棉屬AADD異源四倍體后代篩選及性狀鑒定

陳天，李昱櫻，楊亞杰，候林慧，常永春，榮二花，吳玉香

（山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，山西 晉中 030801）

棉屬（Gossypium）有52個種（變種），其中47個為二倍體棉種（2n=2x=26），5個為異源四倍體棉種（2n=4x=52）［1］。栽培種陸地棉（Gossypium hirsutum）和海島棉（G. barbadense）為異源四倍體，是世界上最重要的經(jīng)濟作物之一。陸地棉因其產(chǎn)量高而在世界范圍內(nèi)廣泛種植，海島棉以其優(yōu)良纖維品質而聞名，世界上90%以上的棉花纖維產(chǎn)量來自陸地棉和海島棉，其長期以來主導棉花產(chǎn)量和貿(mào)易［2-3］。

自然界異源四倍體棉種基因組是由2個亞基因組組成，它們被命名為A和D，是在大約100~200萬年前舊大陸A基因組祖先與新大陸D基因組祖先雜交然后染色體數(shù)目加倍形成。然而，關于棉屬異源四倍體棉種A組的真正起源歷史以及A組的分化程度還存在爭議，異源四倍體棉種的供體種也一直是棉屬進化研究的熱點。自然條件下由于A、D組棉種之間的生殖隔離，A組和D組棉種很難雜交成功。僅有的報道如亞洲棉×雷蒙德氏棉［4］、亞洲棉×瑟伯氏棉［5］、亞洲棉×戴維遜氏棉［6-7］、亞洲棉×異常棉［8］，以及本實驗室前期合成的草棉×雷蒙德氏棉［2］等。目前，普遍認為二倍體物種草棉和雷蒙德氏棉是異源四倍體棉的祖先，因為它們和異源四倍體在分子水平上高度相似［9-11］。

實驗室前期模擬自然界異源四倍體棉種形成過程，以A基因組的草棉作母本與D基因組的雷蒙德氏棉雜交獲得雜種，對雜種植株進行秋水仙堿多倍體誘變，最后得到結鈴的植株，目前已經(jīng)獲得了育性較為穩(wěn)定的人工異源四倍體［12］。本研究旨在探討伴隨著雜交加倍的多倍體物種形成后的形態(tài)學和細胞遺傳學變化規(guī)律，以及通過和陸地棉的SRAP分子標記比較，揭示人工選擇對進化趨勢的影響，為棉屬異源四倍體棉種起源進化提供確鑿證據(jù)，也為棉花種質創(chuàng)新提供新材料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗所用材料為前期遠緣雜交及加倍合成的人工異源四倍體，具體合成過程為：以紅星草棉為母本，野生雷蒙德氏棉為父本雜交獲得雜種，并經(jīng)形態(tài)學、細胞遺傳學和分子標記鑒定遠緣雜種為真雜種［2］，然后采用嫁接繁殖獲得大量雜種植株，對嫁接苗枝條進行秋水仙堿多倍體誘變，最后得到結鈴的植株，收獲種子S1，逐年種植并自交獲得可育的人工異源四倍體S2代和S3代。本試驗選用S2代和S3代植株以及親本草棉為材料，并采用自然界異源四倍體陸地棉TM-1作對照。研究材料基本信息見表1。由于育種工作的艱辛和樣本延續(xù)的實際困難，本研究中部分活體材料難以保存，存在父本部分數(shù)據(jù)缺失和其它樣本重復數(shù)不足的問題。

表1 研究材料基本信息Table 1 Basic information of research materials

1.2 試驗方法

1.2.1 人工異源四倍體的形態(tài)學鑒定

將親本和獲得的人工異源四倍體種子S2和S3同時在培養(yǎng)箱中育苗，出現(xiàn)2片真葉后移栽溫室，盆栽種植，盆栽間距0.5 m。對雜種植株進行長勢和形態(tài)性狀觀察，并和母本及陸地棉做比較，選取倒三葉至倒四葉且完全展開的葉片進行觀察并測量分析，從形態(tài)學角度鑒定比較人工異源四倍體和親本及陸地棉的差異，以及鑒定其本身的真實性。葉面積測量儀型號為YMJ-A。

1.2.2 流式細胞儀倍性檢測

對多倍體后代植株進行流式細胞倍性檢測，參照Dole?el［13］的方法按以下步驟進行操作：（1）從溫室取20 mg的新鮮嫩葉，洗凈放在塑料培養(yǎng)皿的中心，加入1 mL裂解液。（2）立即用一次性手術刀片將嫩葉切碎，混勻數(shù)次。（3）用42 μm微孔過濾膜將混合液過濾至樣品管中。（4）加入3倍濾液體積的DAPI染色液，冰上染色2 min。（5）將懸浮液引入流式細胞儀，對細胞核DNA相對熒光強度進行檢測。（6）根據(jù)公式計算待測樣品倍性，計算公式如下：

試驗所用流式細胞儀型號為Partec CyFlow Space。

1.2.3 人工異源四倍體的細胞遺傳學鑒定

（1）取材與固定：取新鮮長約2~4 mm幼蕾，剝?nèi)グ~，水洗后浸泡在卡諾氏固定液（無水乙醇∶氯仿∶冰乙酸=5∶3∶2）24 h，轉移至70%乙醇中于4 ℃保存?zhèn)溆谩＃?）制片：剝開固定好的花蕾，取4~5顆花藥置于載玻片上，滴加適量卡寶品紅染液，用解剖針輕擠壓花藥，使花粉母細胞逸出，去除可見雜質，蓋上蓋玻片，酒精燈微烤載玻片2 s，使內(nèi)容物染色效果顯著，最后將濾紙放在蓋玻片上用拇指微壓，吸走溢出染液。（3）鏡檢：將新制備的載玻片放置于顯微鏡下觀察，統(tǒng)計500個以上清晰的花粉母細胞減數(shù)分裂行為并拍照，統(tǒng)計500個以上清晰的花粉粒并拍照。

1.2.4 SRAP分子標記鑒定

（1）選取草雷人工異源四倍體及草棉、陸地棉新鮮嫩葉為材料，用CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒（貨號DL114-01，北京博邁德基因技術有限公司）提取DNA。（2）通過基于PCR的相關序列擴增多態(tài)性分子標記（Sequence-related am?plified polymorphism， SRAP）對提取的DNA樣品進行多態(tài)性分析。SRAP-PCR反應體系：總體積10 μL，包 含5 μL 2×Taq PCR MasterMix（含 染料），2 μL ddH2O，1 μL正向引物，1 μL反向引物，1μL模板DNA（50 ng·μL-1）。（3）SRAP-PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，35 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)；94 ℃變性45 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。（4）電泳：向凝膠瓶中加入40 mL 8%非變性聚丙烯酰胺工作液、200 μL 10%過硫酸銨溶液、80 μL四甲基乙二胺，搖勻后灌膠，200 V電壓下電泳100 min，隨后用0.1%染色液銀染30 min，顯影至出現(xiàn)清晰條帶后，置于顯影儀上人工讀帶。SRAP引物參考Li等［14］，序列信息見表2，由生物工程股份有限公司合成，試驗所用PCR擴增儀型號為蘭杰柯SCILOGEX梯度PCR擴增儀，電泳儀型號為北京君意JY300C型，顯影儀型號為北京六一WD-9406型。

表2 SRAP引物序列信息Table 2 Sequence information of SRAP primers

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本研究使用Microsoft Excel和SPSS軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，使用Origin 2019b軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 人工異源四倍體形態(tài)學鑒定

本研究對母本草棉和人工異源四倍體植株形態(tài)進行觀察比較（圖1）：母本草棉（圖1A）植株整體為塔狀，枝條緊湊，葉片多且密，葉色為深綠色。人工異源四倍體（圖1B）植株整體為倒塔狀，下部枝葉較少，多集中在植株中上部。

圖1 人工異源四倍體和母本草棉植株形態(tài)比較Fig.1 Plant morphology comparison between artificial allotetra?ploid and G. herbaceum

對母本草棉、父本雷蒙德氏棉和人工異源四倍體S1、S2的葉片形狀進行觀察比較（圖2）：母本草棉葉裂在3~5裂左右，差異較大，中間3個裂片相比其它的大。父本雷蒙德氏棉為心型葉，無葉裂。草雷異源四倍體S1和S2葉片趨近母本，葉裂在5裂左右，裂刻深且窄。此外，人工異源四倍體葉片出現(xiàn)葉脈皺縮現(xiàn)象。S1、S2的葉片和陸地棉TM-1相比：大小較陸地棉小，裂片數(shù)較陸地棉多且裂刻較深，顏色較陸地棉深。對P1、P2及四倍體植株葉面積、葉形指數(shù)進行統(tǒng)計，結果顯示人工異源四倍體與親本在葉面積、葉形指數(shù)均存在極顯著差異（表3），并且數(shù)值大小間于親本之間（圖3）。

圖2 不同世代人工異源四倍體和親本及陸地棉葉片形態(tài)比較Fig.2 Leaf morphology comparison between artificial allotetra?ploids of different generations， its parents and G. hirsutum TM-1

圖3 葉面積、葉形指數(shù)在人工異源四倍體及親本之間的變化趨勢Fig.3 Trends of leaf area， leaf index between artificial allotetra?ploids and its parents

表3 人工異源四倍體和親本葉片性狀的差異顯著性分析Table 3 Difference significance analysis of leaf traits between artificial allotetraploids and its parents

2.2 流式細胞倍性檢測結果

以陸地棉TM-1做參照，用流式細胞技術檢測人工異源四倍體植株的相對DNA含量，結果顯示（表4，圖4），TM-1的熒光峰值為215.94，所選4株S2-1、S2-2、S2-3、S2-4的 熒 光 峰 值 分 別 為246.43、232.39、195.52、232.21，所選1株S3熒光峰值為258.46。檢測結果表明，所選5株人工異源四倍體S2代和S3代植株的熒光峰值與陸地棉TM-1接近，均為異源四倍體。同時可以看到多倍體后代不同單株間熒光強度差異較大，可能是由于在人工合成新多倍體的過程中，染色體組發(fā)生了復雜的重組，期間可能發(fā)生片段的丟失等去冗余的情況。

圖4 不同世代人工異源四倍體流式細胞倍性檢測結果Fig.4 Flow cytometry results for ploidy level in artificial allotetraploids of different generations

表4 不同世代人工異源四倍體流式細胞倍性檢測結果Table 4 Flow cytometry results for ploidy level in artificial allotetraploids of different generations

2.3 人工異源四倍體細胞學鑒定

對陸地棉及親本的花粉母細胞減數(shù)分裂行為進行觀察，發(fā)現(xiàn)其減數(shù)第一次分裂和減數(shù)第二次分裂均正常，減數(shù)第二次分裂末期形成的四分體大小一致，分布均勻。對草雷人工異源四倍體S2和S3花粉母細胞減數(shù)分裂分別進行500次重復觀察并進行統(tǒng)計。結果顯示，S2和S3減數(shù)分裂都存在異常行為。主要表現(xiàn)在：在減數(shù)分裂末期既出現(xiàn)大小正常的單分體和二分體（圖5A、圖5B），也出現(xiàn)分裂不均等的四分體（圖5C），異常減數(shù)分裂行為可能是第1次減數(shù)分裂前期同源染色體聯(lián)會出現(xiàn)紊亂，多價體不均等分離造成；在四分體時期，會形成三分體到八分體等異常多分體（圖5E~圖5H），同時也會有正常四分體出現(xiàn)（圖5D）。對觀察結果進行統(tǒng)計（表5），S2正常四分體比例為23.4%，S3正常四分體比例為44.8%，高于S2，但遠低于陸地棉。正常四分體和異常四分體都有可能發(fā)育成花粉粒，在研究中觀察到了多種形態(tài)的花粉粒，如破裂的花粉粒（圖6A），橢圓形花粉粒（圖6B），發(fā)育不全的花粉粒（圖6C），正?；ǚ哿＃▓D6D）。對草雷人工異源四倍體S2和S3花粉粒形態(tài)分別進行500次重復觀察并進行統(tǒng)計（表6），結果顯示，S2正?；ǚ哿１壤秊?5.4%，S3正常花粉粒比例為64.4%，高于S2。統(tǒng)計結果進一步表明人工異源四倍體的育性在逐代恢復，但還需要繼續(xù)種植并自交進一步穩(wěn)定和提高其育性。

圖6 人工異源四倍體花粉粒形態(tài)Fig.6 Pollen grain morphology for artificial allotetraploid

表6 人工異源四倍體花粉粒形態(tài)數(shù)量及比例Table 6 Number and proportion of pollen grain morpholo?gy for artificial allotetraploid

圖5 人工異源四倍體花粉母細胞減數(shù)分裂行為Fig.5 Meiosis behavior of pollen mother cells for artificial allotetra?ploid

表5 人工異源四倍體減數(shù)分裂末Ⅱ多分體數(shù)量及比例Table 5 Number and proportion of polyad for artificial allotetraploid in telophase II of meiosis

2.4 SRAP分子標記鑒定

本研究對25對SRAP隨機引物進行篩選，選出13對多態(tài)性好的引物應用于本試驗。從擴增結果可知（表7），13對引物共擴增出106個清晰條帶，平均每對引物擴增出8.15個條帶，其中有57個多態(tài)性條帶，單對引物多態(tài)性條帶比例在22.22%~85.71%之間，平均每對引物多態(tài)性條帶比例為44.60%。在引物Me4-Em2中不僅擴增出相同的條帶，還擴增出特異性條帶（圖7左）；在Me2-Em5中除了擴增出S2、S3共有的特異性條帶，還擴增出S3獨有的特異性條帶（圖7右）。對多態(tài)性條帶進行分析（表8），人工異源四倍體有26個條帶與陸地棉具有一致性，18個條帶與母本草棉具有一致性，13個為特異性條帶，其遺傳比例分別為46%、31%、23%（圖8）。分析結果表明，人工異源四倍體與陸地棉染色體組均為AADD，其基因組具有高度同源性，但新形成的異源四倍體與陸地棉分子水平存在差異，這也間接證明人工選擇對陸地棉基因組進化產(chǎn)生的影響。下一步期望通過和陸地棉雜交，觀察分析其是否存在生殖隔離以及對其雜種后代進行性狀分析鑒定，進一步育成生產(chǎn)上有利用價值的新品種。

圖8 人工異源四倍體的SRAP多態(tài)性分布Fig.8 The resources of SRAP polymorphism for artificial allotetra?ploid

表8 草雷人工異源四倍體SRAP多態(tài)性分析Table 8 Analysis of SRAP polymorphisms for artificial al?lotetraploid

圖7 SRAP引物擴增結果Fig.7 The results of SRAP primes

表7 13對SRAP引物擴增結果Table 7 The results of 13 pairs of SRAP primer

3 討論

3.1 棉屬多倍體起源與進化

多倍體化普遍發(fā)生在植物的進化過程中，是形成新物種的重要途徑。棉花是研究植物多倍體化的一個重要類群［15］，最初以細胞學為基礎，通過分子系統(tǒng)學研究將二倍體棉種細分為A~G和K8個基因組［16］。大量證據(jù)表明，自然界5個四倍體棉花是異源多倍體，其中一個基因組類似于舊世界A基因組二倍體，另一個基因組類似于新世界的D基因組二倍體［17］。由于自然界異源四倍體的2個親本基因組存在于不同半球的二倍體物種中，因此異源多倍體棉花是如何以及何時形成的問題已經(jīng)引發(fā)了半個多世紀的討論。有研究表明A1組的草棉和A2組的亞洲棉都可能是異源四倍體棉種A基因組的祖先供體種。Stephens等［18］最早采用遺傳學和形態(tài)學證據(jù)表明A2是現(xiàn)存異源四倍體棉種的供體種；但Gerstel等［19］通過細胞遺傳學研究堅持認為A1比A2更接近異源四倍體的供體種。吳玉香等［20］對草棉×雷蒙德氏棉、草棉×瑟伯氏棉、亞洲棉×雷蒙德氏棉、亞洲棉×瑟伯氏棉四個雜交組合分析發(fā)現(xiàn)，D組雷蒙德氏棉與A1、A2雜交都能成功產(chǎn)生雜種后代，驗證了雷蒙德氏棉作為D基因組供體種。A和D兩個基因組在棉屬進化的早期大約700~1100萬年前曾各自經(jīng)歷了單獨進化，約100~200萬年前發(fā)生了舊世界棉種A染色體組供體種和新世界D染色體組供體種的雜交，隨后經(jīng)歷了雜種染色體加倍形成了異源四倍體，接著新形成的異源四倍體經(jīng)歷了上千年亞基因組的不對稱選擇和進化［21］。最近幾年，一批人工合成的棉花多倍體已經(jīng)報道出來。Liu等［22］以A組草棉和G組澳洲棉為親本雜交再加倍獲得異源多倍體植株（基因組AAGG）；申狀狀等［23］對栽培種陸地棉和野生種斯特提棉的雜種后代及多倍體后代（基因組AADDCC）進行陸地棉有參轉錄組測序，分析了三倍體雜種植株及異源六倍體植株與兩親本的基因表達水平；楊亞杰等［24］對草棉進行染色體加倍，經(jīng)流式細胞倍性檢測和細胞學鑒定，獲得了草棉三倍體和同源四倍體植株，并成功收獲多倍體種子。本研究獲得的草雷人工異源四倍體基因組為AADD，與陸地棉基因組一致，為棉屬遠緣雜交種質創(chuàng)新及基因組進化提供了新思路。

3.2 新合成人工異源四倍體的應用前景

棉屬種間雜種后代遺傳變異非常豐富，通過人工遠緣雜交使得培育出具有野生種質資源優(yōu)勢的可栽培棉種成為可能。聶以春等［25］成功將亞洲棉和司篤克氏棉雜交及加倍獲得異源四倍體雜種（基因組A2A2E1E1），經(jīng)過十二代自交培育出結鈴率高、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的新棉花種質資源。本研究以草棉為母本，雷蒙德氏棉為父本進行遠緣雜交，得到AD遠緣雜種和人工異源四倍體AADD，并從形態(tài)學和分子水平進行了雜種鑒定，分子水平表明雜種中既有父母本的條帶又存在新條帶，說明親本染色體進行了遺傳重組［2］。人工異源四倍體基因組和陸地棉一致，流式細胞結果顯示，所選多倍體植株熒光峰值與陸地棉接近，均為異源四倍體。分子鑒定結果顯示：在多態(tài)性條帶中，異源四倍體植株有26個條帶與陸地棉具有一致性，細胞學鑒定結果顯示：S3代比S2代有較高的育性，表明人工異源四倍體植株育性在逐代恢復。由于草棉與雷蒙德氏棉親緣關系遠，雜種一代在減數(shù)分裂時，染色體無法正常配對［2］，在對其進行秋水仙堿加倍處理后，可配對的同源染色體增多，育性有所恢復，但還需要繼續(xù)對其進行性狀觀察，并進一步恢復其育性，未來期望通過和陸地棉雜交，觀察分析其是否存在生殖隔離以及對其雜種后代進行性狀分析鑒定，進一步育成生產(chǎn)上有利用價值的新品種。下一步也將對所獲得的AD遠緣雜種、人工合成的異源四倍體棉種及其參考物種陸地棉進行表觀遺傳研究，進一步闡明親本基因組在雜種中的互作機理和表達模式，探討伴隨著雜交加倍后基因的表達變化和基因組進化趨勢，為棉屬異源四倍體棉種形成和起源進化及其基因表達調(diào)控提供最直觀的分子遺傳解析。

4 結論

本研究通過遠緣雜交和加倍合成人工異源四倍體，并對其進行一系列鑒定分析。形態(tài)學鑒定結果表明人工異源四倍體性狀間于2親本之間，流式細胞檢測結果表明其為異源四倍體，花粉母細胞減數(shù)分裂觀察結果表明異源四倍體的育性在逐代恢復，SRAP分子標記結果表明人工異源四倍體出現(xiàn)了新條帶，并且與陸地棉基因組具有同源性，本研究為探討自然界棉屬異源四倍體起源與進化提供了新思路，也為棉屬種質創(chuàng)新提供了新材料。