SPME-GC-MS結(jié)合OAV分析不同產(chǎn)區(qū)花椒炸花椒油的關(guān)鍵香氣物質(zhì)

高夏潔，高海燕，趙 鐳，史波林，張璐璐，汪厚銀，鐘 葵,*

（1.上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444；2.中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院農(nóng)業(yè)食品標(biāo)準(zhǔn)化研究所，北京 102200）

花椒（Zanthoxylum bungeanum）分布廣泛，如早期的農(nóng)業(yè)文獻(xiàn)《齊民要術(shù)》中就有“蜀椒出武都，秦椒出天水”的記載，可見花椒自古就已形成特有的優(yōu)良 產(chǎn)區(qū)[1]?；ń分迫〉幕ń酚褪悄壳白畛Ｒ姷幕ń芳庸て?，有效解決花椒食用不便的問題[2]，是一道調(diào)味佳品[3-4]，味道溫和、椒香濃郁、味道鮮美、醇麻可口，且炸花椒油的咸香風(fēng)味更濃郁[5]，還具有除腥去膻、增香調(diào)味的功效，深受消費(fèi)者的喜愛[1]。

張玉霖等[6]分析了市售花椒油的揮發(fā)性香氣成分，研究發(fā)現(xiàn)檜烯、(E)-β-羅勒烯、桉葉油醇、乙酸芳樟酯是其主要的揮發(fā)性化合物。目前Sun Jie等[7]采用香氣萃取稀釋分析結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)與氣相色譜-嗅覺法鑒定四川漢源和陜西韓城兩個(gè)地區(qū)的花椒油中的主要香氣活性化合物，發(fā)現(xiàn)β-水芹烯、p-傘花烴、乙酸辛酯、辛酸、香茅醇和檜烯在2種花椒油的香氣差異中起關(guān)鍵作用，并發(fā)現(xiàn)乙酸芳樟酯、芳樟醇和檸檬烯是紅花椒的主要成分。研究證明生態(tài)環(huán)境對紅花椒的香氣品質(zhì)有顯著影響，不同產(chǎn)地的花椒揮發(fā)性風(fēng)味成分有很大差異[8]。采用不同產(chǎn)地花椒制取的花椒油食品調(diào)味效果差異顯著，然而目前對不同產(chǎn)地花椒制取花椒油的香氣研究報(bào)道較少，因此研究不同產(chǎn)地花椒油的揮發(fā)性風(fēng)味成分及關(guān)鍵香氣物質(zhì)十分有必要[9]。

為對花椒油中的香氣成分定性及定量，采用頂空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HSSPME）與GC-MS聯(lián)用技術(shù)對同種工藝下不同產(chǎn)地紅花椒油揮發(fā)性風(fēng)味成分的差異進(jìn)行分析[10-11]。旨在為建立紅花椒油香氣成分圖譜數(shù)據(jù)庫提供數(shù)據(jù)支持，為市售花椒油產(chǎn)地溯源提供理論及數(shù)據(jù)參考[12]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒樣品均為紅花椒，其中四川花椒樣品由成都珪一食品開發(fā)股份有限公司提供，其余樣品均由陜西省韓城市花椒管理局提供，詳細(xì)信息見表1。

表1 花椒樣品產(chǎn)地及品種信息Table 1 Geographical origins and cultivars of Z. bungeanum used in this study

C7～C40系列烷烴標(biāo)準(zhǔn)品 美國Agilent科技公司；1,2-二氯苯 上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S-3L數(shù)顯恒溫油浴鍋、HH-1數(shù)顯電子恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；DC-320AS型電子天平 南京蘇測計(jì)量儀器有限公司；7890A-5975C GC-MS聯(lián) 用儀 美國Agilent科技公司；手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣針及DVB/CAR/PDMS萃取頭（50/30 μm）、HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Supelco公司； PC-420D磁力加熱攪拌器 美國Corning公司。

1.3 方法

1.3.1 花椒油制備

參考文獻(xiàn)[5-7]基礎(chǔ)上，開展熱炸花椒油預(yù)實(shí)驗(yàn)，考察不同油溫（110～230 ℃）、不同油炸時(shí)間（5～30 min）花椒油的香氣品質(zhì)，最終確定花椒油制備工藝：菜籽油→油浴加熱→加入花椒→恒溫油炸→冰水冷卻→過篩（90 目）→花椒油。

上述工藝中，將菜籽油加入100 mL棕色錐形瓶中，添加量為25.00 g，油浴加熱溫度至180 ℃后恒溫20 min，迅速加入5.00 g破碎花椒粒，加蓋后油炸6 min，取出后迅速用冰水冷卻，冷卻至常溫后（5～10 min）密封冷藏，放置第2天上機(jī)測試。

1.3.2 樣品前處理

稱取5.00 g花椒油樣品與20 mL頂空瓶中，并加入1 μL質(zhì)量濃度為0.326 5 μg/μL的1,2-二氯苯溶液。將頂空瓶加蓋密封后，放置于75 ℃的恒溫水浴鍋中，平衡20 min后，插入HS-SPME進(jìn)樣針，推出吸附涂層，萃取30 min[11]，萃取結(jié)束后將萃取頭從樣品瓶中拔出，立即插入GC進(jìn)樣口，250 ℃解吸10 min，實(shí)驗(yàn)平行3 次測定[13]。

1.3.3 GC-MS測定

GC條件：HP-5MS彈性石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），進(jìn)樣口溫度：250 ℃，載氣：高純（99.999%）氦氣，載氣流速：1.00 mL/min，進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣，色譜柱升溫程序：起始溫度65 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升至95 ℃，保持1 min；以1 ℃/min升至97 ℃，保持2 min；以1 ℃/min升至120 ℃，保持2 min；以5 ℃/min升至190 ℃，保持0 min；以 30 ℃/min升至230 ℃。

MS條件：電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍40～450 u，延遲3 min。

1.3.4 定性與定量

定性方法：分離出的未知物與NIST 14.0譜庫進(jìn)行檢索（僅選匹配度大于80%的鑒定結(jié)果），并與標(biāo)準(zhǔn)品的保留指數(shù)（retention index，RI）值進(jìn)行對比分析[14]，通過直接和相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品比較及質(zhì)譜圖的方式定性，化合物RI計(jì)算見式（1）：

式中：n為碳數(shù)；t′x為保留在碳數(shù)n和n+1正構(gòu)烷烴之間目標(biāo)化合物保留時(shí)間；t′n為碳數(shù)是n的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間；t′（n+1）為碳數(shù)是n+1的正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間。

定量方法：使用內(nèi)標(biāo)法定量，1,2-二氯苯（0.326 5 μg/μL）溶液為內(nèi)標(biāo)，并根據(jù)內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度從而計(jì)算樣品中每一個(gè)揮發(fā)性香氣物質(zhì)的質(zhì)量濃度，定量公式見式（2）：

式中：Ci為化合物質(zhì)量濃度/（μg/mL）；Cis為內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度/（μg/mL）；Ai為化合物的色譜峰面積；Ais為內(nèi)標(biāo)物色譜峰面積[14-15]。

1.3.5 關(guān)鍵香氣活性物質(zhì)分析

氣味活度值（odor activity value，OAV）表示呈香物質(zhì)在香氣中起作用的強(qiáng)度，當(dāng)OAV≥1，該香氣物質(zhì)可能對食品香氣的貢獻(xiàn)和影響較大，OAV＜1，表明該物質(zhì)對總體香氣無實(shí)質(zhì)性貢獻(xiàn)，一般情況下，OAV越大說明該物質(zhì)對總體香氣的貢獻(xiàn)越大[16]。因此，本研究把OAV不小于1作為花椒油特征香氣成分的判別標(biāo)準(zhǔn)[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每次數(shù)據(jù)采集分別選擇3個(gè)平行樣，采用Microsoft Office Excel 2016進(jìn)行原始數(shù)據(jù)處理，IBM SPSS Statistics 23、Origin 2021、Metabo Analyst進(jìn)行分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地花椒制取花椒油揮發(fā)性風(fēng)味成分解析

經(jīng)GC-MS檢測，不同產(chǎn)地紅花椒制取花椒油揮發(fā)性風(fēng)味成分總含量介于85.91～1 201.35 mg/kg之間，且存在顯著差異（P＜0.05）。17種不同的紅花椒為原材料制取的花椒油含有55種揮發(fā)性風(fēng)味成分（18個(gè)共有組分），對這些揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行定性、定量分析，包括22種烴類、17種醛酮類、9種醇類、5種酯類、1種酸類和1種呋喃類化合物。熱圖將GC-MS分析得到的揮發(fā)性風(fēng)味成分?jǐn)?shù)據(jù)可視化[16]，紅色代表同種物質(zhì)在某一樣品中的含量高，藍(lán)色則代表該物質(zhì)在對應(yīng)樣品中的含 量低[17]，不同產(chǎn)地紅花椒制取花椒油揮發(fā)性風(fēng)味成分總含量分布熱圖如圖1所示，17種花椒油中有含量高（在一個(gè)或多個(gè)樣品中含量≥1 000 mg/kg）的有芳樟醇、桉葉油醇、月桂烯、檸檬烯、乙酸芳樟酯，這與前人研究花椒油的主要成分一致[5-7,18]。同一工藝下，不同產(chǎn)地花椒炸制花椒油的揮發(fā)性風(fēng)味成分含量有區(qū)別。

圖1 花椒油GC-MS測定結(jié)果熱圖Fig. 1 Heatmap plot showing volatile composition of Z. bungeanum oil measured by GC-MS

2.2 花椒油特征香氣的分析

香氣閾值對于食品的香氣分析研究十分重要，許多揮發(fā)和非揮發(fā)化合物已經(jīng)從食品、飲料、水和其他溶劑中被鑒定出來，根據(jù)化合物在食品、飲料和飲用水中的濃度和閾值，可對這些體系中對香味或味覺重要性的貢獻(xiàn)率進(jìn)行判斷[19-20]。根據(jù)OAV理論，食品中香氣濃度高而閾值低的成分很可能是食品的特征香氣，物質(zhì)濃度高不一定對花椒油的香氣有很大貢獻(xiàn)，而含量低的物質(zhì)也有可能對花椒油的整體香氣有大的影響[21]。

參考文獻(xiàn)[7,21]，確定了25種香氣物質(zhì)在部分或所有花椒油樣品中OAV大于1，它們是花椒油中的關(guān)鍵香氣物質(zhì)，閾值及嗅聞香氣描述如表2所示，成分主要為烴類、醛酮類，另外還有醇類、酯類和酸類，OAV結(jié)果如表3所示。

表2 不同產(chǎn)地花椒制取花椒油特征香氣成分的閾值及其嗅覺描述Table 2 Thresholds and olfactory description of characteristic aroma components of fried Z. bungeanum oil from different production areas

表3 不同產(chǎn)地花椒炸花椒油特征香氣成分的OAVTable 3 OAVs of characteristic aroma components of fried Z. bungeanum oil from different geographical origins

可以看出，O1（(-)-β-蒎烯）、O3（羅勒烯）、O4（水芹烯）、O7（p-傘花烴）、O10（(E,E)-2,4-庚二烯醛）、O16（R-(-)-香芹酮）、O24（乙酸芳樟酯）這7種香氣物質(zhì)在部分花椒油樣品中100＜ OAV＜1 000，O2（月桂烯）、O5（檸檬烯）、O17（桉葉油醇）、O18（芳樟醇）這4種香氣物質(zhì)在部分花椒油樣品中OAV≥1 000，經(jīng)文獻(xiàn)中描述芳樟醇有花香、青香、木香、甜香，桉葉油醇有松油香、草藥味、樟腦氣息，月桂烯有花香，檸檬烯有柑橘香及清淡的香脂 香氣[6-7,11,22]，這些物質(zhì)對不同產(chǎn)地花椒油的整體香氣及差異區(qū)分起到很大的貢獻(xiàn)作用，其余關(guān)鍵香氣物質(zhì)為花椒油的整體香氣起到重要修飾作用[23-24]。

2.3 特征香氣物質(zhì)與產(chǎn)區(qū)關(guān)聯(lián)分析

主成分分析（principal component analysis，PCA）采用降維思想，將原來的眾多變量通過降維、除噪轉(zhuǎn)化為幾個(gè)綜合指標(biāo)用于反映原來變量的信息[16-17]。由表3可見，不同香氣物質(zhì)或同一香氣物質(zhì)OAV差異很大，因此將表3中17個(gè)不同產(chǎn)地紅花椒OAV進(jìn)行歸一化處理，再采用Metabo Analyst進(jìn)行分析，繪制樣品得分圖，見圖2。由圖2可見，17個(gè)樣品分為4 組，第1組是甘肅伏椒（Z1～Z5）以及四川茂縣及汶川大紅袍花椒（Z7和Z8）；第2組為四川南椒（Z9～Z11）及甘肅棉椒（Z6）；第3組為陜西、山西、河北大紅袍品種（Z12～Z15）及山東大顆粒（Z16）；第4組為山東萊蕪小顆粒花椒（Z17）。四川汶川花椒品種為大紅袍，但由于四川茂汶地形、日照特點(diǎn)，以及多年品種循化導(dǎo)致四川茂汶這2個(gè)大紅袍花椒品種與其他省份大紅袍樣品存在明顯香氣差別，PCA聚類中將其與甘肅伏椒歸為一類；山東小顆粒個(gè)頭小、顏色暗紅，且香氣組成上與其他花椒樣品差異顯著，根據(jù)得分圖可將該品種花椒單獨(dú)歸為一類。因此，產(chǎn)區(qū)和品種對分類影響較大，表明是花椒特征香氣物質(zhì)差異的重要因素。

圖2 花椒油樣品的OAV三維PCA得分示意圖Fig. 2 Three-dimensional PCA score plot of OAVs of fried Z. bungeanum oil samples

PCA側(cè)重于描述樣品分類趨勢[8]，偏最小二乘判別分析（partial least squares-discrimination analysis， PLS-DA）是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計(jì)方法[25]，可進(jìn)一步采用PLS-DA建立香氣物質(zhì)表達(dá)量OAV與樣品類別的關(guān)聯(lián)模型，實(shí)現(xiàn)樣品類別預(yù)測。OAV的PLS-DA三維得分圖如圖3所示，PC1貢獻(xiàn)率為25.3%，PC2貢獻(xiàn)率為23.2%，PC3貢獻(xiàn)率為17.2%?？芍庇^反映各樣本間的相似性和差異性，兩個(gè)樣本間差異越大，表現(xiàn)在得分圖上的相對位置越遠(yuǎn)，反之亦然。由圖3可知，17個(gè)不同產(chǎn)地花椒油樣品歸類結(jié)果與花椒品種直接相關(guān)，PLS-DA建立的關(guān)系模型可以將4 組花椒油樣品有效歸類。

圖3 花椒油樣品的OAV三維PLS-DA的得分示意圖Fig. 3 Three-dimensional PLS-DA score plot of OAVs of fried Z. bungeanum oil samples

PLS-DA的模型參數(shù)見圖4，這4 組有香氣區(qū)別的花椒油樣品在95%的置信區(qū)間空間分布區(qū)域性明顯，模型參數(shù)中R2及Q2，Q2＞0.8，表明模型具有較高的預(yù)測能力。通過置換檢驗(yàn)隨機(jī)化檢驗(yàn)通過標(biāo)簽的隨機(jī)排列檢查模型的Q2Y顯著性，見圖4，樣品量為100時(shí)，P＜0.01，表明極顯著相關(guān)。

圖4 花椒油樣品的OAV PLS-DA模型參數(shù)Fig. 4 PLS-DA model parameters of OAVs of fried Z. bungeanum oil samples

如圖5所示，可以通過計(jì)算變量投影重要度（variable importance for the projection，VIP）衡量PLS-DA模型下每一個(gè)變量因子的表達(dá)模式對各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，從而輔助標(biāo)志變量因子的篩選（通常以VIP＞1.0作為篩選標(biāo)準(zhǔn)）[26-27]，VIP值越大，表明該香氣化合物在組間的差異越大，對花椒油香氣類型的判別分類越關(guān)鍵。依據(jù)VIP＞1.0的原則，共篩選出8種關(guān)鍵差異性化合物，為水芹烯、羅勒烯、芳樟醇、桉葉油醇、乙酸芳樟酯、(-)-β-蒎烯、p-傘花烴及月桂烯[2,19,28-29]。

圖5 花椒油樣品OAV PLS-DA的VIP值Fig. 5 PLS-DA VIP of OAVs of fried Z. bungeanum oil samples

如圖6所示，根據(jù)OAV樣品得分示意圖及載荷圖，第1組為甘肅武都、元龍、秦安、甘谷的伏椒及四川茂汶大紅袍花椒油樣品，主要以芳樟醇、乙酸芳樟酯為關(guān)鍵差異性化合物，根據(jù)表2，芳樟醇香氣描述為花香、青香、木香、甜香；乙酸芳樟酯香氣描述為類似鈴蘭、薰衣草等香精油的幽雅香氣[26]，均為花香，因此本組特征可描述為較強(qiáng)的花香。第2組為四川漢源、鹽源、丹巴南椒及甘肅臨夏棉椒，主要以桉葉油醇、苯乙酸甲酯及芳樟醇為關(guān)鍵差異性化合物；根據(jù)表2，桉葉油醇香氣描述為松油香、草藥味、樟腦氣息；苯乙酸甲酯有弱的蜂蜜及麝香樣香氣；芳樟醇香氣描述為花香、青香、木香、甜香，但本組樣品與(-)-β-蒎烯、羅勒烯、p-傘花烴距離較遠(yuǎn)，根據(jù)香氣描述本組樣品香氣相對特點(diǎn)可描述為青草香、松木香及草藥香。第3組為陜西韓城、富平，山西運(yùn)城，河北涉縣及山東萊蕪花椒油樣品，以大紅袍品種為主，主要以月桂烯、水芹烯等為關(guān)鍵差異性化合物，根據(jù)表2，月桂烯香氣描述為花香；水芹烯香氣描述為黑胡椒香、藹荷香，根據(jù)香氣描述本組樣品香氣相對特點(diǎn)可描述為黑胡椒香、藹荷香等辛香。第4組是山東萊蕪獨(dú)有的花椒品種，其關(guān)鍵差異性化合物為(-)-β-蒎烯及羅勒烯，(-)-β-蒎烯香氣描述為松木香、樹脂香；羅勒烯香氣描述為甜香，但本組樣品與桉葉油醇距離很遠(yuǎn)，因此本組的香氣相對特點(diǎn)為松香、花香較弱。

圖6 花椒油樣品的OAV二維和三維PLS-DA的樣品得分載荷圖Fig. 6 Two-dimensional and three-dimensional PLS-DA score load plots of OAVs of fried Z. bungeanum oil samples

Sun Jie等[7]發(fā)現(xiàn)在陜西韓城及四川漢源花椒油中OAV較高的香氣物質(zhì)有桉葉油醇、β-月桂烯、β-羅勒烯、檸檬烯和芳樟醇，與本研究結(jié)果一致，但Sun Jie等[7]研究中發(fā)現(xiàn)(E)-2-庚醛OAV較高，本研究(-)-β-蒎烯、乙酸芳樟酯、(E,E)-2,4-庚二烯醛等OAV在部分樣品大于100，差異體現(xiàn)可能原因有花椒樣品、油樣品及花椒油制備工藝的區(qū)別等。王立艷等[30]研究發(fā)現(xiàn)高溫浸提花椒油相較于其他工藝乙酸芳樟酯含量高，并發(fā)現(xiàn)檸檬烯、芳樟醇、乙酸芳樟酯在高溫浸提花椒油中含量占比很高，與本研究結(jié)果一致?；ń酚偷南銡獬煞纸^大部分來自于花椒，而Iseli等[31]發(fā)現(xiàn)花椒中的主要揮發(fā)物有乙酸芳樟酯、檸檬烯、γ-松油醇、桉樹油、檜烯、芳樟醇和β-月桂烯，與本實(shí)驗(yàn)用花椒為原料制取的花椒油中主要揮發(fā)物研究結(jié)果基本一致。雖然花椒油樣品中主要揮發(fā)性物質(zhì)大體一致，但是香氣物質(zhì)含量的區(qū)別導(dǎo)致不同主產(chǎn)地花椒制取的花椒油樣品香氣差異很大，關(guān)鍵香氣物質(zhì)的分析對花椒油樣品的香氣描述及歸類至關(guān)重要，因此有必要對不同產(chǎn)地花椒油樣品的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行連續(xù)分析，以揭示不同產(chǎn)地花椒油樣品物質(zhì)成分的貢獻(xiàn)程度及香氣差異描述。

3 結(jié) 論

采用GC-MS聯(lián)用技術(shù)，對17個(gè)不同產(chǎn)地花椒作為原料，同種工藝制取花椒油中55種香氣物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析，通過進(jìn)一步分析確定25種揮發(fā)性物質(zhì)為花椒油的特征香氣成分，在此基礎(chǔ)上計(jì)算OAV確定花椒油的關(guān)鍵香氣成分。OAV法實(shí)現(xiàn)了對花椒油樣品復(fù)雜香氣的簡單化分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了以揮發(fā)性風(fēng)味成分分組的特點(diǎn)，OAV PCA結(jié)果表明：花椒油關(guān)鍵香氣成分主要有月桂烯、檸檬烯、桉葉油醇、芳樟醇，這幾個(gè)香氣物質(zhì)OAV在部分樣品中大于1 000，為花椒油主體香氣有很大的貢獻(xiàn)作用。經(jīng)PCA及PLS-DA，建立花椒油樣品原料花椒分類的有效判別模型；基于VIP＞1和P≤0.05，篩選出了8種關(guān)鍵差異性化合物，這8種關(guān)鍵差異性化合物是水芹烯、羅勒烯、芳樟醇、桉葉油醇、乙酸芳樟酯、(-)-β-蒎烯、p-傘花烴及月桂烯。根據(jù)這些香氣物質(zhì)可將17種不同產(chǎn)地花椒油樣品分為4 組香氣類型，這4 組香氣類型花椒油樣品在95%的置信區(qū)間空間分布區(qū)域性明顯，根據(jù)香氣差異可描述為第1組以伏椒為原料的花椒油樣品有濃郁的花香，以芳樟醇、乙酸芳樟酯為特征風(fēng)味物質(zhì)；第2組以棉椒及南椒為原料的花椒油樣品有突出的青草香、松木香及草藥香，以桉葉油醇、苯乙酸甲酯及芳樟醇為特征風(fēng)味物質(zhì)；第3組主要以大紅袍為原料的花椒油樣品，樣品黑胡椒香、藹荷香等辛香較為突出，第4組是一種獨(dú)有的小顆?；ń菲贩N，樣品香氣相對特點(diǎn)為松香、花香較弱，以(-)-β-蒎烯及羅勒烯為特征風(fēng)味物質(zhì)。根據(jù)分組結(jié)果可知，花椒油樣品的香氣差異與品種有密切相關(guān)性，但是四川茂縣及四川汶川花椒品種為大紅袍，由于特殊的地理地形及很多產(chǎn)地因素循化，這兩個(gè)產(chǎn)地的兩個(gè)花椒油樣品香氣類型與伏椒更為接近，由此可見，花椒產(chǎn)地對花椒油的香氣類型有一定的影響，關(guān)于不同產(chǎn)地同一花椒品種制取的花椒油的香氣類型差異還有待研究。