綠原酸共價和非共價作用對黑豆蛋白納米乳穩(wěn)定性和抗氧化性的影響

金 花，江連洲，馮?，?，王菊兵，張曉松，許 晶,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

乳液運(yùn)載體系具有較好的穩(wěn)定性和運(yùn)載能力，是脂溶性生物活性物質(zhì)的重要載體，能夠有效改善親脂性物質(zhì)的水溶性、穩(wěn)定性和生物利用率，在食品、醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域都有很大的應(yīng)用前景和潛力[1-3]。乳液的性能通常與乳化劑的使用密切相關(guān)。乳化劑不僅能夠在油水界面處形成分隔層，穩(wěn)定乳液，更重要的是高抗氧化性的乳化劑還會有效防止被載活性物質(zhì)的氧化降解[4-5]。鑒于綠色、安全的特點(diǎn)，天然蛋白乳化劑近些年逐漸受到更多的關(guān)注。同時，探索可行方法來提高天然蛋白乳化能力和抗氧化性，進(jìn)而改善乳液運(yùn)載系統(tǒng)的穩(wěn)定性和抗氧化性，一直是研究的熱點(diǎn)方向[3-5]。

黑豆蛋白是一種兼具營養(yǎng)價值和乳化性能的食品級乳化劑。黑豆蛋白的氨基酸組成非常合理，必需氨基酸含量高，利于人體消化吸收。除此之外，蛋白質(zhì)親水、親油的兩親結(jié)構(gòu)，使黑豆蛋白能夠吸附在水油界面上，形成一層有韌性的乳化薄膜，表現(xiàn)出良好的乳化性能[6]。但是，近年來國內(nèi)外對黑豆蛋白的研究多集中在酶法改性和物理改性等方面[6-7]，對黑豆蛋白納米乳的研究相對較少。

雖然天然蛋白乳化劑能夠有效穩(wěn)定乳液，但是其抗氧化性通常較差，在提高乳液氧化穩(wěn)定性，抑制被載活性物質(zhì)的氧化降解等方面還有不足。綠原酸是一種天然的羥基肉桂酸類化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎、抗癌、抗高血壓和抗血脂等生理功效[8]。并且，綠原酸可以通過共價和非共價的方式，與蛋白質(zhì)相互作用形成具有抗氧化性的復(fù)合物，從而在提高乳化劑的乳化能力的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高乳化劑的抗氧化性[8-9]。Karefyllakis等[10]以非共價作用交聯(lián)向日葵蛋白和綠原酸，結(jié)果表明：向日葵蛋白-綠原酸復(fù)合物的界面張力較天然蛋白顯著降低，蛋白乳化性明顯提高。Jiang Jiang等[11]以綠原酸非共價修飾乳清蛋白和酪蛋白，發(fā)現(xiàn)在多酚的作用下，蛋白結(jié)構(gòu)展開，表面疏水性和溶解性顯著升高，起泡性也明顯增強(qiáng)。Chen Yichun[12]和Liu Fuguo[9]等研究均發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)與綠原酸共價結(jié)合后，多酚可作為H+供體終止自由基鏈反應(yīng)，從而改善蛋白-綠原酸共價復(fù)合物的抗氧化性。由此可見，以蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物為乳化劑構(gòu)建乳液運(yùn)載體系，應(yīng)該是提高乳液穩(wěn)定性和抗氧化性的可行途徑。

目前，有關(guān)多酚交聯(lián)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)影響的研究較為充分。如Sui Xiaonan等[13]研究了大豆蛋白與花青素之間的共價和非共價作用，發(fā)現(xiàn)花青素能夠改變大豆蛋白結(jié)構(gòu)，提高蛋白質(zhì)的乳化性和起泡性，并且共價作用更加穩(wěn)定，所制備的大豆蛋白-花青素共價復(fù)合物性質(zhì)更好。但是，現(xiàn)階段對比共價和非共價2種不同作用機(jī)制，進(jìn)而探討其乳液的基本特性和穩(wěn)定性的研究鮮見報(bào)道。因此，本研究以共價和非共價2種作用機(jī)制，采用綠原酸交聯(lián)黑豆蛋白制備黑豆蛋白-綠原酸共價和非共價復(fù)合物，研究不同作用機(jī)制下，多酚對蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響，尤其是乳化性和抗氧化性；分別以黑豆蛋白-綠原酸共價和非共價復(fù)合物為乳化劑，制備納米乳液，測定乳液的基本性質(zhì)，并探討綠原酸對乳液穩(wěn)定性的影響，旨在為開發(fā)高抗氧化性的食品級乳液運(yùn)載體系提供一定理論基礎(chǔ)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆 黑龍江省和糧農(nóng)業(yè)有限公司；綠原酸（98%） 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

XJA-100A型微型高速粉碎機(jī) 南京環(huán)科分析儀器有限公司；Z36HK高速離心機(jī) 德國Hermle 公司；T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Chirascan圓二色譜儀 英國Applied Photophysis公司；LS55熒光分光光度計(jì) 英國PerkinElmer Llantrisant公司；Malvern Nano-S90納米激光粒度儀、Zetasizer Nano Zeta電位分析儀 英國Malvern公司；FT200-SH數(shù)顯高速均質(zhì)分散機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑豆分離蛋白的提取

參考Jiang Lianzhou等[6]的方法。黑豆去皮后粉碎，過50 目篩得豆粉，正己烷混合脫脂。將脫脂黑豆粉與去離子水按質(zhì)量比1∶10混合分散，加1 mol/L的NaOH溶液，調(diào)節(jié)體系pH 8.5，攪拌1.5 h后，4 000 r/min離心15 min，取上清液加1 mol/L的HCl溶液，調(diào)節(jié)體系pH 4.5，靜置2 h，再次4 000 r/min離心20 min，取沉淀加去離子水溶解后，加1 mol/L的NaOH溶液，調(diào)節(jié)體系pH 7.0，得黑豆蛋白溶液，凍干后備用。以凱式定氮法測定黑豆蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（84.15±3.46）%。

1.3.2 黑豆蛋白-綠原酸共價和非共價化合物的制備

參考Ferraro[14]和Yang Chen[15]等的實(shí)驗(yàn)方法，先將黑豆蛋白和綠原酸分別充分溶解，然后將黑豆蛋白溶液和多酚溶液混合，控制黑豆蛋白質(zhì)量濃度為4 mg/mL，綠原酸含量分別為0、5、25、50、150、250 μmol/g（蛋白）。在pH 7.0（非共價作用）或pH 9.0（共價作用）條件下，持續(xù)攪拌2 h（非共價作用）或12 h（共價作用），期間滴加NaOH或HCl溶液保持體系pH值穩(wěn)定。以3 500 kDa的透析袋，用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.0）對產(chǎn)物透析48 h，去除剩余綠原酸。透析后溶液經(jīng)凍干后，得黑豆蛋白-綠原酸非共價復(fù)合物和黑豆蛋白-綠原酸共價復(fù)合物。

1.3.3 多酚結(jié)合率的測定

參考Gong Ying等[16]的實(shí)驗(yàn)方法，取0.5 mL一定濃度的樣品溶液，加入2.5 mL福林-酚試劑（0.2 mol/L）， 避光反應(yīng)5 min后，加入2 mL Na2CO3溶液（7.5 g/100 mL），繼續(xù)避光反應(yīng)2 h后，于波長760 nm處測定吸光度，繪制綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按式（1）計(jì)算多酚結(jié)合率：

1.3.4 熒光光譜測定

以280 nm為激發(fā)波長，取質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的樣品溶液，進(jìn)行熒光光譜掃描（300～525 nm）[17]。

1.3.5 圓二色光譜測定

蛋白樣品溶于pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中，蛋白質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL。在波長190～260 nm范圍內(nèi)測定圓二色光譜，掃描速率75 nm/min，分辨率0.1 nm。用“CDNN”軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算蛋白中各二級結(jié)構(gòu)的含量[18]。

1.3.6 乳化活性和乳化穩(wěn)定性測定

參考Pearce等[19]的方法，取1 mg/mL蛋白溶液以體積比3∶1與大豆油混合，10 000 r/min均質(zhì)2 min。分別在均質(zhì)后的第0分鐘和第10分鐘時，吸取40 μL底部液體，與5 mL十二烷基硫酸鈉溶液（1 mg/mL）振蕩混勻，于波長500 nm處測量吸光度，按式（2）、（3）計(jì)算乳化活性和乳化穩(wěn)定性：

式中：A0、A10分別為均質(zhì)后第0、10分鐘時乳液的吸光度；N為稀釋因子（125）；φ為油相的體積占比（0.25）；L為比色杯的厚度（1 cm）；c為蛋白質(zhì)量 濃度/（mg/mL）。

1.3.7 抗氧化性測定

1.3.7.1 ABTS陽離子自由基清除能力

根據(jù)Pellegrini等[20]的方法。配制2,2′-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽（2,2′-amino-di(3-ethylbenzothiazoline sulphonic acid-6)ammonium salt，ABTS）溶液（pH 7.0，ABTS 7 mmol/L，K2S2O82.45 mmol/L）。 稀釋此溶液至所需質(zhì)量濃度，取3 mL加入1 mg/mL的樣品溶液30 μL，避光反應(yīng)5 min后，測定波長734 nm處吸光度A，對照空白ABTS陽離子自由基溶液吸光度A0，按 式（4）計(jì)算ABTS陽離子自由基清除率：

1.3.7.2 DPPH自由基清除能力

根據(jù)Gong Ying等[21]的方法?；旌蠘悠啡芤海? mL，1 mg/mL）與1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）-乙醇溶液（4 mL 0.1 mmol/L）， 避光反應(yīng)30 min，測定波長517 nm處吸光度A，對比樣品乙醇溶液吸光度Ai和DPPH-乙醇溶液吸光度Aj，按 式（5）計(jì)算DPPH自由基清除率：

1.3.7.3 鐵離子還原能力

根據(jù)Yildirim等[22]的方法。充分混合樣品溶液（1 mL，1 mg/mL），K3[Fe(CN)6]溶液（2.5 mL，10 mg/mL） 和pH 6.6的磷酸鹽緩沖溶液（2.5 mL，0.2 mol/L），并于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min。然后，將體系冷卻至室溫，再加0.1 g/mL TCA溶液2.5 mL，混勻后5 000 r/min離心10 min。取2.5 mL上清液加同體積蒸餾水稀釋，與FeCl3溶液（0.5 mL，10 mg/mL）充分混合，反應(yīng)10 min后，測定波長700 nm處吸光度。

1.3.8 乳液的制備

按照體積比97∶3的比例混合水相（蛋白20 mg/mL）和油相（大豆油）。首先，利用高速均質(zhì)分散機(jī)10 000 r/min 分散4 min，制備粗乳液。然后，將直徑0.636 cm的鈦探針置于粗乳液中，繼續(xù)用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，超聲功率400 W超聲15 min，制得終乳液[23]。

1.3.9 乳液粒徑及Zeta電位測定

利用納米激光粒度儀和電位分析儀分別測定乳液的粒徑和Zeta電位。測定前需用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液稀釋樣品至適當(dāng)濃度，以避免多重光散射效應(yīng)。

1.3.10 界面蛋白含量測定

根據(jù)Chen Maoshen等[24]的方法。10 000 r/min離心乳液60 min，使乳液分層。吸取下層水相清液，經(jīng)0.45 μm水系過濾膜過濾后，用Lowry法測定蛋白濃度cf。然后，重復(fù)相同步驟測定起始蛋白乳化劑濃度c0，以及離心后上清液蛋白濃度cs，按式（6）計(jì)算界面蛋白（adsorbed protein at the interface，AP）含量：

1.3.11 乳液穩(wěn)定性測定

1.3.11.1 貯存穩(wěn)定性于4 ℃條件下冷藏貯存乳液30 d，每10 d測定乳液粒徑一次，以乳液粒徑為指標(biāo)分析其貯存穩(wěn)定性。

1.3.11.2 氧化穩(wěn)定性

于4 ℃條件下冷藏貯存乳液30 d，每10 d測定乳液脂質(zhì)過氧化值（peroxide value，POV）和硫代巴比妥酸與脂質(zhì)氧化次級產(chǎn)物反應(yīng)的硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值，以POV和TBARS值為指標(biāo)分析其氧化穩(wěn)定性。

根據(jù)Chaiyasit等[25]的方法，對樣品POV進(jìn)行測定。將0.2 ml乳液與1.5 mL異丙醇與異辛烷的混合溶液充分混合后，離心。再向0.2 mL上清液中加入2.8 mL甲醇和正丁醇混合溶液、15 μL 3.94 mol/L的NH4SCN溶液和15 μL Fe2+溶液，避光反應(yīng)20 min后，測定波長510 nm處吸光度。通過過氧化氫異丙苯標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品POV。

根據(jù)Mei Longyuan等[26]方法，對樣品TBARS值進(jìn)行測定?；旌? mL乳液樣品溶液與2 mL 三氯乙酸-硫代巴比妥酸-HCl和2,6-二叔丁基對甲酚的混合溶液，沸水浴反應(yīng)15 min后，冷卻至室溫。4 000 r/min離心10 min后，測定波長532 nm處上清液吸光度。利用丙二醛標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品TBARS值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3 次，以SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。使用Origin V8.1、PeakFit V4.12等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚結(jié)合率

利用福林-酚法[16]測定了黑豆蛋白與綠原酸的結(jié)合率，結(jié)果如圖1所示。隨著綠原酸含量的增加，黑豆蛋白與其結(jié)合率逐漸升高，當(dāng)綠原酸含量為150 μmol/g時，多酚結(jié)合率最大，分別為（57.95±1.10）%（非共價復(fù)合物）和（87.54±2.04）%（共價復(fù)合物）。之后，繼續(xù)提高綠原酸含量，復(fù)合物的多酚結(jié)合率不再升高，反而降低，這一現(xiàn)象主要與多酚結(jié)合率的計(jì)算方法有關(guān)。根據(jù)計(jì)算公式可知，多酚結(jié)合率等于復(fù)合物中結(jié)合的綠原酸與加入綠原酸總量的百分比。因此，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合的綠原酸趨于飽和的時候，綠原酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合會放緩，此時繼續(xù)添加綠原酸，就會使多酚結(jié)合率的數(shù)值降低。另外，由圖1結(jié)果還可以發(fā)現(xiàn)，共價交聯(lián)能夠獲得更高的多酚結(jié)合率。這主要是因?yàn)樵趬A性條件下（pH 9.0），綠原酸中的羥基易氧化成為醌，進(jìn)而與氨基酸殘基反應(yīng)形成穩(wěn)定的C—N和C—S共價鍵，最終形成穩(wěn)定的共價復(fù)合物[10]。而在中性條件下（pH 7.0），綠原酸中的酚羥基和苯環(huán)會與蛋白質(zhì)之間以疏水作用、氫鍵或范德華力等作用力結(jié)合，形成非共價復(fù)合物。但是非共價交聯(lián)屬于可逆作用力，其穩(wěn)定性較共價作用弱，所以通常蛋白-多酚非共價復(fù)合物的多酚結(jié)合率低于其共價復(fù)合物[17]。

圖1 黑豆蛋白-綠原酸非共價和共價復(fù)合物的多酚結(jié)合率Fig. 1 Polyphenol-binding capacity of BSPI-CA non-covalent and covalent conjugates

2.2 熒光光譜分析

由圖2可知，添加綠原酸后，蛋白質(zhì)的熒光峰強(qiáng)度降低，且綠原酸濃度越高，峰強(qiáng)降低越顯著。這一現(xiàn)象的發(fā)生主要是因?yàn)榘被釟埢c多酚作用后，多酚量子產(chǎn)率低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生熒光猝滅[27]。同時，加入綠原酸后，蛋白質(zhì)的熒光峰位還發(fā)生了紅移。這主要?dú)w因于綠原酸交聯(lián)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)伸展，發(fā)生解折疊，所以包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水氨基酸殘基暴露至極性環(huán)境中，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)改變。本結(jié)果與Jiang Jiang等[11]研究結(jié)果一致。另外，對比圖2a、b可知，共價作用所導(dǎo)致的峰強(qiáng)降低和紅移現(xiàn)象較非共價作用更加明顯。分析原因可能是共價結(jié)合中醌與氨基酸殘基間的作用更強(qiáng)、更穩(wěn)定，因此結(jié)合了更多的疏水氨基酸，實(shí)現(xiàn)了更高的多酚結(jié)合率，因而導(dǎo)致熒光光譜中更明顯的變化。

圖2 黑豆蛋白-綠原酸非共價和共價復(fù)合物的熒光光譜Fig. 2 Fluorescence spectra of BSPI-CA non-covalent and covalent conjugates

2.3 圓二色譜圖分析

由圖3可知，在波長190～260 nm范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)圓二色性發(fā)生改變，表明綠原酸復(fù)合會導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)變。對于黑豆蛋白-綠原酸非共價復(fù)合物，隨綠原酸含量增加，α-螺旋相對含量逐漸降低，無規(guī)卷曲相對含量逐漸升高（表1）。在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋結(jié)構(gòu)是肽鏈通過氫鍵穩(wěn)定的緊密螺旋結(jié)構(gòu)，由于全部肽鍵均可成氫鍵，α-螺旋結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定[28]。而α-螺旋相對含量的降低則表明蛋白質(zhì)中有序結(jié)構(gòu)遭到破壞，同時無規(guī)卷曲相對含量的增加，進(jìn)一步說明蛋白質(zhì)分子趨于松散和無序。Jia Jingjing等[29]研究表明綠原酸能夠降低β-乳球蛋白中的α-螺旋含量。Shen Fei等[30]也發(fā)現(xiàn)茶多酚的非共價作用會引起卵白蛋白中α-螺旋的減少和β-折疊的增加，從而形成結(jié)構(gòu)更加松散的蛋白質(zhì)。此外，共價交聯(lián)后黑豆蛋白結(jié)構(gòu)變化的趨勢與非共價基本一致，只是α-螺旋相對含量降低程度更加明顯。這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與綠原酸之間的共價作用較為穩(wěn)定，多酚結(jié)合率更高，因此對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響更為顯著。這一結(jié)果與Sui Xiaonan等[13]研究結(jié)果相似，該研究發(fā)現(xiàn)在大豆蛋白-花青素復(fù)合物的制備中，共價復(fù)合物的有序結(jié)構(gòu)降低明顯高于非共價復(fù)合物。

圖3 黑豆蛋白-綠原酸非共價和共價復(fù)合物的圓二色譜圖Fig. 3 CD spectra of BSPI-CA non-covalent and covalent conjugates

表1 黑豆蛋白-綠原酸非共價和共價復(fù)合物的二級結(jié)構(gòu)相對含量Table 1 Secondary structures of BSPI-CA non-covalent and covalent conjugates

2.4 乳化性分析

由表2可知，與綠原酸交聯(lián)后，所得復(fù)合物的乳化性有顯著提高，乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別升高至80.37 m2/g和27.07 min（非共價作用），以及89.82 m2/g和33.83 min（共價作用）。這主要是因?yàn)榫G原酸能夠顯著改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)趨于松散和無序，進(jìn)而達(dá)到更好的親水-疏水平衡，形成穩(wěn)定的界面乳化劑層，使黑豆蛋白-綠原酸復(fù)合物較天然黑豆蛋白表現(xiàn)出更優(yōu)秀的乳化性能[31-32]。Jia Zhenbao等[33]也在表沒食子兒茶素沒食子酸酯修飾乳清蛋白的研究中發(fā)現(xiàn)，多酚的交聯(lián)能夠改變蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu)，并增強(qiáng)蛋白的乳化性能。此外，黑豆蛋白-綠原酸共價復(fù)合物乳化性要高于非共價復(fù)合物，這與共價作用更強(qiáng)的穩(wěn)定性有關(guān)。從圓二色和熒光結(jié)果看（表1和圖2），共價作用對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響更大，且復(fù)合物具有更高的多酚結(jié)合率（圖1），因此共價復(fù)合物乳化能力的提升也更加明顯。

表2 黑豆蛋白-綠原酸非共價和共價復(fù)合物的乳化性Table 2 Emulsifying properties of BSPI-CA non-covalent and covalent conjugates

2.5 黑豆蛋白-綠原酸復(fù)合物的抗氧化性測定

由圖4可知，在添加綠原酸后，所得蛋白復(fù)合物的抗氧化性隨綠原酸含量增大而逐步提升（P＜0.05）。有研究表明酚類物質(zhì)能夠作為H+和電子供體，終止自由基鏈反應(yīng)，因此酚類物質(zhì)能夠有效增加蛋白質(zhì)的抗氧化能力[6,9]。此外，相較于非共價復(fù)合物，相同綠原酸含量下，共價復(fù)合物具有更高的多酚結(jié)合率，引入更多的酚羥基，因此有利于共價復(fù)合物發(fā)揮出更強(qiáng)的抗氧化作用。

圖4 黑豆蛋白-綠原酸非共價和共價復(fù)合物的抗氧化性Fig. 4 Antioxidant activity of BSPI-CA non-covalent and covalent conjugates

2.6 綠原酸對黑豆蛋白乳液性質(zhì)的影響

2.6.1 乳液基本性質(zhì)的測定

根據(jù)復(fù)合物乳化性測定的結(jié)果，綠原酸含量為150 μmol/g和250 μmol/g時，所得復(fù)合物的乳化性雖有升高，但已無顯著差別。因此，選擇150 μmol/g為綠原酸的最佳添加量，制備黑豆蛋白-綠原酸非共價和共價復(fù)合物，且將其作為乳化劑穩(wěn)定納米乳液，進(jìn)一步考察綠原酸交聯(lián)對乳液穩(wěn)定性和抗氧化性的影響。由表3可知，黑豆蛋白-綠原酸非共價和共價復(fù)合物穩(wěn)定的納米乳液具有更小的乳滴粒徑和更均勻的粒徑分布（多分散性指數(shù)＜0.2）。這說明綠原酸能夠提高黑豆蛋白的兩親能力，增強(qiáng)蛋白質(zhì)在油水界面的吸附[34]。這一結(jié)論也與界面蛋白含量的測定結(jié)果一致，隨界面蛋白含量的增加，乳液平均粒徑逐漸降低。Sabouri等[35]在研究兒茶素與酪蛋白的相互作用時也發(fā)現(xiàn)酚羥基可與蛋白質(zhì)中的羧基作用，改善蛋白質(zhì)的兩親性質(zhì)，從而降低蛋白質(zhì)界面張力，促進(jìn)蛋白質(zhì)在油水界面上的吸附。另一方面，綠原酸還能夠有效增加乳滴的表面電荷，使乳液Zeta電位的絕對值顯著升高（P＜0.05）。這有利于乳滴之間保持比較強(qiáng)的靜電排斥，獲得較小的平均粒徑。其中，穩(wěn)定的共價作用，可獲得更高的多酚結(jié)合率，使黑豆蛋白-綠原酸共價復(fù)合物具有更多的負(fù)電荷，形成平均粒徑最小的納米乳液。Sui Xiaonan等[13]也發(fā)現(xiàn)花青素能夠有效降低大豆蛋白乳液的粒徑，增加乳液的Zeta電位絕對值，并且共價作用的影響更為顯著，有利于高穩(wěn)定性乳液的制備。

表3 黑豆蛋白-綠原酸復(fù)合物乳液的平均粒徑、Zeta電位和 界面蛋白含量Table 3 Mean particle sizes, zeta-potentials and AP contents of BSPI-CA conjugate-stabilized nanoemulsions

2.6.2 乳液的貯存穩(wěn)定性

如圖5所示，天然黑豆蛋白乳液穩(wěn)定性較差，在第10天時，粒徑已經(jīng)顯著升高（P＜0.05），說明乳液已經(jīng)發(fā)生了絮凝和聚結(jié)。而黑豆蛋白-綠原酸非共價復(fù)合物穩(wěn)定的乳液次之，在第10天乳液粒徑雖然也增加，但升高程度較天然黑豆蛋白低。黑豆蛋白-綠原酸共價復(fù)合物乳液的穩(wěn)定性最好，在第20天才出現(xiàn)乳液粒徑增加。這是因?yàn)榫G原酸能夠降低乳液的平均粒徑，而較小粒徑的乳滴在布朗運(yùn)動中更能保持穩(wěn)定，對抗重力導(dǎo)致的沉降[3]。另外，更高的Zeta電位使乳液具有更強(qiáng)的靜電排斥，有效防止了乳滴之間的聚集，進(jìn)一步保持了乳液的穩(wěn)定[34]。所以，綜合粒徑和Zeta電位兩方面的原因，自身粒徑最小、Zeta電位最高的黑豆蛋白-綠原酸共價復(fù)合物納米乳表現(xiàn)出了最佳的貯存穩(wěn)定性。

圖5 黑豆蛋白-綠原酸復(fù)合物乳液在貯存期間的平均粒徑Fig. 5 Mean particle sizes of BSPI-CA conjugate-stabilized nanoemulsions during storage

2.6.3 乳液的氧化穩(wěn)定性

如圖6所示，黑豆蛋白納米乳的POV和TBARS值增長最快，油脂氧化迅速，乳液氧化穩(wěn)定性較差。而黑豆蛋白-綠原酸非共價復(fù)合物納乳液的POV和TBARS值整體較天然蛋白低，說明其具有一定抗氧化能力，但氧化穩(wěn)定性也不理想。相比，黑豆蛋白-綠原酸共價復(fù)合物乳液的氧化穩(wěn)定性改善最為明顯。Jacobsen等[4]研究表明乳液的氧化穩(wěn)定性與乳化劑的抗氧化性有關(guān)。這是因?yàn)橛椭趸子诎l(fā)生在油水界面處，綠原酸交聯(lián)提高了蛋白乳化劑的抗氧化性，乳化劑層有效阻擋了氧化劑與油脂的作用，抑制了油脂氧化[36]。同時，與可逆的非共價作用相比，穩(wěn)定的共價作用使黑豆蛋白-綠原酸共價復(fù)合物具有更高的抗氧化性，更強(qiáng)的油水界面吸附能力，有利于形成更加致密的乳化劑膜，使乳液氧化穩(wěn)定性的提升更加顯著。Fan Yuting等[2]也發(fā)現(xiàn)多酚交聯(lián)可以明顯降低乳清蛋白乳液的POV和TBARS值的增長速度，提高乳液的氧化穩(wěn)定性。

圖6 黑豆蛋白-綠原酸復(fù)合物乳液在貯存期間的POV（a）和 TBARS值（b）Fig. 6 POVs (a) and TBARS values (b) of BSPI-CA conjugatestabilized nanoemulsions during storage

3 結(jié) 論

由于多酚能夠在堿性條件下氧化成醌，與蛋白質(zhì)之間形成穩(wěn)定的共價作用，相較于可逆的非共價作用，黑豆蛋白-綠原酸共價復(fù)合物的多酚結(jié)合率明顯高于非共價復(fù)合物。并且共價作用對黑豆蛋白的結(jié)構(gòu)影響也更為顯著，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更為無序和松散。

綠原酸有效改善了蛋白質(zhì)的親疏水平衡，使蛋白質(zhì)的乳化性能提升，同時為蛋白質(zhì)引入了大量的酚羥基，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的抗氧化性。

較高的多酚結(jié)合率和更穩(wěn)定的結(jié)合都使得黑豆蛋白-綠原酸共價復(fù)合物的乳化性和抗氧化性更為優(yōu)越。所以，黑豆蛋白-綠原酸共價復(fù)合物所制備的納米乳平均粒徑最小，Zeta電位絕對值最大，界面蛋白含量最高，說明其在油水界面的吸附能力最強(qiáng)，具有較強(qiáng)的空間位阻排斥和靜電排斥，進(jìn)而使乳液表現(xiàn)出較高的貯存穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性。因此，綠原酸交聯(lián)是改善乳液載體穩(wěn)定性和抗氧化性的可行途徑。