共軛亞油酸生理功能及微生物合成調(diào)控研究進(jìn)展

劉 雷， 竇 慧， 王光強(qiáng)， 艾連中， 劉欣欣

上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海 200093

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是含有共軛雙鍵的十八碳二烯酸的總稱[1],是人體無法合成，必須從外界食物中獲取但又必不可少的脂肪酸之一。研究表明，CLA 具有增強(qiáng)人體抗氧化能力和免疫能力的作用，并且在調(diào)節(jié)血液膽固醇和甘油三酸脂水平、防止動(dòng)脈粥樣硬化、促進(jìn)脂肪氧化分解等方面具有調(diào)節(jié)作用[2,3]。

CLA主要存在于反芻動(dòng)物肉制品和乳制品中，在反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)通過異構(gòu)化和生物脫氫反應(yīng)形成[4]，但普遍存在含量較低，無法滿足人體需求的問題。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，CLA可通過化學(xué)合成和生物合成等方法獲得?；瘜W(xué)合成利用含有亞油酸(linoleic acid，LA)的油脂作物為原料，通過異構(gòu)化高效合成CLA[5]，卻存在成本高、步驟繁瑣、分離提純困難等問題。較化學(xué)合成相比，通過微生物合成CLA具有更大的潛力[6]，微生物合成采用的菌株多為益生菌株，本身對(duì)人體無害；且具有選擇性合成生物活性CLA的優(yōu)點(diǎn),有利于產(chǎn)品的純化及后續(xù)研究。

目前文獻(xiàn)集中報(bào)道了CLA高產(chǎn)菌株的篩選，并對(duì)合成機(jī)制進(jìn)行解析，如植物乳桿菌和痤瘡丙酸桿菌的CLA合成機(jī)制[7]，為進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。但是不同菌株的CLA合成效率、合成途徑都存在差異，且合成產(chǎn)物的構(gòu)型會(huì)受到許多因素的影響，另外關(guān)于CLA合成過程的調(diào)控機(jī)制研究較少。因此本文綜述了CLA的多種生理功能和合成方式，闡述能夠合成CLA的菌株以及乳酸菌中CLA合成機(jī)制，并對(duì)提高CLA產(chǎn)量的方法以及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探討。為以后對(duì)CLA合成調(diào)控機(jī)制的研究提供借鑒。

1 共軛亞油酸的生理功能

CLA因具有減肥降脂、抗癌、抗炎和和代謝調(diào)節(jié)等作用而備受關(guān)注(圖1)，在發(fā)酵食品應(yīng)用領(lǐng)域顯示巨大潛力，可應(yīng)用于飼料和保健品等行業(yè)，能夠有效提高食品的營養(yǎng)價(jià)值。

圖1 CLA生理功能

1.1 減肥降脂

CLA進(jìn)入機(jī)體后能夠增加體能消耗，因此在體重控制方面可以有效降低體內(nèi)脂肪沉積。通過服用c9，t11-CLA和t10，c12-CLA能夠有效降低甘油三酯水平[8]，進(jìn)一步研究表明以t10,c12-CLA處理原代脂肪細(xì)胞時(shí)，甘油三酯、游離脂肪酸、神經(jīng)酰胺、膽固醇酯、磷脂的從頭合成被抑制，細(xì)胞總脂質(zhì)含量降低，說明對(duì)于降低脂肪積累作用的CLA異構(gòu)體主要是t10,c12-CLA[9]。通過對(duì)代謝途徑的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF21(成纖維細(xì)胞生長因子21)在脂質(zhì)代謝、胰島素敏感性以及肥胖問題等方面發(fā)揮重要作用，而FGF21受到PPAR-α(過氧化物酶增殖激活受體-α)的調(diào)控。t10,c12-CLA作為PPAR-α的一種高親和性配體和催化劑，能夠間接誘導(dǎo)肝FGF21的表達(dá)，從而減少脂質(zhì)積累，這說明t10,c12-CLA可以通過調(diào)節(jié)PPAR-α來間接調(diào)控FGF21從而控制脂質(zhì)代謝[10]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，使用能夠產(chǎn)生高濃度t10,c12-CLA的羅伊氏乳桿菌HI120治療C57BL/6型肥胖小鼠，結(jié)果顯示小鼠的飲食、體重和血清甘油三酯水平無明顯變化，但是血清膽固醇水平明顯降低[11]。與熱量限制(CR)減輕體重的機(jī)制相比，奇怪的是t10，c12-CLA能夠?qū)崿F(xiàn)減脂的同時(shí)也會(huì)使小鼠的血糖升高[12]。可以肯定的是，t10，c12-CLA的喂食可通過操縱腸道菌群來預(yù)防與肥胖相關(guān)的代謝紊亂，對(duì)腸道菌群有著正調(diào)節(jié)作用[13]。

t10，c12-CLA能夠不同程度的影響脂質(zhì)水平，在控制體重、降低體脂率方面存在潛力。因此，一些能夠合成CLA的菌株可作為潛在的益生菌制劑，通過口服將食物來源的LA在腸道中轉(zhuǎn)化為CLA，從而有助于預(yù)防和治療肥胖癥和高脂血癥。

1.2 抗癌抗炎

1.2.1抗癌作用

隨著研究的不斷深入，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)CLA對(duì)多種癌癥細(xì)胞存在預(yù)防和延緩癌細(xì)胞生長作用。CLA能夠有效抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞的活力，并推測(cè)是CLA激活了線粒體凋亡通路所導(dǎo)致[14]。同時(shí),CLA對(duì)HCT-116大腸癌細(xì)胞的活力也有明顯抑制作用，顯著降低腫瘤細(xì)胞生長和增殖關(guān)鍵基因的表達(dá)。此外，CLA通過下調(diào)促炎細(xì)胞因子和上調(diào)抗炎細(xì)胞因子的基因表達(dá)，使得自由基清除活性明顯增加[15]。CLA異構(gòu)體具有不同生理活性，t10，c12-CLA似乎與能量消耗和脂肪代謝相關(guān)。而早期研究表明，c9,t11-CLA能夠抑制胃癌細(xì)胞的生長，且抑制效果與c9,t11-CLA的濃度呈正相關(guān)[16]。與c9,t11-CLA相似，順9，反11-十八碳二烯酸(c9，t11-CLA)對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞生長有強(qiáng)抑制作用[17]，能夠抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18]，同時(shí)可以誘導(dǎo)參與人類巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝基因的表達(dá)[19]。

1.2.2抗炎作用

CLA通過抑制促炎因子的表達(dá)顯著改善小鼠的結(jié)腸炎，緩解效果的強(qiáng)弱與菌株合成CLA的能力高度相關(guān)[20]。通過短期口服CLA會(huì)抑制腸炎沙門氏菌的PhoP/PhoQ雙組分信號(hào)系統(tǒng)，在致病關(guān)鍵毒力因子的表達(dá)上發(fā)揮重要作用，進(jìn)而影響沙門氏菌在小鼠腸道中的定植和全身傳播導(dǎo)致的結(jié)腸炎[21]，這些發(fā)現(xiàn)可能有助于設(shè)計(jì)新的抗沙門氏菌療法。還有研究表明c9,t11-CLA：t10，c12-CLA(80∶20)混合物不僅對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型疾病的發(fā)展有抑制作用，而且能夠減少由此引發(fā)的機(jī)體損傷等問題[22]。

2 共軛亞油酸合成方式

2.1 化學(xué)合成

通常，化學(xué)合成CLA的三種方法為：(1) 堿催化異構(gòu)化；(2) 油酸烯丙醇脫水法；(3) 過渡金屬催化LA異構(gòu)化。其中，使用最廣泛的是以LA或富含LA植物油為底物的堿催化異構(gòu)化反應(yīng)，其產(chǎn)物為CLA異構(gòu)體混合物[5]。除了堿性異構(gòu)化外，以過渡金屬為催化劑能夠有效地催化生產(chǎn)CLA[23]。這類催化反應(yīng)條件相對(duì)溫和，而且產(chǎn)生的反式共軛亞油酸異構(gòu)體較少，但是也存在催化金屬昂貴、回收困難，產(chǎn)物多為CLA異構(gòu)體混合物等問題。

目前已知一些異構(gòu)體具有有益的生理活性，而混合物可能會(huì)產(chǎn)生未知的生理效應(yīng)。因此需要對(duì)CLA異構(gòu)體混合物進(jìn)行提純，低溫結(jié)晶法、尿素包合法和制備銀離子(Ag+)色譜法等手段都能夠有效的提純CLA異構(gòu)體[24]。但目前的提純工藝能耗高，提純工藝復(fù)雜，容易產(chǎn)生未知反應(yīng)產(chǎn)物等問題都需要進(jìn)一步的解決。

2.2 生物合成

2.2.1乳、肉制品獲取

牛羊等動(dòng)物通過將飲食中的多不飽和脂肪在瘤胃內(nèi)脂解，經(jīng)過異構(gòu)化和生物氫化催化等步驟生成CLA[4]。但普通飼養(yǎng)的牛羊而得到的乳、肉制品中CLA含量較低，因此可通過對(duì)動(dòng)物喂養(yǎng)添加某些油籽或蔬菜的飼料進(jìn)行飲食控制，增加LA前體含量水平進(jìn)而提高CLA含量。補(bǔ)充氫化棕櫚油和葵花籽油使得牛奶脂肪中的CLA增加15%～36%[25]，SHINGFIELD KJ等發(fā)現(xiàn)每天攝入70 g/頭的豆油使得牛奶中的CLA濃度達(dá)到2%～3%[26]。如前所述，CLA普遍存在于動(dòng)物肉類和乳制品中，從這些來源中獲取CLA相對(duì)容易，也是人類較為直接的獲取方式。但遠(yuǎn)低于人體每日需求攝入量，需要更高效的獲得方式合成CLA。

2.2.2微生物合成

微生物發(fā)酵工藝日漸成熟，CLA也可通過細(xì)菌發(fā)酵進(jìn)行生產(chǎn)。許多乳酸菌可將不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為CLA，特別是將LA轉(zhuǎn)化為CLA[27]。微生物發(fā)酵雖然較為高效且反應(yīng)條件溫和，但因?yàn)椴煌甑腃LA生產(chǎn)能力不同，同樣存在產(chǎn)量偏低無法滿足商業(yè)要求的問題。因此需要對(duì)菌種的產(chǎn)能進(jìn)行鑒定，高產(chǎn)量的菌種更利于商業(yè)化生產(chǎn)。另外通過對(duì)CLA合成機(jī)制的深層次研究，以基因重組技術(shù)和異源表達(dá)的方式來培養(yǎng)能夠滿足人類需求的菌種具有較大潛力。

2.2.3乳酸菌CLA合成機(jī)制

不斷有研究表明乳酸菌中CLA的合成需要多種酶的共同參與，植物乳桿菌AKU1009a中鑒定出CLA-HY(亞油酸水合酶)、CLA-DH(短鏈氫化酶/氧化還原酶)和CLA-DC(乙酰乙酸脫羧酶)共同作用才能使LA合成CLA[28]。同樣，植物乳桿菌ZS2058通過MCRA(肌球蛋白交叉反應(yīng)抗原)、DH和DC編碼的三組分亞油酸異構(gòu)酶系統(tǒng)經(jīng)多步反應(yīng)催化LA轉(zhuǎn)化為CLA[29], 如今乳酸菌中CLA和CLNA生產(chǎn)中涉及的酶及酶活性已被闡明[30]。

亞油酸首先在CLA-HY 催化下發(fā)生水合作用形成10-羥基-順式-12-十八烯酸(10-HOE)，10-HOE再經(jīng)脫水、雙鍵移位、水合、脫水等多步反應(yīng)，最終轉(zhuǎn)化為 c9，t11-CLA。植物乳桿菌α-烯醇化酶(ENOLASE)在亞油酸生物加氫的復(fù)雜代謝中具有輔助作用，通過10-羥基-順式-12-十八烯酸(10-HOE)的脫水和異構(gòu)化催化生成具有生物活性的c9，t11-CLA[31]。這也進(jìn)一步解釋了乳酸菌中產(chǎn)生CLA的相關(guān)機(jī)制，為下一步合成調(diào)控奠定基礎(chǔ)(圖2)。

圖2 乳酸菌CLA合成機(jī)制

3 不同菌株的共軛亞油酸合成能力

目前研究中多種細(xì)菌都能將游離LA轉(zhuǎn)化為CLA，如溶纖維丁酸弧菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、雙歧桿菌、痤瘡丙酸桿菌和費(fèi)氏丙酸桿菌。但不同菌株的合成能力有所差異，因此篩選高產(chǎn)菌株有利于滿足商業(yè)化需求，同時(shí)能夠生產(chǎn)單一CLA異構(gòu)體的菌株將減少純化步驟，為生產(chǎn)帶來便利。

3.1 瘤胃細(xì)菌

瘤胃細(xì)菌是指存在于牛羊等反芻動(dòng)物瘤胃中細(xì)菌的總稱，其中溶纖維丁酸弧菌A38能夠高效產(chǎn)生CLA，可將40%的LA轉(zhuǎn)化為CLA，其中95%為c9，t11-CLA[32]。COAKLEY M及其同事首先報(bào)道了雙歧桿菌產(chǎn)生CLA的能力，其中c9，t11-CLA是CLA的主要異構(gòu)體[33]，短雙歧桿菌LMC520對(duì)LA的轉(zhuǎn)化率高達(dá)90%，對(duì)單甘酯的轉(zhuǎn)化率為78.8%[34]。痤瘡假單胞菌ATCC6919能催化高濃度LA合成t10，c12-CLA[35]。埃氏巨型球菌YJ-4也能催化游離LA轉(zhuǎn)化生成35%的CLA，其中接近85%的成分為t10，c12-CLA[36]。

3.2 乳酸菌

乳酸菌作為人體腸道正常菌群，具有多種益生特性，能夠選擇性合成益生功能更強(qiáng)的c9，t11-CLA和t10，c12-CLA活性異構(gòu)體，在食品行業(yè)具有廣闊應(yīng)用前景。其中,植物乳桿菌AKU1009a的轉(zhuǎn)化率高達(dá)85%[37]。植物乳桿菌JCM1551以蓖麻油酸為底物也能積累高達(dá)2700 mg/L的CLA[38]。植物乳桿菌NCUL005能夠產(chǎn)生32.2%的c9，t11-CLA和67.8%的t10，c12-CLA[39]。鼠李糖乳桿菌PL60和戊糖乳桿菌IFO12 011同樣能夠產(chǎn)生大量的t10，c12-CLA[40]。

高產(chǎn)菌株的篩選為進(jìn)一步提高CLA產(chǎn)量提供良好的基礎(chǔ)，本文對(duì)近年部分高產(chǎn)菌株合成能力統(tǒng)計(jì)如下表1，為以后菌株的選取提供借鑒作用。

表1 不同菌株合成CLA能力

4 微生物合成調(diào)控

4.1 培養(yǎng)條件優(yōu)化

在細(xì)菌生產(chǎn)CLA的過程中，培養(yǎng)時(shí)間、pH、溫度和菌株接種量等因素都會(huì)影響CLA的產(chǎn)量[48]，菌株能夠利用的底物種類也有所差異[49]，價(jià)格低廉易獲取且能被菌株高效利用的底物更利于下一步培養(yǎng)開發(fā)。利用甘油作為唯一碳源，通過表達(dá)二?；视娃D(zhuǎn)移酶(DGA1)，Δ12去飽和酶(MA12D)和痤瘡丙酸桿菌異構(gòu)酶(PAI)來生產(chǎn)t10，c12-CLA，解脂耶氏酵母Po1 g的最大CLA含量和脂質(zhì)產(chǎn)量分別為132.6 mg/L和2.58 g/L[50]。弗氏假單胞菌可將水解的黑加侖榨汁渣中的脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為c9,t11-CLA，在10%(w/v)的漿液中，c9，t11-CLA富集可達(dá)0.51 mg/mL，從而使食品工業(yè)低價(jià)值植物性副產(chǎn)物的價(jià)態(tài)轉(zhuǎn)化為高附加值的食品配料[51]。選擇底物濃度時(shí)，經(jīng)常出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象，與500 μg/mL的最佳底物濃度相比，動(dòng)物芽孢桿菌在生產(chǎn)t9，t11-CLA時(shí)，當(dāng)?shù)孜餄舛仍?00 μg/mL～1 000 μg/mL左右時(shí)會(huì)受到抑制作用。總轉(zhuǎn)化率下降了19%～28%[52]。

高產(chǎn)菌株經(jīng)常作為生物合成CLA的研究對(duì)象，一般會(huì)選擇單一菌株進(jìn)行培養(yǎng)，但通過菌株的混合培養(yǎng)能達(dá)到不錯(cuò)的效果，共培養(yǎng)就是這種高效生產(chǎn)CLA策略。通過乳球菌和乳桿菌共培養(yǎng)，牛奶中總CLA(主要是c9、t11-CLA、t9、t11-CLA和部分t10、c12-CLA)產(chǎn)量在72 h達(dá)到56.51 mg/mL[53]。另外培養(yǎng)環(huán)境中加入其他物質(zhì)也能影響CLA的產(chǎn)量，通過加入乙腈和α-二癸基甲基鈉改變烯醇酶的活性，實(shí)現(xiàn)CLA含量增加約6倍[31]。添加殼聚糖和亞油酸可使菌體干生物量中CLA的產(chǎn)量在36 h內(nèi)提高到21 mg/g[54]，猜測(cè)和殼聚糖改變細(xì)胞膜通透性有關(guān)。

4.2 CLA合成相關(guān)酶的調(diào)控

CLA的轉(zhuǎn)化過程少不了酶的作用，過表達(dá)MCRA以增強(qiáng)CLA的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的總共軛亞油酸產(chǎn)量提高了21倍[55]。在酰基輔酶A合成酶抑制劑的存在下，t10，c12-CLA的含量從1.2 mg/L增加到29 mg/L[56]。CLA還原酶活性是影響CLA產(chǎn)量的另一個(gè)重要因素，高活性還原酶催化CLA轉(zhuǎn)化為反式痘苗酸導(dǎo)致CLA的積累減少[57]。相反，纖維分離桿菌MDT-5由于缺乏CLA還原酶活性而更容易發(fā)生CLA的積累[58]。

4.3 基因表達(dá)調(diào)控

CLA的產(chǎn)量與基因轉(zhuǎn)錄水平存在較大關(guān)聯(lián)性，植物乳桿菌CGMCC8198中存在一個(gè)保守的亞油酸異構(gòu)酶(Liase)基因，其轉(zhuǎn)錄可被元寶楓種子油誘導(dǎo)。發(fā)酵后c9，t11-CLA和t10，c12-CLA的含量分別提高了9倍和2.25倍[45]。通過定向進(jìn)化MCRA基因和亞油酸異構(gòu)酶基因，構(gòu)建重組菌突變體庫，篩選出的突變菌株其CLA產(chǎn)量明顯提高[59]。LysR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子LTTR能夠與CLA基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控cla-dh和cla-dc的轉(zhuǎn)錄，與野生株相比，lttR過表達(dá)菌株中CLA含量增長5倍[60]。這也是首次報(bào)道轉(zhuǎn)錄因子對(duì)CLA合成基因表達(dá)的影響，證明CLA的合成受到其它調(diào)控因子的調(diào)控，對(duì)于CLA代謝網(wǎng)絡(luò)有了更進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。

通過修改脂質(zhì)積累途徑，過表達(dá)DGA1、MA12D和PAI基因構(gòu)建新型重組菌株，并優(yōu)化培養(yǎng)條件(碳和氮源、碳氮質(zhì)量比、CaCl2含量)，使得CLA產(chǎn)品構(gòu)型單一且純度高。但同時(shí)也觀察到CLA降解速率為117 mg/L/h。通過消除β-氧化基因，可獲得1.8 mg/L/h的降解速率，使得CLA含量進(jìn)一步提高[61]。

4.4 協(xié)同作用

米根霉菌脂肪酶(ROL)與植物乳桿菌的洗滌細(xì)胞協(xié)作使用的方式可以一步法生產(chǎn)CLA異構(gòu)體，主要包括c9，t11-CLA和t10，c12-CLA，以蓖麻油為底物最高產(chǎn)量為406 μg/mL[62]。更可以通過將游離的PAI和ROL作為催化劑，建立了從葵花油生產(chǎn)CLA的聯(lián)合體系，在最佳條件下，t-10，c-12-CLA的最大產(chǎn)量達(dá)到9.4 g/L[63]?；诠潭ɑ疨AI和ROL的協(xié)同生物催化體系，將植物油轉(zhuǎn)化為特異性CLA，可得到高達(dá)109 g/L的t10，c12-CLA，轉(zhuǎn)化率為90.5%[64]。

5 展望

CLA在降酯、抗癌、抗動(dòng)脈硬化、免疫調(diào)節(jié)等方面效果顯著，但許多研究用的是 CLA 異構(gòu)體混合物,不是單一的異構(gòu)體, 這就需要我們對(duì)CLA異構(gòu)體的單體作用進(jìn)一步的研究，深入了解有益異構(gòu)體的作用機(jī)制，使有益CLA 異構(gòu)體得到廣泛應(yīng)用與開發(fā)。未來將發(fā)現(xiàn)更多CLA異構(gòu)體的生理功能，更好的被人們所利用，同時(shí)滿足廣闊的市場(chǎng)需求。

關(guān)于高產(chǎn)CLA菌株已有不少報(bào)道，其中乳酸菌廣泛存在于人體腸道中，因具有重要生理功能的菌群而備受關(guān)注。而且乳酸菌中CLA合成機(jī)制基本闡明[28]，通過多組酶系可以將LA轉(zhuǎn)化為CLA。但研究表明CLA并不是最終產(chǎn)物，在其他酶的作用下CLA作為中間體最終形成其他脂肪酸。為了獲得高濃度CLA產(chǎn)物，通過阻斷或者抑制CLA還原過程使細(xì)菌大量積累CLA成為一種新的思路。一般來說CLA的積累是逐步的，可以優(yōu)化培養(yǎng)條件以及在固化菌體的前提下優(yōu)化CLA分離技術(shù)，形成一種高效可循環(huán)的生產(chǎn)模式，以此達(dá)到商業(yè)化需求的目的。

近年來隨著合成CLA相關(guān)酶蛋白基因的挖掘，有利于通過重組菌株的構(gòu)建進(jìn)而異源表達(dá)合成CLA，進(jìn)一步提高CLA的產(chǎn)量[50]。CLA的產(chǎn)生是對(duì)環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)，這一過程是復(fù)雜的，是否存在其他代謝途徑影響著CLA的合成；某些條件變量在CLA合成途徑中又起到怎樣的作用還未可知。另外細(xì)菌中存在大量轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它們對(duì)維持細(xì)菌正常代謝發(fā)揮重要作用，但是目前關(guān)于CLA轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究較少，未來可以深入研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子對(duì)CLA合成的影響，為CLA合成調(diào)控研究提供新的方向。