利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定養(yǎng)殖魚中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物殘留量

趙丹

摘 要：目的：建立一種利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的方法，測定養(yǎng)殖魚中孔雀石綠（Malachite Green，MG）、結(jié)晶紫（Crystal Violet，CV）、隱色孔雀石綠（Leuco Malachite Green，LMG）及隱色結(jié)晶紫（Leuco Crystal Violet，LCV）殘留量，為了解轄區(qū)市售水產(chǎn)品中禁用獸藥殘留情況，為食品安全風險評估提供可靠依據(jù)。方法：本方法依據(jù)《2017年國家食品污染和有害因素風險監(jiān)測工作手冊》監(jiān)測方法，樣本經(jīng)乙腈提取，中性氧化鋁固相萃取小柱凈化，液相色譜分離后進入質(zhì)譜儀，以電噴霧正離子化模式（ESI+）和多反應(yīng)檢測（Multi Reaction Detection，MRM）掃描模式測定，同位素內(nèi)標法定量。結(jié)果：養(yǎng)殖魚中孔雀石綠（MG）、結(jié)晶紫（CV）及其代謝物共4種成分在0.25～10.00 ng/mL線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.998，檢出限均為0.5 μg/kg，在0.5～2.0 μg/kg加標回收率在83.8%～109.7%。對40份養(yǎng)殖魚（大菱鲆、烏鱧和鱖魚）進行檢測，其中2份隱色孔雀石綠（LMG）有檢出，檢出率為5%，其他成分無檢出。結(jié)論：該方法簡單快速、定量準確、靈敏度高，可用于養(yǎng)殖魚中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物殘留定量測定。

關(guān)鍵詞：養(yǎng)殖魚;孔雀石綠（MG）;結(jié)晶紫（CV）;液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）

Simultaneous Determination of Malachite Green， Crystal Violet and Their Metabolite Residues in Cultured Fish by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHAO Dan

（Xigang District Center for Disease Control and Prevention， Dalian 116014， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the simultaneous determination of malachite green （MG）， crystal violet （CV）， leuco malachite green （LMG） and leuco crystal violet （LCV） residues in cultured fish using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometer method. To understand the banned veterinary drug residues in aquatic products sold in the jurisdiction and provide a reliable basis for food safety risk assessment.Method： According to “2017 National Food Pollution and Harmful Factor Risk Monitoring Work Manual”，samples were extracted with acetonitrile， purified by neutral alumina solid phase extraction cartridge， separated by liquid chromatography， and then entered into the mass spectrometer，determined by electrospray positive ionization mode （ESI +） and multireaction detection （MRM） scanning mode， and isotope internal standard method Quantitative.Conclusion： The four components of malachite green （MG）， crystal violet （CV） and their metabolites in cultured fish have a good linear relationship within the concentration range of 0.25～10.00 ng/mL， the correlation coefficient r is greater than 0.998， and the detection limit is 0.5 μg/kg， the recovery rate of standard addition within 0.5～2.0 μg/kg is between 83.8%～109.7%.Forty cultured fish （turbiny turbot， black snakehead and mandarin fish） were tested， of which 2 leuco malachite green （LMG） were detected， with a detection rate of 5%， and no other ingredients were detected. Conclusion： The method is simple， fast， accurate and sensitive， and can be used for the quantitative determination of malachite green， crystal violet and their metabolite residues in cultured fish.

Keywords： cultured fish; malachite green （MG）; crystal violet （CV）; liquid chromatography-mass spectrometry （LC-MS）

孔雀石綠（Malachite Green，MG）又名苯胺綠，結(jié)晶紫（Crystal Violet，CV）又名甲紫，二者皆屬三苯甲烷類染料、殺菌殺蟲制劑。進入水生動物體后會快速代謝成脂溶性的隱色孔雀石綠（Leuco Malachite Green，LMG）及隱色結(jié)晶紫（Leuco Crystal Violet ，LCV），已證實二者及其代謝物皆有致癌、致畸、致突變毒副作用[1-2]，對人體有積蓄危害，目前已被多國列為禁用藥物[3-4]，也是我國重點打擊的禁用獸藥[1-4]。我國早在2002年就將孔雀石綠列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》[5]，禁止用于食品動物。然而結(jié)晶紫曾用于防治魚類霉鰓病，孔雀石綠針對魚體魚卵真菌水霉病有特效，也可治療其他多種細菌性疾病。在運輸過程中，魚販也常用孔雀石綠為鱗皮受損的魚延長生命，市面又尚無低廉有效的替代品，這是水產(chǎn)業(yè)養(yǎng)殖戶繼續(xù)違規(guī)使用孔雀石綠的根本原因，致使其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中多年屢禁不止。

目前常用來檢測孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物的方法主要有酶聯(lián)免疫法、分光光度法、高效液相色譜法、液-質(zhì)聯(lián)用法等，其中液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)靈敏度較高，應(yīng)用最為廣泛[2]。本實驗采用中性氧化鋁固相萃取結(jié)合液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)快速檢測養(yǎng)殖魚中孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱色孔雀石綠及隱色結(jié)晶紫殘留量，旨在為有效預防和控制禁用獸藥殘留帶來的潛在危害，提供有效檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 樣本來源

養(yǎng)殖魚（大菱鲆、烏鱧和鱖魚），樣本采集點覆蓋市內(nèi)4區(qū)（中山區(qū)、西崗區(qū)、沙河口區(qū)和甘井子區(qū)）多家商超、零售、集市和農(nóng)貿(mào)市場，樣本來源地主要集中在市內(nèi)4區(qū)及北三市。

1.1.2 儀器

LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司）;API 3200三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司，具有ESI+電離源）;XS205DV十萬分之一電子天平、ME104E/02萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）;Vortex genie2型渦旋振蕩器（美國Scientific Industries公司）;KQ-500DE型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;Z 32HK型高速離心機（德國HERMLE公司）;VACElut SPS 24固相萃取裝置（安捷倫科技有限公司）;DCY-24S氮吹儀（青島?？苾x器有限公司）;PURELAB Classic UVF純水儀（英國ELGA LABWATER公司）;微孔濾膜（13 mm 0.22 μm GHP，美國Waters公司）;中性氧化鋁固相萃取柱（6 mL/g，美國Waters公司）。

1.1.3 試劑及配制

甲酸（色譜純，濃度≥99.0%，北京迪科馬科技有限公司）;乙腈（色譜純，濃度≥99.9%）;乙酸銨（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）;孔雀石綠（純度95.8%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）;隱色孔雀石綠（純度99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）;結(jié)晶紫、隱色結(jié)晶紫（濃度100 μg/mL，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）;孔雀石綠D5（純度99.7%，德國WITEGA公司）;隱色孔雀石綠D6（純度99.8%，德國WITEGA公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液及同位素內(nèi)標溶液配制

分別準確稱取孔雀石綠（MG）、隱色孔雀石綠（LMG）、孔雀石綠D5（MG-D5）及隱色孔雀石綠D6（LMG-D6）標準物質(zhì)（10±0.1）mg，用少量乙腈溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中乙腈定容，配制成

1 000.0 μg/mL標準儲備液，于-18 ℃保存;結(jié)晶紫（CV）、隱色結(jié)晶紫（LCV）標準儲備液濃度為100 μg/mL。

用乙腈分別將4種標準儲備液及2種同位素內(nèi)標儲備液稀釋成10.0 μg/mL標準中間液，于4 ℃保存。分別取4種標準中間液各100 μL，用乙腈定容至

10 mL并混勻，制成混合標準工作液，4 ℃保存;再取500 μL孔雀石綠D5同位素內(nèi)標儲備液及100 μL隱色孔雀石綠D6同位素內(nèi)標儲備液，用乙腈定容至

10 mL并混勻，制成混合同位素內(nèi)標工作液，4 ℃保存。

1.2.2 標準曲線配制

取100 ng/mL混合標準工作液和混合同位素內(nèi)標工作液，用起始流動相溶液配制成0 ng/mL、

0.25 ng/mL、0.50 ng/mL、1.00 ng/mL、2.50 ng/mL、

5.00 ng/mL和10.00 ng/mL濃度系列，內(nèi)標含量孔雀石綠D5為5.00 ng/mL、隱色孔雀石綠D6為1.0 ng/mL。

1.2.3 流動相配制

準確稱取0.079 g乙酸銨，加水溶解并定容至200 mL容量瓶中，加入200 μL甲酸，混勻，超聲脫氣后使用。

1.2.4 樣本制備

取具有代表性的魚肉樣本可食部分約500 g，搗碎混勻裝入自封袋密封標記好，-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 樣本提取

稱取5 g（精確至0.1 g）均勻樣本于50 mL塑料離心管中，加50.0 μL混合同位素內(nèi)標工作液，加入

25 mL乙腈并渦旋振蕩混勻，8 000 r/min離心10 min，收集上清液于塑料離心管中待凈化。

1.2.6 樣本凈化

先用5 mL乙腈活化中性氧化鋁固相萃取小柱，再取5 mL離心上清液加入小柱并收集濾液，用

4 mL乙腈淋洗小柱并收集濾液，將上述混合濾液于50 ℃以下氮吹近干，用1 mL起始流動相溶解殘渣，過0.22 μm濾膜后收集于進樣瓶中，待上液質(zhì)聯(lián)用儀檢測。

1.2.7 樣本測定

（1）色譜條件。色譜柱為Agilent，ZORBAX SB-C18，2.1 mm×100 mm，3.5 μm;流動性及梯度：流動相A為乙腈，流動相B為5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液;柱溫：40 ℃，進樣量10 μL，液相色譜梯度洗脫程序見表1。

（2）質(zhì)譜條件。電離方式ESI+，監(jiān)測模式MRM，離子源溫度350 ℃，離子噴霧電壓5 500 V，各組分定性定量離子對及DP和CE值，見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)分析

使用AB SCIEX API 3200液-質(zhì)聯(lián)用儀專用數(shù)據(jù)處理軟件analyst software1.6處理檢測原始數(shù)據(jù)，利用Microsoft Excel 2010錄入并整理，WPS Office（11.1.0.10304）制作表格統(tǒng)計分析。

2.2 儀器條件優(yōu)化

先將各組分配制成500 ng/mL溶液，利用針泵進樣，找到母離子和子離子以確定MRM離子對，優(yōu)化各DP和CE值，見表2。確定最優(yōu)質(zhì)譜檢測條件后進一步優(yōu)化液相色譜分離條件，找到最優(yōu)分離梯度，見表1，并確定內(nèi)標添加量孔雀石綠D5為5.0 ng/mL、隱色孔雀石綠D6為1.0 ng/mL，進行測定。

2.3 標準曲線及檢出限

以各目標物測定濃度為橫坐標，目標物與對應(yīng)同位素內(nèi)標峰面積比為縱坐標，繪制各組分標準曲線，在0.25～10.00 ng/mL線性關(guān)系良好，r均大于0.998，檢出限均為0.5 μg/kg，線性回歸方程見表3。

2.4 回收率實驗

分別向空白樣本中添加混合標準工作液、混合同位素內(nèi)標工作液，按照1.2.5至1.2.7步驟處理并檢測。加標濃度為0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、2.0 μg/kg 3個水平，每濃度6份平行樣本，檢測結(jié)果見表4，4種成分回收率在83.8%～109.7%，相對標準偏差在3.1%～7.7%，滿足檢測要求。

2.5 樣本測定

利用本法對當年采集的40份養(yǎng)殖魚進行檢測，其中有1份大菱鲆及1份烏鱧LMG有檢出，檢出率為5%（2/40），其他成分均未檢出。

3 結(jié)論

本法利用乙腈提取，中性氧化鋁固相萃取結(jié)合液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，實現(xiàn)對養(yǎng)殖魚中孔雀石綠、結(jié)晶紫及其代謝物的快速定量檢測，方法前處理過程簡單，分析時間短、定量準確、靈敏度高，可滿足后續(xù)檢測的需要。

參考文獻

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[5]中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號[EB/OL].（2002-12-24）[2021-11-06].http：//www.moa.gov.cn/gk/tzgg_1/gg/201006/t20100606_1535491.htm.