分散固相萃取劑-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞肉和雞蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留

楊詩(shī)珍

上海天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司食品部, 上海 200233

氟苯尼考(Florfenicol)，又稱氟甲砜霉素，屬于酰胺醇類抗生素，對(duì)革蘭氏陰陽性及支原體細(xì)菌均有效。安全性及藥性比氯霉素及甲砜霉素效果好，由于氯霉素禁用于畜禽動(dòng)物，因此其在中國(guó)和國(guó)外養(yǎng)殖業(yè)迅速大規(guī)模使用。隨著研發(fā)深入，發(fā)現(xiàn)氟苯尼考對(duì)胚胎產(chǎn)生毒性，畜禽在用藥后，出現(xiàn)厭食、腹瀉等身體不健康反應(yīng)；如養(yǎng)殖者不規(guī)范使用氟苯尼考，未嚴(yán)格遵循休藥期，會(huì)導(dǎo)致畜禽食品中殘留過高，直接危害到人類健康[1]。氟苯尼考在動(dòng)物體內(nèi)的主要代謝標(biāo)志物是氟苯尼考胺，歐盟在2010年之前，已規(guī)定動(dòng)物源性食品中氟苯尼考最大殘留限量，用氟苯尼考及氟苯尼考胺作為檢出物。我國(guó)于2019年在GB 31650—2019獸殘殘留限量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了氟苯尼考的最大殘留限量，其殘留標(biāo)志物用氟苯尼考與氟苯尼考胺之和表示。其中家禽的最大殘留量為100 μg/kg ～2 500 μg/kg,產(chǎn)蛋期禁用。

關(guān)于動(dòng)物性食品中氟苯尼考?xì)埩舻臋z測(cè)標(biāo)準(zhǔn)比較多，也比較成熟[2]；但是關(guān)于氟苯尼考及氟苯尼考胺同時(shí)測(cè)定，只有一個(gè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[3]；文獻(xiàn)中有測(cè)試魚肉中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留的HPLC-MS/MS方法[4]，還有文獻(xiàn)關(guān)于雞蛋中的殘留用液相色譜法測(cè)試[5]。動(dòng)物組織特別是雞肉和雞蛋為高蛋白、高油脂動(dòng)物組織，很難通過較有效前處理手段將上機(jī)溶液凈化干凈；在儀器端，液相色譜選擇性較差，也難將目標(biāo)物和基質(zhì)中雜質(zhì)有效分離。針對(duì)復(fù)雜基質(zhì)樣品分析，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜就有比較明顯的優(yōu)勢(shì)；雞肉和雞蛋都是人民大眾主要的食物來源之一，因此，研究建立雞肉和雞蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺測(cè)定的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有重要意義。本方法建立同時(shí)測(cè)定雞肉和雞蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法，乙腈提取，C18分散固相萃取劑凈化，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。

1 儀器和試劑

1.1 儀器

HPLC-MS/MS：Waters TQ-S；色譜柱(Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm))；分析天平(Melter/Ms204S)；攪拌機(jī)(飛利浦)；冷凍離心機(jī)(Eppendorf/5810R)；超聲提取儀(上?？茖?dǎo))；氮吹儀(O-EVAP TM 112，美國(guó))；渦旋混合器(KA)；高速分散均質(zhì)機(jī)(上海標(biāo)本模型廠)；固相萃取裝置(Supelco)。

1.2 試劑及耗材

超純水(Millipore超純水系統(tǒng))；乙腈(HPLC級(jí)，Aocs)；甲醇(HPLC級(jí)，Aocs)；正己烷(HPLC級(jí)，Aocs)；氨水(GR)；氯化鈉(AR，上海國(guó)藥)；無水硫酸鈉，馬弗爐 550 ℃灼燒 2 h后，冷卻后密封保存使用；C18分散固相萃取劑。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

氟苯尼考(Florfenicol)，CAS：73231-34-2，分子式：C12H14Cl2FNO4S，分子量：358.2。

氯霉素-D5(ChloraMphenicol-D5)，CAS：202480-68-0，分子式：C11H7Cl2D5N2O5，分子量：328.1。

氟苯尼考胺(Florfenicol amine)，CAS：108656-33-3，分子式：C10H14FNO3S，分子量：375.2。

氟苯尼考胺-D3(Florfenicol-d3 Amine)，CAS：76639-93-5，分子式：C10H11D3FNO3S，分子量：250.3。以上標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自Dr. E.公司。

1.4 試劑的配置

10%乙腈水溶液：量取 10 mL 乙腈，用水稀釋至 100 mL。

0.01%氨水溶液：量取 100 μL 氨水加入 1 L 超純水中，充分混勻。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

1.5.1儲(chǔ)備液(1 000 mg/L)：

分別準(zhǔn)確稱取氟苯尼考、氟苯尼考胺、氟苯尼考胺-D3 和氯霉素-D5 標(biāo)準(zhǔn)品 10.0 mg(按純度示值折算)，用甲醇溶解并定容至 10 mL，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液質(zhì)量濃度均為 1 000 μg/mL。-20 ℃ 以下避光貯存，保存期為12個(gè)月。

1.5.2中間液(氟苯尼考10 μg/mL，氟苯尼考胺 100 μg/mL)：

分別準(zhǔn)確量取 100 μL 氟苯尼考和 1 000 μL氟苯尼考胺儲(chǔ)備液，用甲醇定容至10 mL，標(biāo)準(zhǔn)中間液濃度分別為氟苯尼考10 μg/mL，氟苯尼考胺 100 μg/mL，-20 ℃ 以下避光貯存，保存期為 6 個(gè)月。

1.5.3內(nèi)標(biāo)混合中間液(10 μg/mL)：

分別準(zhǔn)確量取 100 μL 氟苯尼考胺-D3 和氯霉素-D5 標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇定容至10 mL，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液質(zhì)量濃度為 10 μg/mL，-20 ℃以下避光貯存，保存期為 6 個(gè)月。

1.5.4標(biāo)準(zhǔn)混合使用液(氟苯尼考 10 ng/mL，氟苯尼考胺100 ng/mL)：

準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)混合中間液 100 μL，用 10%乙腈-水溶液定容至 100 mL，標(biāo)準(zhǔn)混合使用液濃度為氟苯尼考 10 ng/mL，氟苯尼考胺100 ng/mL，4 ℃貯存，保存期為一周。

1.5.5內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)混合使用液(100 ng/mL)：

準(zhǔn)確吸取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)混合中間液 100 μL，用 10%乙腈-水溶液定容至 10 mL，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)混合使用液濃度為 100 ng/mL，4 ℃貯存，保存期為一周。

1.5.6標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制，見表1：

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

1.6 試樣的前處理

1.6.1提取

稱取經(jīng)過均質(zhì)的試樣 2.0 g(精確到 0.01 g)到50 mL聚丙烯離心管中，準(zhǔn)確加入50 μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液，加1 mL水漩渦混勻，再加10 mL乙腈， 漩渦混合30 s，超聲提取10 min。10 000 r/min 離心 10 min(溫度低于5 ℃)。 上清液待轉(zhuǎn)移。

1.6.2凈化

再取一個(gè)15 mL 離心管，加入 250 mg,C18分散固相萃取劑和 2 g 無水硫酸鈉，移入1.6.1上清液 7 mL，振搖1 min，以12 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心 5 min，取上清液 5 mL 轉(zhuǎn)移至另一離心管中，在低流速氮?dú)庀麓蹈?，加?0.5 mL 10%乙腈水溶液溶解殘?jiān)?，渦旋混合 1 min，轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中， 加入 0.5 mL 正己烷，充分震蕩1 min，以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速 離心 5 min，棄去正己烷層。 吸取下層用于HPLC-MS-MS 測(cè)定。

1.7 HPLC-MS-MS分析條件

1.7.1HPLC條件

(a) 色譜柱： Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)； (b) 流動(dòng)相：A相為0.01%氨水溶液，B相為乙腈； (c) 流速：0.35 mL/min； (d) 進(jìn)樣量：5 μL。

流動(dòng)相梯度見表2。

表2 流動(dòng)相

1.7.2質(zhì)譜條件

(a) 離子源：電噴霧ESI離子源； (b) 掃描方式：正離子和負(fù)模式掃描； (c) 檢測(cè)方式： SRM； (d) 電噴霧電壓：3 500 v； (e) 鞘氣：高純氮?dú)猓? psi； (f) 輔助氣：高純氬氣，5 psi； (g) 監(jiān)測(cè)離子對(duì)情況。

質(zhì)譜采集參數(shù)見表3。

表3 質(zhì)譜采集參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑及凈化方法的選擇

氟苯尼考極性極弱，不易溶于水，在有機(jī)溶劑中溶解性較強(qiáng)；氟苯尼考胺具有堿性，極易溶于水，水溶解后，可再溶于有機(jī)溶劑；在已有的國(guó)標(biāo)[2,3]中，使用乙酸乙酯提取氟苯尼考；用堿性乙酸乙酯提取氟苯尼考胺?？紤]到雞蛋的蛋白質(zhì)含量比較高，乙腈是一種比較好的沉淀蛋白的有機(jī)溶劑，并結(jié)合國(guó)標(biāo)中提取劑，本方法比較了乙酸乙酯、堿性乙酸乙酯及乙腈三種不同溶劑提取目標(biāo)物；實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雞蛋中加入乙腈提取，起到沉淀蛋白質(zhì)的作用，提高了凈化效果，減小基質(zhì)干擾，確保測(cè)試結(jié)果更準(zhǔn)確，回收率比較見表4。分析原因是雞肉和雞蛋中水分含量高，水和乙腈為互溶溶劑，可以保證了氟苯尼考胺的提取效率。本方法凈化方法區(qū)別于傳統(tǒng)獸殘檢測(cè)方法，現(xiàn)有的國(guó)標(biāo)或文獻(xiàn)中，獸殘檢測(cè)均采樣SPE柱凈化方式，但隨著農(nóng)殘Quechers方法的成熟應(yīng)用，大大節(jié)省凈化過程時(shí)間，同樣可以得到很好準(zhǔn)確度；所以，本方法嘗試了C18分散固相萃取劑凈化，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分散固相萃取劑凈化效果好，基質(zhì)干擾小，前處理操作過程從4 h降至2 h，回收率和重現(xiàn)性同樣滿足GB/T 27404—2005的要求。

表4 不同溶劑提取，雞蛋和雞肉中氟苯尼考胺、氟苯尼考回收率比較

2.2 液相條件及質(zhì)譜條件的確定

2.2.1色譜條件的優(yōu)化

氟苯尼考為弱極性物質(zhì)，在C18柱上有較強(qiáng)的保留，色譜條件相對(duì)容易選擇；而氟苯尼考胺為堿性化合物，是極性比較強(qiáng)的化合物，在普通C18柱上基本沒有保留；對(duì)比不同品牌C18柱，基本是色譜柱死體積出峰，無保留，最終發(fā)現(xiàn)Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)對(duì)氟苯尼考胺有一定的保留，保留時(shí)間為2.26 min。選擇純水、乙腈作流動(dòng)相時(shí)，發(fā)現(xiàn)氟苯尼考胺峰型不對(duì)稱，有拖尾現(xiàn)象，后在水相加入氨水，調(diào)整流動(dòng)相的pH值，消除了氟苯尼考胺拖尾現(xiàn)象，得到比較對(duì)稱的峰型。為了更好地分離目標(biāo)物和樣品中的雜質(zhì)，此方法最終選擇0.01%氨水溶液和乙腈進(jìn)行梯度分析，樣品總的運(yùn)行時(shí)間為8.5 min，讓雜質(zhì)能夠完全流出，避免對(duì)下一針樣品產(chǎn)生柱上污染。

2.2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

HPLC-MS-MS采樣的是電噴霧離子化(ESI)使化合物帶電，氟苯尼考為酸性化合物，采樣負(fù)模式電噴霧離子源；氟苯尼考胺含有氨基官能團(tuán)，選擇用正模式電噴霧離子源，進(jìn)行離子掃描。表3為確認(rèn)的質(zhì)譜采集參數(shù)；圖1為氟苯尼考胺、氟苯尼考及氟苯尼考胺-D3、氯霉素-D5的標(biāo)準(zhǔn)品多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式離子描譜圖。

圖1 氟苯尼考胺、氟苯尼考及氟苯尼考胺-D3、氯霉素-D5的標(biāo)準(zhǔn)品MRM模式離子描譜圖

2.3 線性范圍

由于HPLC-MS/MS受基質(zhì)效應(yīng)，影響結(jié)果準(zhǔn)確定量，本文采樣氯霉素-D5和氟苯尼考胺-D3分別作為氟苯尼考和氟苯尼考胺內(nèi)標(biāo)物，分別配制氟苯尼考和氟苯尼考胺曲線濃度點(diǎn)，為0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL，和 1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL、20.0 μg/mL，利用MRM離子掃描方式，用定量離子的峰面積對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸計(jì)算，氟苯尼考線在0.1μg/mL ～2.0 μg/mL 范圍，R2≥0.995，氟苯尼考胺線在1.0 μg/mL ～20.0 μg/mL范圍，R2≥0.995，線性關(guān)系均良好(見圖2)。

圖2 氟苯尼考胺、氟苯尼考的工作曲線

2.4 定量限、方法回收率和精密度

分別取雞肉、雞蛋空白基質(zhì)樣品，進(jìn)行添加回收率和精密度試驗(yàn)，添加水平：氟苯尼考胺為0.5μg/kg、2.5 μg/kg和5.0 μg/kg，氟苯尼考為0.0 μg/kg、0.25μg/kg和0.5 μg/kg，添加后混合靜置，使標(biāo)準(zhǔn)溶液被樣品充分吸收，每個(gè)濃度水平進(jìn)行7次平行試驗(yàn)，確定該方法的定量限、回收率和精密度。得氟苯尼考和氟苯尼考胺檢出限分別為0.05 μg/kg和 0.5 μg/kg；回收率在68.0%～90.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.6%～4.6%之間。雞肉和雞蛋加標(biāo)回收率和RSD見表5和表6，圖3為雞蛋空白樣品加標(biāo)的MRM模式離子描譜圖。

圖3 氟苯尼考胺、氟苯尼考及氟苯尼考胺-D3、氯霉素-D5雞蛋空白加標(biāo)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式離子描譜圖

表5 雞蛋中氟苯尼考胺、氟苯尼考的標(biāo)樣添加量、加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

表6 雞肉中氟苯尼考胺、氟苯尼考的標(biāo)樣添加量、加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.5 方法的應(yīng)用

從市場(chǎng)分別采購(gòu)雞肉和雞蛋樣本，20個(gè)雞肉樣本中有5個(gè)樣本氟苯尼考檢出，檢出含量在0.10 μg/kg～1.17 μg/kg之間，氟苯尼考胺均未檢出，均符合GB 31650—2019 食品中獸藥最大殘留限量。20個(gè)雞蛋樣本中，有1個(gè)樣本檢出氟苯尼考，檢出含量為0.08 μg/kg，不符合限量要求；雞蛋中氟苯尼考胺均未檢出。檢測(cè)結(jié)果見表7。

表7 20個(gè)雞肉和雞蛋樣本檢出結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

3 結(jié)論

本方法采用乙腈溶液為目標(biāo)物提取劑，將C18分散固相萃取劑與LC/MS/MS技術(shù)相結(jié)合，建立了一種測(cè)定雞蛋和雞肉中氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留同時(shí)測(cè)定的方法。該方法操作簡(jiǎn)單有效，方法靈敏度滿足殘留限值要求，可適用于樣品的高通量測(cè)試。