腦膠質(zhì)瘤液體活檢技術(shù)研發(fā)和臨床應(yīng)用

亓彥華 薛皓 李剛

腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，尤其是惡性程度最高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)，復(fù)發(fā)率和病死率極高，其中位生存期約14個(gè)月，是青壯年首位腫瘤死因，被稱(chēng)為“新癌王”[1]。絕大部分腦膠質(zhì)瘤早期不易發(fā)現(xiàn)，往往在出現(xiàn)癥狀之后才能確診。傳統(tǒng)的診斷技術(shù)包括顱腦影像學(xué)檢查和病變組織活檢，但兩者均有一定的局限性。液體活檢(liquid biopsy)方便、快捷、非侵入性、可多次取樣，更符合當(dāng)下腫瘤精準(zhǔn)診療的趨勢(shì)。因此，研究適合腦膠質(zhì)瘤的早期液體活檢策略，篩選腦膠質(zhì)瘤特異性液體活檢腫瘤標(biāo)志物，尤其是早期診斷和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)的標(biāo)志物，是實(shí)現(xiàn)其精準(zhǔn)診療的重要手段。

一、腦膠質(zhì)瘤傳統(tǒng)檢查方法的局限性

顱腦影像學(xué)檢查主要包括磁共振技術(shù) (MRI) 、磁共振波譜分析 (MRS) 、SPET-CT、PET-CT等，在腦膠質(zhì)瘤診斷和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)中發(fā)揮了重要作用，但對(duì)于影像學(xué)表現(xiàn)不典型或早期的腦膠質(zhì)瘤病人診斷特異性較差。有研究表明，腫瘤細(xì)胞大小一般在10 μm數(shù)量級(jí)上，而MRI空間分辨率只能達(dá)到2～3 mm，因此，當(dāng)MRI檢測(cè)到腫瘤時(shí)，腫瘤細(xì)胞已經(jīng)經(jīng)歷了二十多輪指數(shù)增長(zhǎng)，這使得一些微小的腫瘤原發(fā)灶和復(fù)發(fā)灶難以被及時(shí)發(fā)現(xiàn)，最終錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)[2-3]。此外，腦膠質(zhì)瘤在治療過(guò)程中，放、化療會(huì)破壞血腦屏障，導(dǎo)致MRI掃描的對(duì)比度增加，被稱(chēng)為假性進(jìn)展；相反，一些抗血管生成藥物的使用會(huì)導(dǎo)致MRI掃描的對(duì)比度降低，被稱(chēng)為假性消退，這兩者僅僅通過(guò)影像學(xué)檢查都難以鑒別區(qū)分，可影響診斷的準(zhǔn)確性，從而導(dǎo)致病人進(jìn)行不必要的重復(fù)手術(shù)[4]。

病變組織活檢是目前腦膠質(zhì)瘤診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。病變活檢是一種侵入性檢查手段，有穿刺后出血、癲癇發(fā)作、腫瘤轉(zhuǎn)移等風(fēng)險(xiǎn)，不適合反復(fù)多次檢查；此外，由于腦膠質(zhì)瘤存在異質(zhì)性，不同部位的腫瘤性質(zhì)往往有一定區(qū)別，導(dǎo)致取出的少量組織不能完全反映腫瘤整體情況，診斷有一定偏差[5]。另外，對(duì)于腦干、丘腦等重要部位的腫瘤，組織獲取風(fēng)險(xiǎn)高，操作難度大，也不利于檢查的進(jìn)行。液體活檢作為一種新興的檢查手段，具有方便、非侵入性、可反復(fù)取樣、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn)，可以有效彌補(bǔ)這些傳統(tǒng)檢查手段的短板，雖然目前研究還不夠成熟和深入，但值得進(jìn)一步探索。

二、液體活檢在腦膠質(zhì)瘤中的應(yīng)用

液體活檢是對(duì)影像學(xué)難以判斷的腦膠質(zhì)瘤的一種輔助診斷方法，可以避免穿刺活檢的風(fēng)險(xiǎn)并提高病變的早期確診率。腦膠質(zhì)瘤可以釋放各種分子來(lái)調(diào)控細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)及代謝催化途徑，這些分子可以通過(guò)循環(huán)到達(dá)體液，可以作為液體活檢的標(biāo)志物被分離和檢測(cè)出來(lái)，用于腦膠質(zhì)瘤的早期診斷和預(yù)后評(píng)估[6]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating Ttumor cell，CTC)、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ct-DNA)和蛋白質(zhì)被認(rèn)為是腦膠質(zhì)瘤早期診斷和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的標(biāo)志物，CTC是指從實(shí)體腫瘤脫落進(jìn)入外周循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞，它保留了來(lái)自原發(fā)腫瘤的特定分子特征，可以用于對(duì)原發(fā)腫瘤進(jìn)行臨床診斷，但目前針對(duì)腦膠質(zhì)瘤CTC研究不多，樣本量也少，并且每個(gè)研究分離CTC的方法不同，使得研究結(jié)果不具有可比性。此外，CTC在腦膠質(zhì)瘤病人體液中的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常細(xì)胞，10 ml血液中只能發(fā)現(xiàn)一個(gè)或幾個(gè)腫瘤細(xì)胞，而且純度較低，難以反映整個(gè)腦膠質(zhì)瘤的真實(shí)情況[7]。因此，只有開(kāi)發(fā)具有更高靈敏度的CTC檢測(cè)手段才有可能應(yīng)用于臨床[8]。ct-DNA是一種存在于血漿、腦脊液等體液中的細(xì)胞外DNA，主要來(lái)自于壞死或凋亡的腫瘤細(xì)胞及循環(huán)腫瘤細(xì)胞。血漿 ct-DNA 的液體活檢已在許多實(shí)體腫瘤中進(jìn)行了廣泛研究，可以用于腫瘤負(fù)荷和突變的跟蹤檢測(cè)[9-10]；由于血腦屏障的存在，腦膠質(zhì)瘤ct-DNA在血液中含量極低，只在少數(shù)病人中可檢測(cè)到。因此，腦脊液成為腦膠質(zhì)瘤ct-DNA分離提取的最佳來(lái)源，但目前針對(duì)腦脊液ct-DNA的檢測(cè)仍存在許多問(wèn)題。有研究表明，低級(jí)別腦膠質(zhì)瘤(lower grade glioma，LGG)生長(zhǎng)速度緩慢，只有少數(shù)LGG釋放到腦脊液中的ct-DNA可以被檢測(cè)到；位于腦實(shí)質(zhì)中的膠質(zhì)瘤不與腦脊液相鄰，它們的ct-DNA檢測(cè)率也很低[7,11]。此外，ct-DNA 在分析前和分析階段對(duì)環(huán)境的要求也非?？量蹋沟脵z測(cè)的穩(wěn)定性難以保證，導(dǎo)致臨床應(yīng)用遇到諸多困難。

近年來(lái)，外泌體引起了越來(lái)越多的關(guān)注，已成為腫瘤液體活檢的重要選擇。外泌體是直徑為30～150 nm的細(xì)胞外囊泡，包含核酸(DNA，RNA，microRNA等)、蛋白質(zhì)(膜受體、配體、細(xì)胞因子等)、脂質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物，參與腫瘤細(xì)胞間的信息傳遞及免疫微環(huán)境的形成[11-12]。研究證實(shí)，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌的外泌體可以調(diào)節(jié)其他腫瘤細(xì)胞和正常組織細(xì)胞(星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、T細(xì)胞等)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲遷移，誘導(dǎo)血管生成，調(diào)節(jié)代謝活動(dòng)，引起免疫抑制，影響藥物耐受[13-14]。由于外泌體來(lái)自整個(gè)腫瘤組織細(xì)胞，所以可以包含更加豐富的信息，反映腫瘤整體狀況，更加準(zhǔn)確地對(duì)腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行診斷及預(yù)后評(píng)估。與游離的核酸及蛋白質(zhì)相比，外泌體包裹的生物大分子可以避免體液中循環(huán)的核酸酶及蛋白酶的降解，因此，針對(duì)外泌體進(jìn)行檢測(cè)，穩(wěn)定性和敏感度要優(yōu)于CTCs和ct-DNA等[15-16]?；谝陨咸攸c(diǎn)，外泌體有可能成為腦膠質(zhì)瘤液體活檢的首要選擇，針對(duì)腦膠質(zhì)瘤異質(zhì)性和突變性強(qiáng)的特點(diǎn)為病人提供個(gè)體化的診療方案。

三、腦脊液中膠質(zhì)瘤相關(guān)外泌體在液體活檢中的應(yīng)用

血液和腦脊液是提取膠質(zhì)瘤外泌體的兩個(gè)最主要來(lái)源，腦膠質(zhì)瘤外泌體具有穿透血腦屏障的能力，可以在外周血中被檢測(cè)到。幾乎所有器官的外泌體都可以進(jìn)入血液，致使血液中的外泌體成分極為復(fù)雜[17]，使得血液中膠質(zhì)瘤外泌體的分離和純化難度很大，導(dǎo)致提取的外泌體成分不純，診斷的準(zhǔn)確性大大降低。腦脊液是一個(gè)相對(duì)封閉的環(huán)境，可以通過(guò)血腦屏障阻擋其它來(lái)源的外泌體，減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)之外的干擾，大大提高了膠質(zhì)瘤外泌體的純度，增加了診斷的準(zhǔn)確性。在臨床中，主要是通過(guò)腰椎穿刺術(shù)獲取腦脊液，這雖是一種有創(chuàng)性的檢查方式，即將穿刺針插入椎管的蛛網(wǎng)膜下腔來(lái)獲取樣本，這會(huì)給病人造成疼痛并伴有感染風(fēng)險(xiǎn)，但仍被認(rèn)為是一種相對(duì)安全的操作。腦脊液目前被認(rèn)為是腦膠質(zhì)瘤液體活檢的首要選擇。

膠質(zhì)瘤腦脊液外泌體液體活檢在臨床上主要用于檢測(cè)一些特定分子的變化，包括EGFRvⅢ、IDH1突變蛋白或miRNA。有研究表明，在對(duì)71例GBM病人的多中心研究中，檢測(cè)腦脊液外泌體中EGFRvⅢ的特異性高達(dá)98%，但敏感性較低，小于61%[18]。IDH1的突變轉(zhuǎn)錄本也可以在膠質(zhì)瘤病人的腦脊液外泌體中被檢測(cè)到，敏感度為62.5%，特異度高達(dá)100%，但在血清外泌體中未檢測(cè)到[19]。miRNA是一類(lèi)小非編碼RNA，可以在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[20]。越來(lái)越多的研究證明，膠質(zhì)瘤病人的腦脊液外泌體中存在上調(diào)或下調(diào)的miRNA，這些miRNA可以作為生物標(biāo)志物用于診斷。miR-21已經(jīng)被證明可以作為GBM的候選診斷標(biāo)志物，GBM病人腦脊液分離的外泌體中miR-21的水平是正常對(duì)照組的10倍，且術(shù)后腦脊液外泌體中miR-21的含量明顯下降[21]。多個(gè)miRNA的臨床預(yù)測(cè)模型可提高診斷的敏感性和特異性。外泌體miR-21可以區(qū)分腦膠質(zhì)瘤病人和健康對(duì)照，但是不能區(qū)分高級(jí)別膠質(zhì)瘤和腦轉(zhuǎn)移瘤，當(dāng)結(jié)合miR-21、miR-222和miR-124-3p進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以進(jìn)行兩者的區(qū)別診斷[22]。

我們團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)59例腦膠質(zhì)瘤病人腫瘤組織樣本及其腦脊液外泌體進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析了液體活檢中所有的RNA分子，包括miRNA、mRNA、lncRNA和circRNA，證實(shí)只有miRNA可以作為液體活檢的檢測(cè)標(biāo)志物。已有關(guān)于腦膠質(zhì)瘤調(diào)控外泌體miRNA外排機(jī)制的相關(guān)報(bào)道。研究認(rèn)為，外泌體可作為腫瘤促進(jìn)分子的載體將促癌的miRNA傳遞給其他的腫瘤細(xì)胞和免疫微環(huán)境中的免疫細(xì)胞，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展[23-25]。近期，我們課題組研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)瘤可以通過(guò)將抑癌miRNA分選到外泌體內(nèi)，排出腫瘤細(xì)胞起到促癌的作用；并可通過(guò)將這些抑癌miRNA利用外泌體靶向運(yùn)載至腫瘤微環(huán)境中的抑制性髓系免疫細(xì)胞(腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞TAMs或髓系抑制細(xì)胞MDSCs)，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤免疫微環(huán)境惡化的作用，起到雙重促腫瘤作用，我們團(tuán)隊(duì)在國(guó)內(nèi)外首次提出這一理論，相關(guān)研究成果已在國(guó)際權(quán)威雜志上進(jìn)行發(fā)表[26-27]。

基于此測(cè)序結(jié)果我們建成了首個(gè)多中心腦膠質(zhì)瘤全組學(xué)液體活檢大數(shù)據(jù)隊(duì)列(臨床注冊(cè)研究ChiCTR2000032547)及液體活檢在線數(shù)據(jù)庫(kù)BrainLiquid和腦膠質(zhì)瘤腦脊液外泌體數(shù)據(jù)庫(kù)CEGA(China Exo-glioma Genomics Atlas)，并配套完成了類(lèi)器官標(biāo)本庫(kù)的構(gòu)建工作，數(shù)據(jù)庫(kù)做到了“全病程、全標(biāo)本、全組學(xué)”覆蓋。在前期的小規(guī)模隊(duì)列研究中，我們發(fā)現(xiàn)基于腦脊液外泌體miRNA的GBM復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)策略，不僅能夠顯著提高早期復(fù)發(fā)病灶的檢出率，還能將傳統(tǒng)影像學(xué)診斷復(fù)發(fā)的時(shí)間窗提前約6個(gè)月。為了進(jìn)一步提高腦脊液外泌體miRNA檢測(cè)的便捷性，我們又聯(lián)合交叉學(xué)科團(tuán)隊(duì)研發(fā)了基因床旁快速診斷設(shè)備，通過(guò)微流控芯片實(shí)現(xiàn)外泌體腫瘤分子標(biāo)志物檢測(cè)，開(kāi)展并完善基于腦脊液外泌體 miRNA 的腦膠質(zhì)瘤液體活檢床旁技術(shù)。

四、問(wèn)題與展望

液體活檢是早期篩查和診斷腦膠質(zhì)瘤的有效手段，在病人個(gè)體化診療、療效評(píng)估及復(fù)發(fā)檢測(cè)等方面具有指導(dǎo)意義。外泌體作為一種可靠的標(biāo)志物可以在腦脊液和血液中被檢測(cè)到，其包裹的各種分子可以更加全面地反映膠質(zhì)瘤的整體情況，提高了腦膠質(zhì)瘤診斷的準(zhǔn)確性；雖然膠質(zhì)瘤外泌體作為液體活檢的重要標(biāo)志物具有很大的潛力，但目前仍面臨諸多的挑戰(zhàn)與困難。由腦脊液提取外泌體可以避免其他來(lái)源外泌體的干擾，但腰椎穿刺術(shù)仍是一種有創(chuàng)性檢查手段，不利于反復(fù)多次進(jìn)行；從血液中純化外泌體對(duì)病人傷害小，風(fēng)險(xiǎn)低，操作簡(jiǎn)便，是理想的液體活檢采樣途徑。因此，研發(fā)更加優(yōu)化的外泌體分離提取及檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)血液中的外泌體來(lái)診斷膠質(zhì)瘤，是未來(lái)需要解決的重要課題。目前，雖然對(duì)膠質(zhì)瘤外泌體研究很多，但仍缺少可以明確用于膠質(zhì)瘤診斷的分子。

總之，在當(dāng)今腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療的時(shí)代背景之下，以腦膠質(zhì)瘤外泌體為靶標(biāo)的液體活檢可以有效彌補(bǔ)傳統(tǒng)檢查手段的缺點(diǎn)，使得操作更加簡(jiǎn)便、結(jié)果更加準(zhǔn)確、成本更加低廉，有助于對(duì)病人進(jìn)行個(gè)體化精準(zhǔn)診療。