琥珀酰化調控大豆分離蛋白電荷密度對其構象及乳化性的影響

劉冠男，胡 淼，杜曉倩，謝鳳英，齊寶坤,*，李 楊,2,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省綠色食品科學研究院，黑龍江 哈爾濱 150000）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）是植物蛋白質的重要來源，可提供包括賴氨酸在內的多種必需氨基酸，具有較高的營養(yǎng)價值。SPI可以經(jīng)堿溶酸沉法提取，主要成分是儲藏蛋白，即7S和11S球蛋白，占總蛋白的65%～80%[1]。由于SPI具有營養(yǎng)豐富、價格低廉、加工性能好等優(yōu)點，因此廣泛用于各類食品中，主要包括“人造肉”[2]、發(fā)酵類食品[3]、凝膠類食品[4]等，具有相當高的消費者接受度。由于SPI致密的球狀結構、低分子柔性以及其在油水界面吸附性不良而導致乳化性等功能性質不理想[1]。因此，許多方法被用來改變SPI的結構、構象以及聚集狀態(tài)以提高其功能性。

蛋白質化學修飾具有效率高、可控性強的特點，可以改善蛋白質的理化性質和功能性質，與物理修飾和酶修飾相比，更易于大規(guī)模生產(chǎn)[5]。琥珀?；浅Ｒ娦揎椀鞍踪|的手段，通過用琥珀?；揎椀鞍踪|的氨基（賴氨酸、精氨酸）、羥基和巰基改變蛋白質的帶電狀態(tài)，調控蛋白質表面電荷密度[6-7]。Mirmoghtadaie等[8]研究表明，?；档土搜帑湹鞍椎某炙芰?，提高了燕麥蛋白的乳化性和溶解性。Shilpashree等[9]報道了琥珀?；罄业鞍姿徕c的溶解度、黏度和乳化性均能得到改善。Wan Yangling等[10]研究指出琥珀酰化可以提高大豆蛋白的熱穩(wěn)定性，抑制蛋白在高溫下的熱聚集。由此可見，?；男钥梢蕴岣叩鞍兹芙庑浴⑷榛?、起泡性、熱穩(wěn)定性等功能性質。蛋白質構象的改變與功能性質的改善息息相關[11]。然而，相關研究僅停留于琥珀酰化改性對蛋白功能性質的影響，關于琥珀?；{控SPI表面電荷密度對其構象影響的研究鮮有報道，且?；疭PI調控電荷密度使其構象改變與乳化性改善的關系還有待進一步探索。

本實驗通過研究琥珀?；{控SPI電荷密度對其構象以及乳化性的影響，探究?；鞍讟嬒笞兓腿榛愿纳浦g的關系。利用不同濃度的琥珀酸酐對SPI改性，采用電位、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）、掃描電子顯微鏡、熒光光譜、紫外光譜、傅里葉變換紅外光譜等方法表征酰化蛋白構象與乳化性之間的關系。本實驗旨在為琥珀?；男栽诘鞍仔揎椃矫娴膽锰峁├碚搮⒖?，并為高功能性大豆蛋白產(chǎn)品的開發(fā)提供新的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（東農(nóng)-42） 東北農(nóng)業(yè)大學大豆研究所；琥珀酸酐（丁二酸酐，色譜純≥99%）；透析袋（截流分子質量7 kDa）；茚三酮 上海源葉生物科技有限公司；1-苯胺基-8-萘磺酸鹽（1-anilino-8-naphthalene sulfonate，ANS） 美國Sigma公司；鹽酸、氫氧化鈉、正己烷、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純） 北京新光化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

AL204型分析天平 梅勒特-托利多儀器（上海）有限公司；JJ-1增力電動攪拌器 江蘇金城國勝儀 器廠；Allegra64R臺式高速冷凍離心機 美國貝克曼 公司；PHS-3C型實驗室pH計 中國上海雷磁公司；mini-PROTEAN Tetra電泳儀 美國Bio-Rad-Laboratories公司；Zetasize nanozs 90型粒度電位儀 英國馬爾文儀器有限公司；SU801場發(fā)射掃描電子顯微鏡、RF-6000熒光分光光度計 日本Hitachi公司；UV-2600型紫外-可見分光光度計、IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的制備

采用堿溶酸沉的方法[12]。選擇新鮮無蟲蛀、無霉爛、無破損的大豆破碎磨粉，過60 目篩，并用正己烷脫脂。將脫脂大豆粉分散于去離子水中并使之充分溶解，料液比為1∶10（g/mL），并用2 mol/L的NaOH溶液調節(jié)pH 8.0，室溫下攪拌2 h，4 ℃、9 000×g離心30 min，收集上清液，用2 mol/L的HCl溶液調節(jié)pH 4.5，靜置1 h，4 ℃、6 500×g離心30 min，收集沉淀。用去離子水將沉淀水洗3 次后調pH 7.0，去除不溶物，將蛋白溶液冷凍干燥得到SPI。

1.3.2 琥珀酰化改性SPI

參考Wan Yangling等[10]的方法并稍作修改。準確稱取一定量的SPI溶于去離子水中配制成2.5 g/100 mL SPI懸浮液，在室溫下攪拌2 h使其充分溶解，用2 mol/L的NaOH溶液調pH 8.0。將琥珀酸酐緩慢加入到SPI溶液中，酸酐與SPI的質量比分別為0.02∶1、0.05∶1、0.10∶1、0.15∶1，獲得4個不同?；潭鹊腟PI樣品。在加入琥珀酸酐的過程中，用2 mol/L的NaOH溶液使整個反應體系pH值穩(wěn)定在8.0±0.2。當pH值穩(wěn)定于8.0時，將溶液在室溫下再攪拌1 h，然后將所得液體放入4 ℃冰箱透析24 h去除未反應的小分子琥珀酸酐和鹽，冷凍干燥后得到4種不同?；鹊腟PI粉末，分別將其命名為SSPI-1、SSPI-2、SSPI-3、SSPI-4。

1.3.3 ?；鹊臏y定

根據(jù)Pan Yi等[13]的方法稍作修改。分別將1 g/100 mL的蛋白溶液和2 g/100 mL的茚三酮溶液各1 mL混合，將混合液在沸水浴中加熱10 min，然后快速冷卻至室溫。向冷卻的混合液中加入5 mL去離子水。隨后在570 nm波長處測定溶液的吸光度。根據(jù)式（1）計算SPI的 ?；龋?/p>

式中：A0與A1分別為?；臀歹；鞍椎奈?光度。

1.3.4 Zeta電位測定

用1 mol/L的HCl和NaOH溶液將SPI/SSPI溶液（10 mg/mL）調整至pH 3～7，利用Zetasize nanozs 90型粒度電位儀測定不同pH值條件下不同樣品的Zeta電位，測定溫度25 ℃、平衡時間2 min。

1.3.5 SPI/SSPI的微觀結構觀察

使用SU8010場發(fā)射掃描電子顯微鏡對SPI/SSPI的表面形貌進行觀察。將樣品均勻平攤在貼有導電膠的樣品臺上，噴金處理，觀察成像時加速電壓5 kV，觀測倍數(shù)為1 000。

1.3.6 SDS-PAGE分析

參考Qi Baokun等[14]的方法對SPI/SSPI進行電泳實驗。分別配制12%分離膠以及5%濃縮膠，將6 mg/mL的SPI/SSPI與上樣緩沖液混合均勻后煮沸90 s，冷卻至室溫上樣。開始電泳時電壓為80 V，待樣品進入分離膠后改為120 V；電泳結束后，取出膠片加入染色液染色30 min，之后再用脫色液脫色后進行分析。

1.3.7 內源熒光光譜分析

采用RF-6000熒光分光光度計測定SPI/SSPI的內源性熒光。將SPI和SSPI溶解在10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0），樣品質量濃度為0.1 mg/mL，設定激發(fā)波長為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，掃描范圍290～400 nm。

1.3.8 紫外光譜分析

采用UV-2600型紫外分光光度計對SPI/SSPI進行紫外吸收光譜采集。將SPI和SSPI溶解在10 mmol/L 的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0），樣品質量濃度為 0.1 mg/mL，測定速率為中速，分辨率為0.5 nm，測定波長范圍200～400 nm。

1.3.9 紅外光譜分析

采用IRTracer-100型傅里葉變換紅外光譜在室溫下記錄SPI/SSPI的紅外光譜。將樣品與溴化鉀混合，然后壓片。掃描范圍為400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)為64 次，分辨率為4 cm-1。

1.3.10 表面疏水性測定

參考夏爽[15]的方法并作適當修改。使用10 mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液配制不同質量濃度梯度SPI/SSPI溶液（0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL）各4 mL，然后加入100 μL ANS溶液（8 mmol/L，pH 7.0），充分混合，并在黑暗條件下反應15 min。使用熒光分光光度計測定其熒光強度，激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm，狹縫寬度均為5 nm，樣品的相對熒光強度值為樣品的熒光強度值與未加ANS溶液的樣品的熒光強度值之差。以樣品蛋白質量濃度為橫坐標，樣品的熒光強度值為縱坐標，計算所得曲線的初始斜率即為蛋白質的表面疏水性指數(shù)（H0）。

1.3.11 分子柔性的測定

參考Pan Yi等[16]的方法并作適當修改。將SPI和SSPI溶解在10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）中，配制1 mg/mL胰凝乳蛋白酶液，酶液溶于0.05 mol/L，pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中。3 mL樣品與200 μL酶液混合，在38 ℃反應10 min，然后加入3 mL質量濃度為4 g/100 mL的三氯乙酸溶液終止反應，沉淀未消化的蛋白，4 ℃、4 000×g離心30 min，然后用紫外分光光度計在280 nm波長處測定其吸光度表示分子柔性。

1.3.12 乳化活性及乳化穩(wěn)定性測定

參考Li Ting等[17]的方法并作適當修改。配制5 mg/mL 的SPI/SSPI溶液，加入玉米油，油水比為1∶9，用高速剪切均質機在12 000 r/min均質1 min形成乳狀液，立即從距離乳狀液底部0.5 cm處取50 μL新鮮乳狀液分散于5 mL 0.1%的SDS溶液中，振蕩均勻后在500 nm波長處測定吸光度，記作A0，以相同的方法取均質10 min后的乳狀液重復上述步驟，其吸光度記作A10。乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）由式（2）、（3）計算：

式中：A0與A10分別為乳狀液在第0分鐘和第10分鐘的吸光度；DF為稀釋倍數(shù)（100）；θ為油相體積分數(shù)0.2；L為比色皿厚度1 cm；C為蛋白質質量濃度（5 mg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個實驗重復3 次，結果表示為±s。圖表制作采用OriginPro 8.5軟件，使用SPSS 23.0進行ANOVA差異顯著性分析和方差分析（P＜0.05，差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 ?；潭燃半娢蛔兓?/h3>

?；磻脑硎酋；噭ㄧ晁狒?、乙酸酐等）與蛋白質分子的游離氨基、羥基或巰基之間的親核取代反應（圖1）[6-7]。由于賴氨酸pKa值低且位阻較弱，因此?；磻饕l(fā)生在賴氨酸ε-氨基的位置[18]，氨基的?；缺硎緸镹-?；?。當大多數(shù)氨基被琥珀?；?，脂族羥基和巰基也開始被琥珀酰化。

圖1 SPI與琥珀酸酐親核取代反應基理Fig. 1 Nucleophilic substitution mechanism between SPI and succinic anhydride

不同酸酐-SPI質量比的SPI?；潭茸兓鐖D2A所示，N-酰化度隨酸酐-SPI質量比的增加而增加，酸酐-SPI質量比為0.05∶1時，N-?；冗_77.82%。當比值進一步提高時，?；磻乃俾拭黠@下降。這一現(xiàn)象與Wan Yangling等[10]的發(fā)現(xiàn)一致，這可能是由于SPI的琥珀?；饔脧谋砻嬷鸩桨l(fā)生到內部，琥珀酸酐首先與蛋白質表面的氨基反應，反應速率快，當酸酐的量進一步增加時，蛋白質天然結構發(fā)生明顯改變，導致琥珀酸酐與蛋白質內部的氨基反應，反應速率下降。反應速率的轉折發(fā)生在酸酐-SPI的質量比等于0.05∶1時，此時N-?；冗_77.82%，因此推測約75%的賴氨酸殘基在SPI表面或附近，這部分基團優(yōu)先被酰化，SPI結構發(fā)生變化，從而導致掩埋的氨基暴露和?；?/p>

琥珀?；鶊F的引入會導致SPI等電點改變。SPI和SSPI在不同pH值條件下表面電荷的測定結果如圖2B所示。隨著pH值的提高，SPI和SSPI的Zeta電位呈下降趨勢。SPI屬于兩性電解質，因此具有一定的pH值依賴性。當pH值低于等電點時，基團質子化，氨基基團使SPI帶正電。當pH值高于等電點時，基團去質子化，由于羧基基團存在，SPI帶有負電荷[19]。隨著SPI琥珀?；潭鹊脑黾?，SPI的等電點呈下降趨勢，由4.30依次下降到3.56、3.47、3.17、3.12，主要是由于琥珀?；鶊F的引入使得帶正電荷的氨基基團轉變?yōu)閹ж撾姾傻溺牾；鶊F，增加了蛋白質表面負電荷密度，使得等電點移向更低的pH值，這與Wan Yangling[10]和Liu Guangyu[20]等的研究結果一致，從而證實了可通過引入琥珀酰基基團增強SPI的電負性。

圖2 不同酸酐-SPI比值的SPI?；潭龋ˋ）及SPI/SSPI的 Zeta電位隨pH值變化情況（B）Fig. 2 Degree of SPI succinylation as a function of acid anhydride to SPI ratio and zeta potential of SPI/SSPI as a function of pH

2.2 SPI/SSPI的微觀結構

蛋白結構與功能特性密切相關，研究其微觀結構能更好地理解和闡明功能特性改善的原因。從圖3可以看出，SPI呈現(xiàn)光滑致密的無規(guī)則片狀結構[21]，SSPI仍呈現(xiàn)出無規(guī)則片狀結構，但其光滑的表面出現(xiàn)一些小孔穴，這是因為琥珀酸酐與SPI發(fā)生反應改變了SPI的微觀結構。隨著N-酰化度的提高，小孔穴的數(shù)量越來越多，這表明琥珀酸酐首先與蛋白質表面的賴氨酸殘基發(fā)生反應。SSPI-3和SSPI-4表面小孔穴數(shù)量相差無幾，進一步證明了SPI琥珀?；饔檬菑腟PI的表面到內部逐步進行，與2.1節(jié)結果一致。

圖3 SPI/SSPI的微觀結構（×1 000）Fig. 3 Microstructure of SPI/SSPI (× 1 000)

2.3 SDS-PAGE分析

圖4顯示，相比較于SPI，SSPI的7Sα、α′和β亞基條帶略微上移并稍有變淺，SSPI-1和SSPI-2的泳道在75 kDa和100 kDa之間出現(xiàn)新的條帶，SSPI-3和SSPI-4的泳道在100 kDa出現(xiàn)新的條帶，這些現(xiàn)象說明琥珀?；鶊F的加入改變了SPI的分子質量，使得SPI中某些亞基分子質量增加。Haug等[22]的研究也表明，琥珀?；笕芫福ㄒ环N僅含有一條肽鏈的蛋白質）的分子質量增加。SPI的11S中酸性多肽的條帶隨著?；潭鹊脑黾酉蛏掀?，11S堿性多肽的條帶消失，而且在低于20 kDa的分子質量區(qū)域，相比較于SPI，SSPI的條帶變淺，變淺程度與酰化程度呈正比，且SSPI-3和SSPI-4彌散至25 kDa處，這可能是由于琥珀?；磻沟肧PI某些結構被分離[10]。

2.4 內源熒光光譜

如圖5所示，SSPI的熒光強度均高于SPI，這是由于SSPI攜帶更多負電荷，分子間排斥力增強，分子結構舒展使更多色氨酸暴露出來[23]。但隨著?；鹊脑黾?，SSPI的熒光強度逐漸下降，可能是由于隨著?；鹊脑黾?，鏈狀琥珀?；鶊F逐漸增多，使得蛋白空間位阻增加，形成一個密閉蛋白鏈空間，導致部分色氨酸殘基被包裹在內。除熒光強度變化外，峰位置的變化也值得關注。隨著?；鹊脑黾?，蛋白的λmax從330 nm逐漸增加到337 nm，產(chǎn)生紅移，表明琥珀酰化破壞了SPI分子內的疏水相互作用，且蛋白所在環(huán)境的極性增加，蛋白質的肽鏈伸展程度增加。這可能是因為酰化后蛋白質變性引起的分子展開和構象變化，導致掩埋在蛋白質內部的色氨酸殘基暴露于更加親水以及極性更大的環(huán)境中。SSPI-3與SSPI-4的熒光強度曲線相差不大，曲線穩(wěn)定，這與2.1節(jié)中?；潭鹊慕Y果相吻合。即在酸酐-SPI質量比大約為0.05∶1時，?；磻霈F(xiàn)一個轉折點，而當比值進一步提高時，N-?；葞缀鯖]有變化。但仍觀察到熒光強度發(fā)生了細微的變化，其可能的原因是在這一階段，酰化反應已經(jīng)進入蛋白內部，琥珀酸酐與脂族羥基和巰基發(fā)生反應。

圖5 SPI/SSPI的內源熒光光譜Fig. 5 Intrinsic fluorescence spectra of SPI/SSPI

2.5 紫外-可見光吸收光譜

圖6顯示，SPI與SSPI的紫外光譜峰值均在260～280 nm之間。蛋白的紫外吸收光譜在250～260 nm附近產(chǎn)生的吸收譜帶主要是由苯丙氨酸殘基貢獻，在260～290 nm內的吸收由酪氨酸殘基所引起，而292 nm附近的吸收則由色氨酸殘基貢獻[24]。因此認為本研究的紫外光譜變化主要由酪氨酸引起，其次是色氨酸。SSPI的紫外吸收強度相比較于SPI均下降，并且?；潭鹊淖兓c紫外光譜強度的變化呈負相關。實驗推測，隨著?；鹊奶岣撸牾；鶊F越來越多，使得蛋白空間位阻增加，形成一個密閉的蛋白鏈空間，酪氨酸殘基逐漸被包裹在蛋白質鏈的內部。除熒光強度變化外，峰位置也發(fā)生了變化，由266 nm紅移到275 nm，這一現(xiàn)象表明SPI的三級結構由于琥珀?；鶊F的加入發(fā)生改變，影響了蛋白質分子存在的微環(huán)境。

圖6 SPI/SSPI的紫外光譜Fig. 6 UV absorption spectra of SPI/SSPI

2.6 傅里葉變換紅外光譜測定結果

傅里葉變換紅外光譜是研究蛋白質化學組成和構象結構的一種方法[25]。如圖7所示，3 400 cm-1左右的寬峰是O—H與N—H伸縮振動重疊而成的多重吸收峰。隨著?；潭鹊奶岣?，寬帶逐漸消失，這是由于游離氨基與琥珀?；鶊F反應后其中N—H鍵變?yōu)镃—N鍵所致的。SSPI處于3 200～2 500 cm-1處的峰與SPI相比峰寬而散，一方面說明—COOH的存在，且隨著?；潭鹊脑黾?，—COOH的含量越來越多；另一方面也說明分子內氫鍵相互作用得到增強，這是由于O的電負性大于N，更容易形成氫鍵[26]。SSPI酰胺I帶與酰胺II帶的波形相比SPI沒有發(fā)生變化，強度變化也不明顯。SSPI圖譜在酰胺III帶1 300 cm-1處區(qū)域強度增加，這是由于酰化后 C—N鍵拉伸和N—H鍵變形導致。

圖7 SPI/SSPI的紅外光譜Fig. 7 Infrared spectra of SPI/SSPI

2.7 表面疏水性及分子柔性測定結果

采用ANS和蛋白質表面疏水區(qū)域的結合所引起的熒光增強評估蛋白質的表面疏水性。它可以反映蛋白質的構象變化，且與蛋白質的功能性質密切相關[27]。SSPI的表面疏水性變化如圖8所示。隨著?；潭鹊脑黾?，SPI的表面疏水性顯著下降。這一結果與燕麥蛋白[28]和蕓豆蛋白[29]的研究結果相似。表面疏水性的降低可能有兩個原因引起，一方面，?；餝PI三級結構的改變，導致表面疏水區(qū)域的比例降低；另一方面，琥珀?；瘜е码姾擅芏群碗娯撔缘脑黾?，這可以通過酰化后SPI的Zeta電位的降低證明（圖2），蛋白質的高負電荷分布或強電負性會引起靜電排斥，這可能會抑制ANS接近并與裸露的疏水區(qū)域結合，從而導致表面疏水性降低[28-29]。

蛋白質的分子柔性被定義為蛋白質中各個結構區(qū)域的相對運動或多肽鏈中氨基酸殘基的重排速率[30]。蛋白質的分子柔性在蛋白表面性質中起著十分重要的作用[31]。 SSPI的分子柔性的變化如圖8所示。相較于SPI，隨著?；潭鹊脑黾?，蛋白質的分子柔性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。這一結果表明，隨著琥珀?；磻M行，酰化程度提高，導致SPI結構展開，蛋白質分子柔性與酰化程度呈正比。但是，當琥珀酸酐與蛋白比值達到0.15∶1，蛋白質的分子柔性略有下降，這可能是琥珀?；鶊F在水溶液中存在形態(tài)是鏈狀結構，與蛋白質結合后，因為長鏈的存在而導致SPI產(chǎn)生一定的空間位阻，分子柔性降低。

圖8 SPI/SSPI的分子柔性和表面疏水性Fig. 8 Molecular flexibility and surface hydrophobicity of SPI/SSPI

2.8 乳化活性與乳化穩(wěn)定性測定結果

SPI成分主要包括7S與11S兩種球狀蛋白，因為低分子柔性以及其在油水界面吸附性不良而導致乳化性不理想[1]。EAI和ESI分別代表蛋白質在油/水界面形成和穩(wěn)定乳液的能力[32]。

琥珀?；男許PI會改變蛋白質分子的空間構象。如圖9所示，琥珀酰化可以顯著提高SPI的EAI以及ESI，且EAI和ESI的變化趨勢一致，SPI?；潭扰cEAI/ESI的變化呈正比。在SPI中加入琥珀酰基基團改變了蛋白質的構象和界面行為，導致SPI結構展開（2.4節(jié)和2.5節(jié)），因此SPI乳化性提高。Lawal等[33]指出，添加琥珀酸酐增加了油滴周圍界面膜電離層的電勢，從而提高了EAI和ESI。當酸酐與SPI比例達到0.15∶1時，EAI和ESI略有下降，但是仍比未改性的SPI高。這一現(xiàn)象可能是由于大量琥珀酰基基團鏈狀結構的存在導致分子柔性略微降低，影響EAI和ESI，這與上述2.7節(jié)分子柔性的結果吻合。

圖9 SPI/SSPI的乳化活性和乳化穩(wěn)定性Fig. 9 EAI and ESI of SPI/SSPI

3 結 論

本研究探究琥珀?；{控SPI電荷密度對其構象和乳化性的影響，明確了?；鞍讟嬒笞兓腿榛愿纳浦g的關系。琥珀酸酐主要與SPI的氨基反應，SPI的琥珀?；饔脧谋砻嬷鸩桨l(fā)生到內部。隨著?；潭鹊脑黾樱琒PI的等電點向酸性移動，負電荷密度也明顯增加；改性SSPI結構展開，色氨酸殘基暴露，酪氨酸殘基被包裹，SSPI處于更加親水的環(huán)境中，SPI游離氨基與琥珀?；鶊F反應使得其中N—H鍵變?yōu)镃—N鍵，導致酰胺III帶改變；?；揎椊档土薙PI的表面疏水性，增加SPI的分子柔性，并且由于結構展開導致其乳化活性和乳化穩(wěn)定性都得到明顯改善。該研究結論為琥珀?；男栽诘鞍谆瘜W修飾方面的應用提供理論參考，并且拓寬了SPI在食品工業(yè)中作為乳化劑和功能活性物質載體的應用范圍。