白洋淀春季沉積物好氧反硝化菌群落結(jié)構(gòu)特征及對溶解性有機物的響應(yīng)*

陳召瑩，張?zhí)鹉?，張紫薇，周石磊，董宛佳，崔建升，羅 曉

(河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，河北省污染防治生物技術(shù)實驗室，石家莊 050018)

湖泊作為重要的淡水水體，其水體水質(zhì)優(yōu)劣和生態(tài)健康與否直接關(guān)系著該地區(qū)居民的生活和經(jīng)濟發(fā)展[1]. 白洋淀作為華北地區(qū)最大的淡水湖泊，為周邊的經(jīng)濟發(fā)展提供了重要的生態(tài)保障，然而由于白洋淀水體環(huán)境受到旅游、歷史養(yǎng)殖等多方面的綜合影響，大量的氮素進入水體，造成了嚴重的水體富營養(yǎng)化[2]. 傳統(tǒng)的生物脫氮在天然水體中進行原位氮素削減效果較差，好氧反硝化菌的發(fā)現(xiàn)為原位削減好氧環(huán)境下的天然水體氮素提供了新思路. 特別是在春季，白洋淀冰封解凍，水體溫度、溶解氧等環(huán)境變化劇烈，引起微生物種群結(jié)構(gòu)也發(fā)生相應(yīng)變化. 因此，研究春季白洋淀好氧反硝化菌群落對控制其水體富營養(yǎng)化程度、削減氮素具有重要意義.

目前關(guān)于好氧反硝化菌的研究大多是基于實驗室的菌種分離鑒定和脫氮特性分析[3]，牟東陽等從活性污泥中分離出一株假單胞菌并研究了其可同時進行硝化反硝化的特征，表明其在處理含氮廢水方面有一定的潛力[4]，周石磊等采用改良的富集馴化方法來分離貧營養(yǎng)好氧反硝化菌并進行脫氮實驗，結(jié)果顯示篩選的好氧反硝化菌具有良好的短程反硝化、硝化和源水脫氮能力[5]. 由于用于富集馴化好氧反硝化菌的碳源與實際環(huán)境差異太大，篩選出來的高效菌在現(xiàn)實環(huán)境中并不高效，以至于發(fā)揮不出應(yīng)有的脫氮優(yōu)勢，因此很少有好氧反硝化菌實際應(yīng)用于修復(fù)天然水體. 碳源在反硝化過程中作為電子供體，為好氧反硝化菌的增殖提供能量[6]. 目前，許多學(xué)者以乙酸鈉、丁二酸鈉、葡萄糖等作為碳源對好氧反硝化菌的脫氮特性進行研究[7-8]，僅有文剛等[9]和周石磊等[10]研究了湖庫中天然有機物對好氧反硝化菌的影響. 沉積物是微生物重要的棲息場所[11]，并且表層沉積物大多時期處于缺氧-好氧環(huán)境，研究表明缺氧-好氧的交替環(huán)境有利于好氧反硝化菌的富集[12]. 與此同時，表層沉積物中大量的有機質(zhì)可以作為異養(yǎng)微生物的碳源，因此，基于天然環(huán)境開展好氧反硝化菌群與溶解性有機物的相關(guān)關(guān)系研究十分必要，不僅有助于進一步認識天然環(huán)境中的氮循環(huán)微生物的特征，可以為將來適于實際環(huán)境的高效菌篩選的碳源選擇提供參考.

本研究基于課題組前期研究[13]與白洋淀整體淀區(qū)的歷史承載功能[14]將白洋淀劃分為原始區(qū)、入淀區(qū)、旅游區(qū)、生活區(qū)和養(yǎng)殖區(qū)五大功能區(qū)，對5個功能區(qū)的25個點位進行采樣，利用三維熒光-熒光區(qū)域積分法分析沉積物的溶解性有機物的組成，并利用高通量測序分析白洋淀春季好氧反硝化菌群落結(jié)構(gòu)，進而研究好氧反硝化菌群落對溶解性有機物的響應(yīng)，以期為天然水體高效好氧反硝化菌篩選的碳源選擇提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

白洋淀(38°44′～38°59′N, 115°45′～116°07′E)位于河北省雄安新區(qū)，總面積336萬m2，蓄水量1.024億m3，是華北地區(qū)最大的淡水湖泊和最大的濕地生態(tài)系統(tǒng)，為周邊的經(jīng)濟發(fā)展提供了重要的生態(tài)保障. 與此同時，白洋淀的水體環(huán)境受到上游外源輸入和淀區(qū)生活、歷史養(yǎng)殖以及旅游的綜合影響，有水質(zhì)惡化的風(fēng)險.

1.2 樣品采集與處理

本研究將白洋淀分為原始區(qū)(AN)、入淀區(qū)(EA)、旅游區(qū)(TA)、生活區(qū)(LA)、養(yǎng)殖區(qū)(BA)五大功能區(qū)，原始區(qū)人煙稀少，人類干預(yù)較少，入淀區(qū)是白洋淀與6條河流相連接的區(qū)域，旅游區(qū)內(nèi)設(shè)置旅游景點，夏季接納大量游客，生活區(qū)內(nèi)居住大量居民，村莊依水而建，養(yǎng)殖區(qū)歷史水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達[13]，選取藻苲淀1#(S1)、藻苲淀2#(S2)、藻苲淀3#(S3)代表原始區(qū)，燒車淀(S4)、鴛鴦島(S5)、文化苑西門(S6)代表旅游區(qū)，棗林莊(S7)、平陽淀(S8)、小麥淀(S9)、北田莊西淀(S10)、澇王淀(S11)、采蒲臺(S12)、范峪淀(S13)代表生活區(qū)，前塘(S14)、后塘(S15)、端村1#(S16)、端村2#(S17)、泛魚淀(S18)、鰣鮜淀(S19)代表養(yǎng)殖區(qū)，白溝引河(S20)、瀑河藻苲淀入淀口(S21)、萍河藻苲淀入淀口(S22)、唐河端村入淀口(S23)、南劉莊府河入淀口(S24)、潴籠河入淀口(S25)代表入淀區(qū)，每個區(qū)域的采樣點位置見圖1. 于2019年春季(4月)采用抓泥斗采集白洋淀各個采樣點的0～2 cm表層沉積物[2].

圖1 白洋淀沉積物采樣點分布Fig.1 Distribution of sediment sampling sites in Lake Baiyangdian

1.3 沉積物有機質(zhì)分析

本研究采用熒光區(qū)域積分法對沉積物中的有機質(zhì)進行解析. 沉積物采用超純水與沉積物重量比20∶1提取浸提液進行分析. 熒光光譜采用日立F700熒光分析儀進行分析，激發(fā)波長(Ex)掃描范圍為200～450 nm，發(fā)射波長(Em)掃描范圍為250～600 nm，掃描速率為2400 nm/min，激發(fā)波長和發(fā)射波長的增量分別為5和1 nm，將三維熒光光譜按激發(fā)/發(fā)射波長劃分為5個區(qū)域，P1的Ex/Em為(200～250)/(250～330)nm；P2的Ex/Em為(200～250)/(330～350)nm；P3的Ex/Em為(200～250)/(350～500)nm；P4的Ex/Em為(250～280)/(250～380)nm；P5的Ex/Em為(280～400)/(380～500)nm. 采用Matlab 2016b進行前處理后將區(qū)域劃塊，并在Matlab2016b中進行區(qū)域積分計算，算出特定的熒光區(qū)域積分體積(Φ)，Φi表示具有相似性質(zhì)有機物的累積熒光強度；對Φi進行標(biāo)準化分析，得到某一熒光區(qū)域積分標(biāo)準體積(Φi,n)；最后計算出某一熒光區(qū)域特定結(jié)構(gòu)有機物的積分占總積分的比例(Pi,n)[15].

1.4 沉積物好氧反硝化細菌群落結(jié)構(gòu)測定

1.4.1 樣品總DNA提取與PCR擴增 分別取各個采樣點的沉積物寄送到上海派森諾生物公司進行DNA提取；采用引物F: TGGACVATGGGYTTYAAYC,R:ACYTCRCGHGCVGTRCCRCA[16]對沉積物的napA基因進行PCR擴增, 進而分析好氧反硝化菌微生物群落分布特征. PCR反應(yīng)條件由測序公司進行優(yōu)化調(diào)整. PCR反應(yīng)條件如下: 95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)；72℃保溫10 min，于4℃保存. 反應(yīng)結(jié)束后配制2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物. 擴增產(chǎn)物采用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)進行分析，首先使用cutadapt切除序列的引物片段，設(shè)置-O為10，棄去未匹配引物的序列；使用Vsearch的fastq_mergepairs模塊拼接序列；使用fastq_filter模塊對拼接序列進行質(zhì)控；使用 derep_fulllength模塊去除重復(fù)序列；使用cluster_size模塊，在98%相似度水平對去重后的序列聚類，并使用uchime_denovo模塊去除嵌合體；再使用perl腳本，過濾質(zhì)控后序列集中的嵌合體，從而獲得高質(zhì)量序列；使用cluster_size模塊，在97%相似度水平對高質(zhì)量序列聚類，并分別輸出代表序列和OTU表. 最后，去除OTU表格中的singletons OTUs (即，在所有樣本中豐度為1的OTU，默認操作)及其代表序列.

1.4.2 生物信息處理α多樣性分析中，采用Chao1指數(shù)表征豐富度[17]，采用Shannon-Wiener和Simpson指數(shù)表征多樣性，采用Good’s coverage指數(shù)表征覆蓋度[18].β多樣性分析中，采用R語言基于Bray-Curtis距離矩陣進行PCoA(Principal co-ordinates analysis)分析，來研究樣本群落組成的相似性和差異性[19]. 采用隨機森林分析來篩選不同功能區(qū)的好氧反硝化群落的指示物種[20]，采用冗余分析(RDA)和Spearman相關(guān)指數(shù)方法來研究不同功能區(qū)好氧反硝化群落與碳源有機質(zhì)的關(guān)系[21]. 利用R中的Vegan包對好氧反硝化菌豐度指標(biāo)做降趨勢對應(yīng)分析(detrended correspondence analysis, DCA)，分析結(jié)果顯示梯度長度(gradients length)的第一軸小于3.0[22]，因此選用RDA研究溶解性有機物對好氧反硝化菌群落的影響. 利用R對物種因子進行hellinger轉(zhuǎn)化處理，對環(huán)境因子進行對數(shù)處理，通過VIF檢驗篩選高膨脹環(huán)境因子并舍去. 利用ANOVA分析來比較不同分組之間好氧反硝化菌群落豐富度和多樣性差異在統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著性. 利用Adonis分析比較不同分組之間好氧反硝化菌群落組成差異在統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著性[23].

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

本文中繪圖和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS、R和Origin軟件完成.P<0.05表示存在顯著差異，0.001

2 結(jié)果與討論

2.1 沉積物有機質(zhì)分析

三維熒光區(qū)域的分區(qū)如圖2a所示，三維熒光區(qū)域的積分標(biāo)準體積可間接表征不同熒光組分的相對濃度. 圖為不同采樣點各熒光區(qū)域所占的比例，白洋淀沉積物類酪氨酸物質(zhì)占比范圍為6.18%～17.42%，其中旅游區(qū)最高，原始區(qū)最低. DOM中類色氨酸物質(zhì)占比范圍為15.11%～49.84%，其中入淀區(qū)的采樣點中類色氨酸物質(zhì)所占比例分布范圍最大，類色氨酸物質(zhì)在白洋淀DOM中比例最大. DOM中的類富里酸物質(zhì)占比范圍為4.69%～21.80%，原始區(qū)比例最大，養(yǎng)殖區(qū)最小. DOM中微生物代謝產(chǎn)物占比范圍為17.00%～46.44%，其分布規(guī)律與類富里酸物質(zhì)正好相反，養(yǎng)殖區(qū)所占比例最大，原始區(qū)最小. DOM中類腐殖質(zhì)物質(zhì)占比范圍為5.26%～29.13%，其分布規(guī)律與類富里酸物質(zhì)類似，原始區(qū)最大，養(yǎng)殖區(qū)最小. 白洋淀不同功能區(qū)采樣點中DOM不同組分平均所占比例表現(xiàn)為：類色氨酸物質(zhì)>微生物代謝產(chǎn)物>類腐殖酸物質(zhì)>類富里酸物質(zhì)>類酪氨酸物質(zhì)，類色氨酸物質(zhì)主要來源于生物活動，并且微生物代謝產(chǎn)物所占比例也較大，表明春季白洋淀沉積物中微生物的活動較為豐富[24].

圖2 不同功能區(qū)各熒光組分(a)和類蛋白質(zhì)和類腐殖質(zhì)組分(b)所占比例Fig.2 The proportion of fluorescence components (a) and protein-like components and humic-like components (b) in different functional areas

在此基礎(chǔ)上，將熒光組分類酪氨酸物質(zhì)、類色氨酸物質(zhì)和微生物代謝產(chǎn)物歸為類蛋白質(zhì)物質(zhì)，類富里酸物質(zhì)和類腐殖酸物質(zhì)歸為類腐殖質(zhì)物質(zhì)(圖2b). 類腐殖質(zhì)一般是由地表徑流攜帶的部分腐殖質(zhì)以及浮游動植物釋放的有機物經(jīng)過細菌降解后產(chǎn)生，而類蛋白質(zhì)主要由水生生物或微生物的新陳代謝作用產(chǎn)生[25]. 各個功能區(qū)的類蛋白質(zhì)組分均顯著高于類腐殖質(zhì)組分，表明類蛋白質(zhì)組分是白洋淀沉積物中溶解性有機質(zhì)的主要成分，其中養(yǎng)殖區(qū)的類蛋白質(zhì)組分所占比例最大為79.63%±3.79%，這可能是因為養(yǎng)殖區(qū)過去餌料沉積所產(chǎn)生的，其次是生活區(qū)，所占比例為75.82%±4.91%，可能是生活污水中含有大量類色氨酸類物質(zhì)多環(huán)芳烴，增加了生活區(qū)類蛋白質(zhì)物質(zhì)的含量[26]，原始區(qū)所占比例最小，為66.09%±6.32%. 類腐殖質(zhì)組分的含量與之相反，原始區(qū)中類腐殖質(zhì)的比例最大，為33.91%±6.32%，水生植物的腐爛分解會導(dǎo)致原始區(qū)類腐殖質(zhì)含量的增多，其次是入淀區(qū)，所占比例為27.23%±9.83%.

圖3 白洋淀沉積物好氧反硝化菌不同功能區(qū)的Chao1指數(shù)(a)、Good’s coverage指數(shù)(b)、 Shannon-Wiener指數(shù)(c)和Simpson指數(shù)(d)Fig.3 Chao1 index (a), Good’s coverage index (b), Shannon-Wiener index (c) and Simpson index (d) in different functional areas of aerobic denitrifying bacteria in the sediments in Lake Baiyangdian

2.2 好氧反硝化細菌群落α多樣性分析

通過Chao1指數(shù)反映了不同功能區(qū)微生物群落的豐富度，其中，旅游區(qū)沉積物中好氧反硝化菌群落Chao1指數(shù)最大，為1216.44±109.43，生活區(qū)、入淀區(qū)和原始區(qū)次之，分別為1094.13±276.34、1066.70±384.33和1042.54±117.81(圖3)，這與包頭南海湖旅游開發(fā)區(qū)采樣點Chao1指數(shù)高于進水口區(qū)相一致[27]，養(yǎng)殖區(qū)最小，為732.37±98.81，并且呈顯著差異(P<0.05). 通過Shannon-Wiener指數(shù)可知，旅游區(qū)的Shannon-Wiener指數(shù)(5.96±0.38)高于原始區(qū)(5.70±0.34)，這可能是春季白洋淀上覆水體變化劇烈，而白溝引河周邊分布較多居民，水體中匯集的生活垃圾等污染物隨水體流動進入旅游區(qū)，導(dǎo)致旅游區(qū)營養(yǎng)物質(zhì)含量增加，促進了旅游區(qū)好氧反硝化菌的多樣性的增加. 生活區(qū)和入淀區(qū)的Shannon-Wiener指數(shù)較小，分別為5.43±1.04和5.24±0.73，養(yǎng)殖區(qū)的Shannon-Wiener指數(shù)最小，為4.75±0.32，Simpson指數(shù)同Shannon-Wiener指數(shù)的結(jié)果相一致，表現(xiàn)為旅游區(qū)(0.95±0.004)>原始區(qū)(0.94±0.02)>生活區(qū)(0.91±0.07)>入淀區(qū)(0.91±0.05)>養(yǎng)殖區(qū)(0.89±0.04). 以上結(jié)果表征旅游區(qū)的好氧反硝化菌群多樣性最高，養(yǎng)殖區(qū)的多樣性最低. 由覆蓋度指數(shù)可知，5個功能區(qū)的菌群覆蓋度指數(shù)均大于99%，滿足測序深度的要求. 另外，利用ANOVA分析對5個功能區(qū)好氧反硝化菌群落α多樣性進行分析，結(jié)果表明各個功能區(qū)之間菌群豐富度和多樣性均不存在顯著差異(P>0.05). 綜上，白洋淀春季不同功能區(qū)沉積物好氧反硝化菌群豐富度存在顯著差異，菌群多樣性沒有表現(xiàn)出顯著差異.

2.3 好氧反硝化細菌群落組成

通過物種注釋，白洋淀春季沉積物napA型好氧反硝化菌群落共得到3653個OTUs，分為9個主要的門類，分別是變形菌門(Proteobacteria)、棲熱菌門(Deinococcus-thermus)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、索脊動物門(Chordata)和疣微桿菌門(Verrucomicrobia)，其余為未知細菌. 其中，變形菌門是所有樣品中的優(yōu)勢門，所占比例均大于99%，這與于妍等對白洋淀表層沉積物進行研究時所得出的結(jié)果相一致[28]. 變形菌門在諸多脫氮過程中占據(jù)著主導(dǎo)地位[29]. 在綱水平上，不同采樣點豐度不同，圖4為豐度前4的主要綱，包括Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Epsilonproteobacteria. Betaproteobacteria是豐度最高的綱，其中養(yǎng)殖區(qū)豐度最大，占比為33.31%，研究顯示Betaproteobacteria大多具有脫氮特性，廣泛存在于各種天然水體與沉積物中[30]；Gammaproteobacteria是第二大綱，入淀區(qū)的豐度最大，占比為32.97%，在前人的研究中發(fā)現(xiàn)Gammaproteobacteria在含鹽廢水反硝化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[31]；Alphaproteobacteria為第三大綱，旅游區(qū)的豐度最大，占比為7.81%，Alphaproteobacteria在促進氨氧化和固氮過程中起著重要的作用[32].

圖4 白洋淀春季沉積物不同分組napA型好氧反硝化細菌綱水平上的相對豐度Fig.4 The relative abundance of napA-type aerobic denitrifying bacterial community in the sediments of different groups at class level in Lake Baiyangdian

在屬水平上，圖5為豐度前10的主要屬，包括Aeromonas、Sulfuritortus、Cupriavidus、Pseudomonas、Thauera、Magnetospirllum、Azospirillum、Bradyrhizobium、Azospira和Agrobacterium.Aeromonas在白洋淀春季整體好氧反硝化菌群落中占比最大，為第一大屬，占比范圍為4.95%～28.87%，其中原始區(qū)豐度最大，占比為28.87%，入淀區(qū)次之，豐度占比為22.34%. 研究表明，Aeromonas是水庫中主要的好氧反硝化菌，在脫氮過程中能夠利用各種碳水化合物作為碳源[29].Sulfuritortus作為第二大屬，養(yǎng)殖區(qū)豐度最大，占比為11.85%，其次是旅游區(qū)，占比為8.56%.Cupriavidus作為第三大屬，占比范圍為2.11%～5.15%，在原始區(qū)豐度最大，養(yǎng)殖區(qū)次之，占比為4.66%，其次是原始區(qū)和生活區(qū)，旅游區(qū)豐度最小，研究者發(fā)現(xiàn)Cupriavidussp. S1可以利用不同形式的氮源同時進行硝化反硝化，并且對含重金屬工業(yè)廢水的脫氮效果較好[33].Pseudomonas和Thauera在旅游區(qū)中占比最大，分別為3.61%和7.93%，有研究表明Pseudomonas能夠適應(yīng)較寬的氨氮負荷，在高氨氮濃度條件下仍具有較高的異養(yǎng)硝化能力[34]，并且從太湖[35]和山東周村飲用水水庫[36]中均分離出具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化能力的假單胞菌屬，Thauera可以利用甲苯作為唯一碳源和能量來進行反硝化[37].

圖5 白洋淀春季沉積物不同分組napA型好氧反硝化細菌屬水平上的相對豐度Fig.5 The relative abundance of napA-type aerobic denitrifying bacterial community in the sediments of different groups at genus level in Lake Baiyangdian

2.4 好氧反硝化菌群群落組成差異分析

與此同時，本研究通過韋恩圖和PCoA分析來研究春季不同功能區(qū)采樣點沉積物好氧反硝化菌群的差異. 通過圖6a韋恩圖可以直觀地反映物種的差異及重疊情況，其中，入淀區(qū)獨有1033個OTUs；生活區(qū)獨有913個OTUs；養(yǎng)殖區(qū)獨有262個OTUs；旅游區(qū)獨有503個OTUs；原始區(qū)獨有440個OTUs. 5個功能區(qū)都存在的OTUs有502個. 5個功能區(qū)所含OTUs數(shù)目關(guān)系為入淀區(qū)>生活區(qū)>旅游區(qū)>原始區(qū)>養(yǎng)殖區(qū). 這與Chao1指數(shù)所得的結(jié)果基本相一致，驗證了前人OTUs的個數(shù)與細菌群落的相對豐度之間的相關(guān)性，相對豐度高的細菌有更多的OTUs[38].

圖6b為白洋淀春季不同功能區(qū)沉積物好氧反硝化群落組成情況. PCo1和PCo2分別解釋了總體變化的29.3%和20.6%，總共解釋了整體變化的49.9%. 原始區(qū)分布在第二象限，入淀區(qū)分布在第二、三象限，旅游區(qū)主要分布在第三、四象限，生活區(qū)和養(yǎng)殖區(qū)主要分布在第一、四象限且分布位置相似，其差異可能是由于不同功能區(qū)環(huán)境因素不同引起的，其中生活區(qū)和養(yǎng)殖區(qū)由于人類活動較為頻繁，存在差異較小. 通過將5個功能區(qū)采樣點的好氧反硝化菌群落進行Adonis分析，結(jié)果顯示P<0.01，表明了白洋淀春季5個功能區(qū)的好氧反硝化菌群落結(jié)構(gòu)存在極顯著差異.

圖6 白洋淀沉積物napA型好氧反硝化菌韋恩圖(a)、主成分分析(b)和隨機森林分析(c)Fig.6 Venn plot(a), Principal coordinates analysis(b) and Random Forests analysis(c) of napA-type aerobic denitrifying bacteria in the sediments in Lake Baiyangdian

2.5 好氧反硝化菌標(biāo)志物種分析

通過對春季沉積物好氧反硝化群落進行分析，得到豐度排名前20的標(biāo)志物種，分別是Ferrimonas、Achromobacter、Rhodobacter、Oceanimonas、Brandyrhizobium、Aeromonas、Bordetella、Azoarcus、Pseudomonas、Thauera等，其中，Aeromonas、Sulfuritortus、Pseudomonas、Thauera、Magnetospirllum、Bradyrhizobium和Azospira是好氧反硝化微生物群落中豐度前10的物種，由此可以推斷出指示物種和豐度較大的物種有重合(圖6c). 從圖中可以看出，F(xiàn)errimonas在不同采樣點好氧反硝化微生物群落中差異貢獻最大，其在養(yǎng)殖區(qū)的采樣點中占據(jù)較大的豐度，在原始區(qū)和入淀區(qū)的豐度均較小.Achromobacter、Azospira和Rhodobacter在入淀區(qū)的采樣點的豐度較大，在旅游區(qū)次之，其余采樣點均較小，有研究發(fā)現(xiàn)從垃圾滲濾液分離出的Achromobactersp.L16可將氮素大部分轉(zhuǎn)化為氣體和菌體胞內(nèi)氮[39].Oceanimonas在原始區(qū)采樣點的豐度與其他功能區(qū)相比較大，在前人的研究中發(fā)現(xiàn)，Oceanimonas的反硝化過程在處理高鹽廢水中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[40].Aeromonas在入淀區(qū)和原始區(qū)占據(jù)較大的豐度，其他功能區(qū)均較小，有研究發(fā)現(xiàn)Aeromonassp. HN-2是一株耐鹽高效異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌[41].Thauera在旅游區(qū)的豐度最大，Sulfuritalea在生活區(qū)的豐度比其他功能區(qū)均較大. 綜上Oceanimonas、Azoarcus、Comamonas和Pectobacterium可以作為原始區(qū)好氧反硝化菌群落的標(biāo)志物種，F(xiàn)errimonas在養(yǎng)殖區(qū)的標(biāo)志作用最明顯，Achromobacter、Rhodobacter、Azospira、Magnetospirillum和Bosea在入淀區(qū)占據(jù)著最大的豐度，指示作用最強，Sulfutitalea和Bordetella可以作為生活區(qū)的指示物種，旅游區(qū)的指示物種為Thauera.

2.6 好氧反硝化菌群與碳源的關(guān)聯(lián)分析

2.6.1 RDA分析 好氧反硝化菌在脫氮的過程中以碳源作為電子供體來發(fā)揮反硝化作用，并且碳源是影響好氧反硝化過程最重要的限制因素之一[9]. 湖泊中的溶解性有機質(zhì)作為天然碳源，其不同組分和含量對好氧反硝化菌的影響均是不同的. 本文通過RDA分析來研究春季白洋淀好氧反硝化菌群落與溶解性有機物的關(guān)系，使用膨脹因子(VIF)檢驗篩選出P2(VIF>15)屬于高膨脹因子，將其去除后，基于VIF分析得到組分P1(VIF=2.15)、P3(VIF=13.71)、P4(VIF=12.46)和P5(VIF=2.31)是影響好氧反硝化菌群落分布的重要環(huán)境因子. 基于綱水平上的好氧反硝化菌群落與溶解性有機物的RDA分析結(jié)果顯示RDA1和RDA2共同解釋了總體變化的27.46%，圖7a中顯示養(yǎng)殖區(qū)的采樣點主要與P1類酪氨酸組分呈正相關(guān)，并且與P5類腐殖酸組分呈負相關(guān)，表明養(yǎng)殖區(qū)的好氧反硝化菌群落可以較好地利用類酪氨酸物質(zhì)而對類腐殖酸類物質(zhì)難以利用. 從圖7b中可以看出Alphaproteobacteria與P4、P5組分均呈正相關(guān)，與P3組分呈負相關(guān)，表明Alphaproteobacteria與微生物代謝產(chǎn)物和類腐殖酸物質(zhì)呈正相關(guān)，與類富里酸物質(zhì)呈負相關(guān)，與類蛋白質(zhì)物質(zhì)相比，類腐殖質(zhì)物質(zhì)對被微生物利用更具有抗性，但是高分子量的溶解性有機物一般具有高疏水性能和眾多官能團[42]，這可能是Alphaproteobacteria能更好利用類腐殖質(zhì)物質(zhì)而對類富里酸物質(zhì)具有抗性的原因. Betaproteobacteria與P1、P4組分均呈正相關(guān)，表明Betaproteobacteria與類蛋白質(zhì)物質(zhì)呈正相關(guān). 有研究表明Alphaproteobacteria和Betaproteobacteria是響應(yīng)溶解性有機物的優(yōu)勢門[43]. Gammaproteobacteria與P4呈負相關(guān)，表明在微生物代謝產(chǎn)物濃度高的區(qū)域Gammaproteobacteria的豐度較小. P4(R2=0.2754，P<0.05)能解釋最多的好氧反硝化菌群落綱水平上的差異性，因此，微生物代謝產(chǎn)物是影響春季白洋淀好氧反硝化菌群落綱水平差異的關(guān)鍵環(huán)境因子.

圖7 基于綱水平的不同功能區(qū)好氧反硝化菌(a)和整體好氧反硝化菌(b)與溶解性有機物的冗余分析 (P1代表類酪氨酸，P3代表類富里酸，P4代表微生物代謝產(chǎn)物，P5代表類腐殖酸)Fig.7 RDA analysis of aerobic denitrifying bacteria in different functional areas(a), the whole aerobic denitrifying bacteria(b) and dissolved organic matter at class level

基于屬水平上的好氧反硝化菌群落與溶解性有機物的RDA分析結(jié)果顯示，RDA1和RDA2共同解釋了總體變化的22.87%，從圖8a中可以看出養(yǎng)殖區(qū)的采樣點主要與P5呈負相關(guān)，這與綱水平上的好氧反硝化菌群落與溶解性有機物的冗余分析結(jié)果一致. 生活區(qū)的采樣點主要與P4組分呈正相關(guān)，表明生活區(qū)的好氧反硝化菌群落可以較好地利用微生物代謝產(chǎn)物. 圖8b顯示Pseudomonas與P4、P1均呈正相關(guān)，Thauera、Agrobacterium、Azospirillum與P5均呈正相關(guān)，Bradyrhizobium與P1呈負相關(guān)，Azospira與P5呈負相關(guān). P5(R2=0.2408，P<0.05)能解釋最多的好氧反硝化菌群落屬水平上的差異性，因此，類腐殖酸類物質(zhì)是影響春季白洋淀好氧反硝化菌群落屬水平差異的關(guān)鍵環(huán)境因子. 在未來對白洋淀不同功能區(qū)的高效好氧反硝化菌的定向篩選過程中，以養(yǎng)殖區(qū)沉積物進行馴化時可以適當(dāng)添加類酪氨酸類物質(zhì)作為碳源. 綜上，類酪氨酸物質(zhì)、類富里酸物質(zhì)、微生物代謝產(chǎn)物和類腐殖酸物質(zhì)是白洋淀春季不同功能區(qū)好氧反硝化菌群落綱水平和屬水平上存在差異的主要原因，其中微生物代謝產(chǎn)物和類腐殖酸物質(zhì)分別是影響綱水平和屬水平上好氧反硝化菌差異的關(guān)鍵環(huán)境因子.

圖8 基于屬水平的不同功能區(qū)好氧反硝化菌(a)和整體好氧反硝化菌(b)與溶解性有機物的冗余分析 (P1代表類酪氨酸，P3代表類富里酸，P4代表微生物代謝產(chǎn)物，P5代表類腐殖酸)Fig.8 RDA analysis of aerobic denitrifying bacteria in different functional areas(a), the whole aerobic denitrifying bacteria (b) and dissolved organic matter at genus level

2.6.2 相關(guān)性分析 為了研究溶解性有機質(zhì)對好氧反硝化菌群落的影響，本研究通過Spearman相關(guān)系數(shù)分析了溶解性有機質(zhì)與好氧反硝化菌群落的相關(guān)性. 綱水平上養(yǎng)殖區(qū)、入淀區(qū)和生活區(qū)以及白洋淀整體區(qū)域沉積物好氧反硝化微生物群落組成與熒光組分的相關(guān)性如表1所示，Alphaproteobacteria、Betaproteobacteria、Gammaproteobacteria、Deltaproteobacteria和Epsilonproteobacteria是綱水平的主要優(yōu)勢菌群并且均屬于變形菌門，已有研究表明變形菌門與溶解性有機物有顯著的關(guān)聯(lián)性[44]. 養(yǎng)殖區(qū)中Epsilonproteobacteria與P5組分呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)性系數(shù)為0.8799，表明Epsilonproteobacteria與類腐殖酸物質(zhì)呈顯著正相關(guān)，并且養(yǎng)殖區(qū)中Epsilonproteobacteria與類蛋白質(zhì)組分呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)，與類腐殖質(zhì)組分呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)性系數(shù)分別為-0.9830和0.9832. 入淀區(qū)中Alphaproteobacteria 與P4呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)性系數(shù)為0.8703，Deltaproteobacteria和Epsilonproteobacteria均與P3呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)性系數(shù)分別為0.8370和0.8545. 生活區(qū)中Gammaproteobacteria與P2組分呈顯著正相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)為0.7971，表明Gammaproteobacteria主要消耗類色氨酸類物質(zhì)，Deltaproteobacteria均與P4、P5均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)性系數(shù)分別為0.7559和0.7851. 從白洋淀整體來說，Alphaproteobacteria與P5組分呈顯著正相關(guān)

表1 養(yǎng)殖區(qū)、入淀區(qū)、生活區(qū)和白洋淀整體區(qū)域沉積物中綱水平上napA型好氧反硝化菌與溶解性有機物的Spearman相關(guān)系數(shù)*Tab.1 Spearman correlation coefficient of dissolved organic matter and napA-type aerobic denitrifying bacteria at class level in the sediments of the breeding area, the entry area, the living area and the whole area of Lake Baiyangdian

圖9 養(yǎng)殖區(qū)(a)、入淀區(qū)(b)、生活區(qū)(c)和白洋淀整體區(qū)域(d)沉積物中屬水平上napA型好氧反硝化菌與 溶解性有機物的Spearman相關(guān)性分析(P1代表類酪氨酸，P2代表類色氨酸，P3代表類富里酸， P4代表微生物代謝產(chǎn)物，P5代表類腐殖酸，P1.P2.P4代表類蛋白質(zhì)，P3.P5代表類腐殖質(zhì))Fig.9 Spearman correlation analysis of dissolved organic matter and napA-type aerobic denitrifying bacteria at genus level in the sediments of the breeding area(a), the entry area(b), the living area(c) and the whole area of Lake Baiyangdian (d)

為明確好氧反硝化微生物群落對溶解性有機物的響應(yīng)，在屬水平上分析沉積物中好氧反硝化群落組成與熒光組分的相關(guān)性，圖9為白洋淀養(yǎng)殖區(qū)、入淀區(qū)、生活區(qū)和白洋淀整體區(qū)域好氧反硝化菌群落與溶解性有機質(zhì)的相關(guān)性分析. 在養(yǎng)殖區(qū)中，Bradyrhizobium與P5組分呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)性系數(shù)為0.8514，Agrobacterium與類蛋白質(zhì)組分呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，與類腐殖質(zhì)組分呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)性系數(shù)分別為-0.8776和0.8780. 在入淀區(qū)中，Thauera和Azoarcus均與P5組分呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)性系數(shù)分別為0.8183和0.8654. 生活區(qū)中Aeromonas與P2組分的相關(guān)性系數(shù)為0.7787，呈顯著正相關(guān)(P<0.05). 從白洋淀整體來說，Bradyrhizobium與P1組分呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)，相關(guān)性系數(shù)為-0.5223，Magnetospirillum與P3組分呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)性系數(shù)為-0.4148，Aeromonas與P4組分呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)性系數(shù)為-0.3995，Thauera與P5組分呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)性系數(shù)為0.4122. 有研究從Thauera檢測出nirS基因，同時可以耐高碳氮負荷[47]，在馴化耐高碳氮的好氧反硝化菌時可以適當(dāng)控制類腐殖酸類物質(zhì)，Aeromonas對鹽度波動有較高的適應(yīng)性，在高鹽環(huán)境下也能有效去除氨氮和總氮[48]，在馴化適應(yīng)高鹽環(huán)境下的好氧反硝化菌時可以適當(dāng)添加類色氨酸類物質(zhì)，同時避免微生物代謝產(chǎn)物對Aeromonas的抑制作用，這表明不同微生物群落對碳源的響應(yīng)不同，在未來的好氧反硝化菌馴化過程中，篩選不同適應(yīng)性菌株時可以相應(yīng)添加碳源來提升菌群的豐度.

3 結(jié)論

1)通過熒光區(qū)域積分法分析，白洋淀春季沉積物有機質(zhì)中類蛋白質(zhì)組分含量要高于類腐殖質(zhì)組分，其中養(yǎng)殖區(qū)的類蛋白質(zhì)組分最高，原始區(qū)的類腐殖質(zhì)組分最高.

2)春季白洋淀沉積物中好氧反硝化菌共分為9個門類，其中變形菌為第一大門類. 旅游區(qū)的好氧反硝化菌群豐度最大，5個不同功能區(qū)的好氧反硝化菌群豐富度呈顯著差異(P<0.05)，多樣性不存在顯著差異(P>0.05). 各個采樣點的菌種組成存在差異.Ferrimonas作為指示物種，在不同采樣點好氧反硝化微生物群落中差異貢獻最大.

3)好氧反硝化菌與溶解性有機物的RDA分析結(jié)果表明，類酪氨酸物質(zhì)、類富里酸物質(zhì)、微生物代謝產(chǎn)物和類腐殖酸物質(zhì)是白洋淀春季不同功能區(qū)好氧反硝化菌群落綱水平和屬水平上存在差異的主要原因，其中微生物代謝產(chǎn)物和類腐殖酸物質(zhì)分別是影響綱水平和屬水平上好氧反硝化菌差異的關(guān)鍵環(huán)境因子. 通過RDA和Spearman相關(guān)性分析可知，Alphaproteobacteria與類腐殖酸類物質(zhì)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，Gammaproteobacteria與微生物代謝產(chǎn)物呈顯著負相關(guān)(P<0.05)，在不同功能區(qū)以及白洋淀整體中Aeromonas與微生物代謝產(chǎn)物呈負相關(guān)，Thauera與類腐殖酸物質(zhì)呈正相關(guān).