài)持續(xù)1～2天，是胚胎著床和早孕絨毛侵襲母體的黃金時期。當前影響子宮內(nèi)膜容受狀態(tài)的因素主要涉及解剖器官異常、排卵障礙型疾病、手術(shù)器械所致的內(nèi)膜損傷、宮腔粘連、宮腔內(nèi)器質(zhì)性病變等諸多方面，發(fā)病機制多樣且復雜，治療難度大，以手術(shù)、藥物對癥治療為主，療效因人而異。因此，明確發(fā)病機制且尋求有效的中西醫(yī)結(jié)合方法是治療本病的關(guān)鍵。中醫(yī)學安胎由來已久，基于“腎系胎、血載胎”的生殖理論，認為精虧血少是胚胎著床失敗的常見病機，當補腎填精、養(yǎng)血載胎。傅氏“調(diào)經(jīng)種子”經(jīng)世名方養(yǎng)精種玉湯，由熟地黃、白芍、當歸、山茱萸組成，特于補血，純于填精，主治腎虧血虛，久不受孕。但中藥復方成分復雜，作用靶點尚未闡明。因此，本研究擬運用網(wǎng)絡藥理學方法，由藥物活性成分、潛在靶點為切入點，探究養(yǎng)精種玉湯改善子宮內(nèi)膜容受性的多重分子機制。

1 材料與方法

1.1 有效成分及其靶點基因的檢索

以 “熟地黃、山茱萸、當歸、白芍”為關(guān)鍵詞，導入TCMSP數(shù)據(jù)庫，設置OB≥30% ，DL≥0.18，進行養(yǎng)精種玉湯有效活性成分的篩選，并檢索出相關(guān)靶點；隨后將靶點導入Uniport數(shù)據(jù)庫，搜索物種為“Homo sapiens”，進行基因名稱校正。

1.2 疾病靶點的篩選

以 “Endometrial receptivity during implantation window”為關(guān)鍵詞，導入 Genecards數(shù)據(jù)庫、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫，檢索相關(guān)的靶點基因并保存。

1.3 “養(yǎng)精種玉湯-種植窗期子宮內(nèi)膜容受性”的蛋白間相互作用可視圖的構(gòu)析

Venny R軟件比對分析藥物和疾病靶點，繪制韋恩圖“藥物-疾病”交互靶點。Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建一體“藥物-疾病”蛋白網(wǎng)絡互作圖，進行可視化分析。

1.4 “化合物-有效成分-作用靶點-疾病靶點”的可視化分析

將以上的“有效成分及其靶點基因、疾病靶點基因、藥物-疾病的交集蛋白靶點” 導入Cytoscape，進行可視化網(wǎng)絡分析。

1.5 基于David進行GO及KEGG富集分析

將1.3節(jié)中交互靶點導入David數(shù)據(jù)庫進行基因本體(GO)富集分析，分別描述靶點的生物學過程(GO-BP)、細胞組分(GO-CC)、分子功能(GO-MF)；同時進行基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，獲得相關(guān)生物學過程和各條關(guān)鍵的信號通路。

2 結(jié)果

2.1 養(yǎng)精種玉湯有效活性成分的篩選

通過 TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索出養(yǎng)精種玉湯所含化合物：熟地黃76 種、當歸 125 種、山茱萸 226種、白芍85種；在OB≥ 30% 、DL ≥ 0.18 的條件下，獲得37種有效化學成分，其中熟地黃 2 種(谷甾醇、豆甾醇)、當歸 1種(β-谷甾醇)、山茱萸 20種(山茱萸環(huán)烯醚萜及苷、多糖類等)、白芍13種(芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等)，將重復性的藥效成分刪除不計入，共計31種藥效成分被查找到(部分主要成分見表1)。

表1 養(yǎng)精種玉湯的31種有效活性成分

2.2 疾病靶點的篩選

設置關(guān)鍵詞為“Endometrial receptivity during implantation window”，檢索結(jié)果數(shù)量分別為378、377。去除搜集到的重復靶點后，導入Uniport 數(shù)據(jù)庫，對靶點基因進行簡稱化。相關(guān)性分數(shù)提示靶點與子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)聯(lián)緊密度，二者呈正相關(guān)。依據(jù)相關(guān)性分數(shù)排序，排名前10位的靶點信息見表2。

表2 種植窗期子宮內(nèi)膜容受性的部分靶點及靶點描述

2.3 “藥物-疾病”交集作用靶點的預測分析

將2.1節(jié)中31種有效成分所對應的114個作用靶點和4209個子基因，與2.2節(jié)中的378個疾病靶點，導入Venny R 分析軟件，繪制交集靶點韋恩圖(見圖1)，圖中獲取249個“藥物-疾病”交集靶點基因，其中黏附分子(CD44)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、整合素α5(ITGα5)、氧化氮合酶(NOS2)、間質(zhì)-上皮細胞轉(zhuǎn)化因子(MET)等參與細胞生長、黏附、侵襲過程。內(nèi)皮素1(EDN1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等參與血管平滑肌收縮、血管生成，調(diào)控組織血流灌注。CXC族趨化因子受體(CXCR4)、瘦素(LEP)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FOXP3)等激活細胞免疫、炎癥活動，調(diào)節(jié)免疫-炎癥微環(huán)境。分析計算得出靶點基因映射率為5.9%，提示該方對于改善子宮內(nèi)膜容受狀態(tài)特異性顯著。

圖1 養(yǎng)精種玉湯與種植窗期子宮內(nèi)膜容受性的 249 個交集靶點韋恩圖

2.4 養(yǎng)精種玉湯與種植窗期子宮內(nèi)膜容受性交集靶點的 PPI 網(wǎng)絡分析

將2.3節(jié)中所獲得的249個交集靶點導入String數(shù)據(jù)庫，設置搜索物種為 “人”，medium confidence篩選值設為大于0.900(有統(tǒng)計學意義)，得到“藥物成分-疾病關(guān)聯(lián)蛋白”的互作信息圖。后將獲取的蛋白互作信息以tsv形式導入 Cytoscape軟件中分析，篩選度值最大且相同的兩個節(jié)點—STAT3、APP及其有互作關(guān)聯(lián)的其他靶點。依據(jù)度值越大，該基因或通路對疾病的影響越大，篩選出排前30位的節(jié)點(見圖2)。其中KNG1(激肽原-1)在不同條件下，可激活AKT(蛋白激酶)、EGF(表皮生長因子)、EGFR(表皮生長因子受體)、FN1(纖維連接蛋白)、MAPK(絲裂原激活的蛋白激酶)、STAT3(信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3)等信號通路，參與細胞生長、增殖、侵襲等生理活動。TNF(腫瘤壞死因子)協(xié)同IL6(白介素6)、IL10(白介素10)等激活免疫-炎癥反應，調(diào)控種植窗期子宮內(nèi)膜微環(huán)境。VEGFA(血管內(nèi)皮生長因子A)協(xié)同STAT3、EGFR等調(diào)節(jié)血管生成，改善子宮內(nèi)膜血流灌注。上述靶點可能是通過不同角度改善子宮內(nèi)膜容受性促進種植窗期胚胎順利著床的關(guān)鍵靶點。

圖2 養(yǎng)精種玉湯改善種植窗期子宮內(nèi)膜容受性度值排名前30位的較大節(jié)點注：橫坐標代表靶點的度值；縱坐標為排名先后的各節(jié)點

2.5 GO 富集分析

將疾病核心靶點基因?qū)隕nrichr數(shù)據(jù)庫進行GO富集分析，得到具有統(tǒng)計學意義的88條富集結(jié)果(P<0.01)，其中排名前20的主要涉及癌癥相關(guān)通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(P13K-Akt)、缺氧誘導因子(HIF-1)、叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FoxO)、Toll樣受體4(TLR4)等信號通路。David 6.8 數(shù)據(jù)庫對交集靶點進行功能注釋分析，結(jié)果顯示BP、CC、MF數(shù)量，分別為644、55、88(P<0.01)。其中BP主要包括白介素的正向調(diào)節(jié)、各類蛋白激酶活性激活，樹突細胞-細胞因子的免疫應答，細胞增殖、凋亡、侵襲的信號轉(zhuǎn)導，性激素水平(雌、孕激素的分泌及代謝過程)等。CC主要集中于細胞免疫突觸、內(nèi)吞囊腔、細胞外囊泡、血液微粒、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子、Wnt 信號復合體等，MF主要體現(xiàn)在蛋白質(zhì)粒子結(jié)合、HMG結(jié)構(gòu)域結(jié)合、參與Wnt 信號通路的受體激活、支架蛋白結(jié)合、細胞間鈣黏蛋白結(jié)合、細胞基質(zhì)膠原區(qū)域結(jié)合等方面。

2.6 KEGG 信號通路富集分析

將2.3節(jié)中所獲得的249個“藥物-疾病”交集靶點基因?qū)隓avid 6.8數(shù)據(jù)庫，方法同1.5節(jié)進行KEGG富集分析，得到具有統(tǒng)計學意義的101條信號通路(P<0.01)。選擇排名前20的信號通路進行可視化分析(見圖3)。圖中氣泡的直徑與該富集通路中蘊含的基因個數(shù)呈正相關(guān)；氣泡灰度表示偽發(fā)現(xiàn)率，其深淺與該富集通路的偽發(fā)現(xiàn)率呈負相關(guān)。

圖3 養(yǎng)精種玉湯改善種植窗期子宮內(nèi)膜容受性的KEGG信號通路氣泡圖注：氣泡的直徑大小表示通路中的靶點基因數(shù)量；顏色深淺代表偽發(fā)現(xiàn)率(FDR值)

3 討論

妊娠早期，胚胎能否順利植入母體子宮歷經(jīng)著一系列有序且復雜的生理學過程，其要求激活狀態(tài)的胚胎與母體內(nèi)膜的容受狀態(tài)保持同步。因此，種植窗期子宮內(nèi)膜接受態(tài)的建立和良好母胎界面微環(huán)境的形成是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)，亦是胎兒得以生長、發(fā)育的組織學基礎。當前臨床醫(yī)學診療子宮內(nèi)膜源性疾病的方法以彩超、宮腔鏡等檢測其形態(tài)學變化、血流灌注等，蛋白組學、代謝組學和單細胞測序分析其分子機制靶點[1-3]，但其成本昂貴、個體差異顯著，治療仍以手術(shù)、藥物對癥治療為主。而中醫(yī)安胎歷經(jīng)千年，流傳至今，有著自身獨特優(yōu)勢和治療理念。傅山(清)[4]提出：“精滿則子宮易于攝精，血足則子宮易于容物，皆有子之道也”，認為胎元初結(jié)于母體胞宮，需精滿氣盛，血脈暢達，此得以載胎至足月。本方由補血調(diào)經(jīng)第一名方——四物湯加減化裁而成，方中去川芎而特加山萸肉以滋補肝腎，補益精血，使養(yǎng)精種玉湯全方藥物配合不特于補血，而純于填精。方中重用填精之要藥九蒸九制熟地黃，配伍蒸熟山茱萸，其妙在于補中帶收，正應“腎主封藏”之象；當歸補益精血，補而不膩；白芍養(yǎng)血柔肝，養(yǎng)中有行，行中有斂。全方配伍嚴謹，詮釋了“精滿血足，方可種子”的經(jīng)典生殖理論。

當前中醫(yī)藥的傳承發(fā)展以臨床積累、師承研究為主，中藥復方雖療效顯著，但因其成分復雜、靶點繁多，具體的作用機制尚未明了。而網(wǎng)絡藥理學作為高效的生物信息學分析方法，為進一步研究中藥成分的分子機制提供方向。臨床中子宮內(nèi)膜容受性低下主要涉及子宮因素的內(nèi)膜過薄、內(nèi)膜息肉、子宮內(nèi)膜炎性改變、宮腔粘連和卵巢分泌功能紊亂[5]等方面，發(fā)病機制與卵巢性激素分泌、種植窗期母胎界面母體子宮內(nèi)膜局部分子[6]及胎源性分泌的因子異常有關(guān)。研究結(jié)果顯示，養(yǎng)精種玉湯所含口服利用率較高的β-谷甾醇、豆甾醇、芍藥苷、山茱萸多糖、山茱萸環(huán)烯醚萜及苷、芍藥內(nèi)酯苷等可能是改善種植窗期子宮內(nèi)膜容受性的主要生物活性成分。后通過成分-疾病靶點網(wǎng)絡分析可知，STAT3、APP、IL6、KNG1、MAPK3、MAPK1、VEGFA、FN1、AKT1、EGF等核心靶點在改善種植窗期子宮內(nèi)膜容受性時發(fā)揮主要作用，主要體現(xiàn)在調(diào)控子宮內(nèi)膜適度增殖、凋亡，促進內(nèi)膜生長、血管生成及改善母胎界面免疫-炎癥微環(huán)境方面。雖該方治療婦科領域疾病的機制研究甚少，但已有學者證實方中有效活性成分通過調(diào)控上述靶點，廣泛應用于其他疾病的臨床治療中。石和元[7]等證實山茱萸多糖可以通過調(diào)節(jié)IL-2、IL-10的蛋白表達，CD4+、CD8+T細胞水平，平衡Th1/Th2比值，提高小鼠的免疫功能。周強[8]等證實β-谷甾醇可以通過下調(diào)TNF-α、FN、Cas-3水平，上調(diào)IL-1β、IL-4表達，抑制肺組織凋亡，改善局部免疫-炎癥微環(huán)境，延緩急性肺損傷所致的纖維化進程。王貞麗[9]等發(fā)現(xiàn)芍藥苷可通過改善血管內(nèi)皮舒縮因子、減輕氧化應激損傷，糾正低氧性肺動脈高壓的血管重塑。徐大偉[10]等在體外細胞實驗中證實芍藥苷可通過負反饋STAT3信號通路，激活垂體瘤細胞凋亡因子，抑制其生長。

本研究中GO及KEGG富集分析提示：該方主要通過調(diào)控種植窗期母胎界面細胞增殖和炎癥、免疫反應等生物學過程，并在以細胞免疫突觸、內(nèi)吞囊腔、細胞外囊泡及細胞表面為主的細胞組分處發(fā)揮良性作用；影響蛋白質(zhì)粒子結(jié)合、性激素水平、支架蛋白結(jié)合域、細胞間鈣黏蛋白結(jié)合、細胞基質(zhì)膠原結(jié)合域及生長因子活性等分子功能；同時以癌癥、PI3K-AKT、FoxO、VEGF等信號通路為主參與改善種植窗期子宮內(nèi)膜容受性以促進胚胎著床的過程，且不同信號通路間存在交叉激活。其中FoxO家族中FOXA2是影響內(nèi)膜容受性的啟動因子，受雌激素的負反饋調(diào)控，同時可被Wnt通路、黃體酮激活?；罨腇OXA2可通過激活細胞間鈣黏蛋白(E-CDH1)，上調(diào)白血病抑制因子(LIF)，最終激活JAK/STAT3信號通路[11]，促進種植窗期子宮內(nèi)膜蛻膜化，調(diào)節(jié)免疫-炎癥應答，促進胚胎順利著床。此外，當下因手術(shù)器械所致的子宮內(nèi)膜損傷是影響其容受性的常見因素，薄型子宮內(nèi)膜、血供不足是其主要表現(xiàn)。李新安[12]等發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜膠原結(jié)合域(CBD)，CBD-VEGF可特異性與膠原結(jié)合，促進內(nèi)膜螺旋小動脈的生成，改善局部血流灌注，修復受損的子宮內(nèi)膜及平滑肌。張良[13]等證實養(yǎng)精種玉湯可通過上調(diào)反復試管著床失敗患者子宮內(nèi)膜分泌物中VEGF、IL-1β的表達，下調(diào)單核細胞趨化蛋白-1的表達，改善種植窗期子宮內(nèi)膜形態(tài)和血流灌注，優(yōu)化子宮內(nèi)膜容受狀態(tài)，提高妊娠率。

綜上，養(yǎng)精種玉湯可能通過改善內(nèi)膜生長、分泌狀態(tài)和局部血流灌注、平衡母胎界面免疫-炎癥微環(huán)境，修復內(nèi)膜損傷等多途徑促進胚胎著床。其多成分、多靶點、多通路的作用特點，為深入研究其助孕機制提供方向，為婦科其他炎性疾病、腫瘤疾病的治療提供診療思路和潛在空間。但由于中藥復方成分、靶點復雜，后期仍需要大量的動物實驗及臨床研究的證實。