Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定茶酵素中多酚含量的方法學(xué)研究

尚 琪 石美榮 蘇小育 雷 超 李建文 張春娟

（渭南市檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，陜西渭南 714000）

酵素是以動(dòng)物、植物、菌類等為原料經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品。作為國(guó)內(nèi)新興行業(yè)，對(duì)其產(chǎn)品成分和功效研究尚處于基礎(chǔ)研究階段。目前，檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)主要依據(jù)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)及各大企業(yè)提供的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)對(duì)酵素各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法均采用國(guó)家現(xiàn)行的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法[1～3]。但目前市場(chǎng)酵素產(chǎn)品為改善口感、提高產(chǎn)品膳食纖維，普遍添加了20%～30%的低聚異麥芽糖、低聚半乳糖等低聚糖[4]，對(duì)于樣品前處理及反應(yīng)條件，若采用通用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)具有一定的局限性甚至不適用性。

多酚具有抗氧化、助消化、降血脂、抗癌等多種生物活性[5～8]，是大多數(shù)酵素產(chǎn)品的特征性指標(biāo)之一[9～12]。以茶葉為原料制得的茶酵素產(chǎn)品中多酚含量的測(cè)定，現(xiàn)采用GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》[13]。該方法主要應(yīng)用于茶葉中提取的茶多酚含量測(cè)定，而茶酵素產(chǎn)品與茶葉提取物存在差異性，故需結(jié)合茶酵素產(chǎn)品自身特點(diǎn)，對(duì)樣品前處理及最佳反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化研究，建立茶酵素產(chǎn)品的多酚檢測(cè)方法，從而可推廣應(yīng)用于其他富含多酚類物質(zhì)酵素產(chǎn)品中多酚含量的測(cè)定。基于此，本文主要對(duì)茶酵素產(chǎn)品中多酚含量測(cè)定的Folin—Ciocalteu比色法的前處理及最佳反應(yīng)條件進(jìn)行了研究。

一、材料與方法

（一）材料與儀器設(shè)備液體茶酵素（渭南茶酵酵素發(fā)展有限公司）；固體茶酵素（四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計(jì)院果蔬實(shí)驗(yàn)室）。無(wú)水碳酸鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；Folin—Ciocalteu試劑（BR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；沒(méi)食子酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 g/mL）：稱取0.1±0.001 g一水合沒(méi)食子酸，于100 mL容量瓶中溶解、定容（現(xiàn)配）。T9S雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；GL—20 G—Ⅱ高速（冷凍）離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KQ—500 E超聲波輔助提取儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

（二）前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

1.pH。液體樣品：稱取適量試樣于燒杯，室溫超聲10～20 min，除去試樣中氣體至質(zhì)量穩(wěn)定，超純水補(bǔ)至初始質(zhì)量。再準(zhǔn)確稱取以上試樣2.0 g（精確至0.001 g），加超純水20 mL，于40℃水浴超聲30～50 min，冷卻至室溫，用醋酸—醋酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH呈梯度 （3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0），并定容至100 mL備用。

固體樣品：根據(jù)GB 5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》[14]的規(guī)定，測(cè)定試樣水分含量，計(jì)算干物質(zhì)含量，干物質(zhì)含量＝（1—水分含量）×100%。將已確定干物質(zhì)含量的固體樣品過(guò)0.20 mm孔徑篩，取篩下物，稱取1～2 g，加入超純水（溫度≥60℃）20 mL，于50℃水浴超聲30～50 min，冷卻至室溫。如有渾濁或沉淀，以6 000 r/min離心15 min，冷卻至室溫，用醋酸—醋酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)至不同pH，并定容至100 mL備用。

移取上述供試液各1.0 mL于25 mL刻度試管內(nèi)，按照GB/T 8313—2018的條件進(jìn)行顯色反應(yīng)，于最佳波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

2.低聚糖。按照上文樣品制備方式處理樣品后，用醋酸—醋酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)至最適pH，并定容至100 mL。隨后緩慢加入85%無(wú)水乙醇，同時(shí)使用渦旋振蕩器混勻，置超聲波提取器中室溫超聲提取30 min。提取結(jié)束后，以6 000 r/min離心15 min，收集上清液。將離心沉淀物用85%乙醇超聲提取2～3次，以6 000 r/min離心15 min，合并上清液，定容至100 mL容量瓶備用。

移取上述供試液各1.0 mL于25 mL刻度試管內(nèi)，按照GB/T 8313—2018的條件進(jìn)行顯色反應(yīng)，于最佳波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。

（三）Folin-Ciocalteu比色法反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.樣品制備。按照 “（二）前處理?xiàng)l件的優(yōu)化”中“1.pH”方法將樣品溶液調(diào)至最適pH，以85%無(wú)水乙醇除去溶液中低聚糖，合并提取液，定容于100 mL容量瓶備用（液體樣品編號(hào)SJ—1，固體樣品編號(hào)SJ—2）。

2.測(cè)定波長(zhǎng)的選擇。分別各取1.0 mL供試液SJ—1、供試液SJ—2、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液加入25 mL刻度試管中，依次加入5.0 mL 10%Folin—Ciocalteu試劑振蕩反應(yīng)3～5 min、4.0 mL 7.5%Na2CO3溶液，混勻，室溫超聲至體系內(nèi)不再產(chǎn)生氣泡，超純水定容。室溫下避光放置60 min，用1 cm比色皿于600～850 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定吸光值，繪制呈色化合物的吸收曲線，確定最佳測(cè)定波長(zhǎng)。

3.呈色反應(yīng)體系中各試劑用量的確定。7.5%Na2CO3溶液：移取SJ—1、SJ—2供試液各1.0 mL分別于8支25 mL刻度試管內(nèi)，各加10%Folin—Ciocalteu試劑5.0 mL，搖勻，各加入不同體積（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mL）的7.5%Na2CO3溶液，室溫超聲至體系內(nèi)不再產(chǎn)生氣泡后，超純水定容。室溫避光下完成顯色反應(yīng)，測(cè)定其吸光值，確定7.5%Na2CO3溶液的最佳用量。

10%Folin—Ciocalteu試劑：方法同上，加入梯度10%Folin—Ciocalteu試劑（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL），確定10%Folin—Ciocalteu試劑的最佳用量。

4.穩(wěn)定性試驗(yàn)。按照上述最佳反應(yīng)條件，考察供試液SJ—1、SJ—2反應(yīng)時(shí)間 （10、20、30、60、90、120 min）和顯色溫度（5、10、20、30、40、50℃）對(duì)吸光值的影響。

5.標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。用移液管分別移?。?.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL）的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，分別用超純水定容至刻度，搖勻。從上述溶液中各吸取1.0 mL分別加入25 mL刻度試管內(nèi)，各加7.0 mL 10%Folin—Ciocalteu試劑振蕩反應(yīng)3～5 min，再加5.0 mL 7.5%Na2CO3溶液，混勻后室溫超聲至反應(yīng)體系內(nèi)不再產(chǎn)生氣泡，超純水定容。于30℃下避光靜置反應(yīng)90 min，以超純水為空白，于最佳波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，以吸光值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝0.004 1x—0.001 4，R2＝0.999 6。

6.數(shù)據(jù)分析。液體樣品中多酚含量根據(jù)公式（1）計(jì)算，固體樣品中多酚含量根據(jù)公式（2）計(jì)算。同一樣品兩次測(cè)定值的絕對(duì)差值不得超過(guò)算數(shù)平均值的10%，取兩次測(cè)定的算數(shù)平均值作為結(jié)果，保留小數(shù)點(diǎn)后兩位。方法檢出限為0.03 mg/kg。

公式（1）、公式（2）中，X為多酚含量 （mg/g）；A為樣品測(cè)試液吸光度；A0為試劑空白液吸光度；V為樣品溶液體積，100 mL；d為稀釋因子（通常為1 mL稀釋成10 mL，則稀釋因子為10）；R為沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；m為樣品質(zhì)量（g）；ω為樣品干物質(zhì)含量（%）。

（四）Folin-Ciocalteu比色法精密度試驗(yàn)

1.重現(xiàn)性試驗(yàn)。按照確定的最佳Folin—Ciocalteu比色法反應(yīng)條件，對(duì)供試樣品（樣品編號(hào)為SJ—3、SJ—4）平行測(cè)定7次其多酚含量，并計(jì)算測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，%），考察該方法的重復(fù)性[15]。

2.再現(xiàn)性試驗(yàn)。按照確定的最佳Folin-Ciocalteu比色法反應(yīng)條件，對(duì)上述制備的樣品供試液（編號(hào)為SJ—5、SJ—6）重復(fù)測(cè)定6次其多酚含量，并計(jì)算測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，%），考察該方法的再現(xiàn)性[15]。

3.加標(biāo)回收試驗(yàn)。按照“（三）Folin-Ciocalteu比色法反應(yīng)條件的優(yōu)化”中“1.樣品制備”方法制備供試液（編號(hào)為SJ—7、SJ—8），并在制備供試液中加入不同量的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，以最佳Folin—Ciocalteu比色法反應(yīng)條件分別測(cè)定其多酚含量，并計(jì)算其回收率，評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確性和可靠性[16]。

（五）方法比對(duì)試驗(yàn)采用本文優(yōu)化的Folin—Ciocalteu比色法（簡(jiǎn)稱方法一）與GB/T 8313—2018中“4茶葉中茶多酚的檢測(cè)”的方法（簡(jiǎn)稱方法二），在相同試驗(yàn)環(huán)境下進(jìn)行方法比對(duì)試驗(yàn)，檢測(cè)送檢留樣茶酵素（編號(hào)1）、芒果酵素（編號(hào)2）、蘋(píng)果酵素（編號(hào)3）、桑葚酵素（編號(hào)4）、刺梨復(fù)合酵素飲品（編號(hào)5）、蘆薈酵素（編號(hào)6）中的多酚含量，以驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確性、可靠性。

二、結(jié)果與討論

（一）前處理?xiàng)l件的確定

1.pH。植物源性多酚以自由酚和結(jié)合酚兩種形式存在，大多數(shù)為結(jié)合酚，pH是影響酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)、多糖間發(fā)生非共價(jià)相互作用的重要因素[17～19]。因此，樣品預(yù)處理前有必要考察pH對(duì)其測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 pH對(duì)吸光度的影響 （n＝3）

由表1可以看出，樣品前處理pH在3.0～8.0之間，所測(cè)吸光值隨pH的上升而逐漸降低，是由于隨著pH上升，多酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)、多糖等復(fù)合被沉降[19～20]，造成檢測(cè)結(jié)果下降。通過(guò)對(duì)所測(cè)吸光值進(jìn)行顯著性差異分析發(fā)現(xiàn)，液體樣品pH在3.0、4.0、5.0，固體樣品pH在3.0、4.0時(shí)吸光值不存在顯著性差異（P＞0.05）；液體樣品和固體樣品pH在6.0、7.0、8.0時(shí)吸光值存在顯著性差異（P＜0.05）。得出結(jié)論，樣品前處理pH對(duì)茶酵素產(chǎn)品多酚含量測(cè)定影響顯著，故確定樣品前處理最佳pH≤4.0。

2.低聚糖。低聚糖對(duì)吸光度的影響如表2所示，由結(jié)果可見(jiàn)，通過(guò)醇沉法除去低聚糖成分后吸光值顯著降低，固體樣品吸光值降低超過(guò)50%，液體樣品吸光值降低超過(guò)30%，存在極顯著性差異（P＜0.01），可能是由于添加的低聚異麥芽糖、低聚半乳糖等有自由的醛基，具有一定的還原性所致，因此茶酵素樣品在前處理中應(yīng)除去低聚糖[19]。

表2 低聚糖對(duì)吸光度的影響 （n＝3）

（二）Folin-Ciocalteu比色法反應(yīng)條件的確定

1.測(cè)定波長(zhǎng)的確定。圖1為沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液（SJ—1、SJ—2）的光譜掃描結(jié)果，由結(jié)果可以看出，通過(guò)掃描600～850 nm范圍的吸光值，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品及茶酵素樣品在740～760 nm之間有明顯的吸收高峰，茶酵素樣品最高吸收峰在750 nm處，因此確定750 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的光譜掃描結(jié)果

2.7.5%Na2CO3溶液用量的確定。7.5%Na2CO3溶劑用量對(duì)吸光度的影響如表3所示，可以看出，所測(cè)吸光值隨著7.5%Na2CO3溶液用量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，用量為5.0 mL時(shí)吸光值最高，且SJ—1、SJ—2樣品測(cè)定結(jié)果變化基本一致。是由于Folin-Ciocalteu試劑與多酚物質(zhì)在堿性環(huán)境下顯色反應(yīng)，7.5%Na2CO3溶液用量不足，顯色不完全，會(huì)導(dǎo)致所測(cè)吸光度偏低。通過(guò)對(duì)所測(cè)各吸光值進(jìn)行顯著性差異分析可得，7.5%Na2CO3溶液用量為5.0 mL和6.0 mL時(shí)吸光值均高于其他用量時(shí)，且均存在顯著性差異（P＜0.05），7.5%Na2CO3溶液用量為5.0 mL的吸光值最高，因此確定7.5%Na2CO3溶液最佳用量體積為5.0 mL。

表3 7.5%Na2CO3溶液用量對(duì)吸光度的影響 （n＝3）

3.10%Folin—Ciocalteu試劑用量的確定。10%Folin—Ciocalteu試劑用量對(duì)吸光度的影響如表4所示，可以看出，吸光值隨著10%Folin—Ciocalteu試劑用量的增加而增加，在用量6.0 mL時(shí)趨于穩(wěn)定，是由于隨著Folin—Ciocalteu試劑用量的增加，顯色反應(yīng)越完全。進(jìn)行顯著性差異分析SJ—1、SJ—2樣品所測(cè)吸光值，得出10%Folin—Ciocalteu試劑用量為6.0 mL時(shí)的吸光值與用量2.0、3.0、4.0、5.0 mL的吸光值存在顯著性差異（P＜0.05），用量7.0 mL相比6.0、8.0 mL無(wú)顯著性差異（P＞0.05），故確定10%Folin—Ciocalteu試劑最佳用量體積為7.0 mL。

表4 10%Folin-Ciocalteu試劑用量對(duì)吸光度的影響 （n＝3）

4.穩(wěn)定性試驗(yàn)。顯色溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)供試液SJ—1、SJ—2吸光度的影響分別如表5、表6所示，可以得出，SJ—1在5、10、20℃，SJ—2在5、10℃顯色溫度條件下，隨著反應(yīng)時(shí)間（10～120 min）的增加，吸光值基本保持持續(xù)升高趨勢(shì)，這是由于反應(yīng)溫度過(guò)低會(huì)降低反應(yīng)速率；SJ—1、SJ—2在40、50℃顯色溫度條件下，呈現(xiàn)吸光值增速快、最高吸光值相對(duì)偏低、反應(yīng)時(shí)間超過(guò)60 min后吸光值明顯下降等現(xiàn)象，這是因?yàn)轱@色溫度較高時(shí)多酚氧化速度加快，F(xiàn)olin—Ciocalteu試劑開(kāi)始分解，從而導(dǎo)致所測(cè)吸光值降低或結(jié)果不穩(wěn)定的現(xiàn)象[16]；SJ—1在顯色溫度為30℃，顯色反應(yīng)至90 min時(shí)吸光值趨于平穩(wěn)狀態(tài)，SJ—2在顯色溫度為20、30℃，顯色反應(yīng)至90 min時(shí)吸光值趨于平穩(wěn)狀態(tài)。通過(guò)對(duì)吸光值結(jié)果進(jìn)行顯著性差異分析得出，顯色溫度為30℃時(shí)，90、120 min吸光值不存在顯著性差異（P＞0.05）。為便于檢測(cè)、縮短反應(yīng)時(shí)間，高效達(dá)到顯色效果，故選擇顯色溫度為30℃，避光反應(yīng)90 min。

表5 顯色溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)供試液SJ-1吸光度的影響 （n＝3）

表6 顯色溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)供試液SJ-2吸光度的影響 （n＝3）

（三）精密度試驗(yàn)

1.重現(xiàn)性試驗(yàn)。采用優(yōu)化后的測(cè)定方法分別對(duì)SJ—3、SJ—4供試液平行測(cè)定7次其多酚含量，結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可得出，SJ—3試樣RSD為0.93%，SJ—4試樣RSD為1.14%，均＜1.5%，重現(xiàn)性良好。

表7 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2.再現(xiàn)性試驗(yàn)。采用優(yōu)化后的測(cè)定方法分別平行測(cè)定6次SJ—5、SJ—6樣品中多酚的含量，結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可得出，SJ—5試樣RSD為0.49%，SJ—6試樣RSD為0.83%，均＜1.5%，精密度完全滿足樣品分析的要求。

表8 再現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

3.加標(biāo)回收試驗(yàn)。采用優(yōu)化后的測(cè)定方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表9。由表9可知，SJ—7、SJ—8樣品5次加標(biāo)回收試驗(yàn)的最低回收率分別為97.6%、94.2%，最高回收率分別為101.7%、98.1%，平均回收率分別是98.8%、96.6%，其RSD分別為1.69%、1.68%，均＜2.0%，表明該優(yōu)化后的方法檢測(cè)準(zhǔn)確可靠。

表9 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果

4.方法比對(duì)試驗(yàn)。通過(guò)本法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 8313—2018方法比對(duì)測(cè)定送檢留樣酵素產(chǎn)品中的多酚含量，結(jié)果見(jiàn)表10。結(jié)果顯示，國(guó)標(biāo)法測(cè)定結(jié)果值明顯高于本法，存在顯著性差異（P＜0.05）。國(guó)標(biāo)法測(cè)定結(jié)果值的RSD均＞2.0%，本法測(cè)定結(jié)果值的RSD均＜2.0%。因酵素產(chǎn)品中含有大量的低聚糖及各產(chǎn)品pH的不同，顯著影響了檢測(cè)結(jié)果，導(dǎo)致結(jié)果偏高及RSD＞2.0%。因此，國(guó)標(biāo)法并不適用于酵素產(chǎn)品中多酚含量的測(cè)定，采用本法測(cè)定酵素產(chǎn)品中的多酚含量更具準(zhǔn)確性、可靠性。

表10 方法比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果 （n＝3）

三、結(jié)論

本研究確定了茶酵素產(chǎn)品中多酚含量測(cè)定的Folin—Ciocalteu比色法前處理及最佳反應(yīng)條件。前處理?xiàng)l件為：樣品溶液調(diào)至pH≤4.0，去除低聚糖。最佳反應(yīng)條件為：10%Folin-Ciocalteu試劑7.0 mL、7.5%Na2CO3溶液5.0 mL、溫度30℃、避光反應(yīng)90 min，最佳測(cè)定波長(zhǎng)750 nm。沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在5～50μg/mL濃度的范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為R2＝0.999 6。精密度試驗(yàn)結(jié)果表明，液體和固體供試樣品精密度試驗(yàn)RSD均＜1.5%，平均加標(biāo)回收率分別是98.8%、96.6%，其RSD分別是1.69、1.68%，均＜2.0%。通過(guò)與國(guó)標(biāo)法比對(duì)檢測(cè)，說(shuō)明國(guó)標(biāo)法并不適用于酵素產(chǎn)品中多酚含量的測(cè)定，采用本法測(cè)定酵素產(chǎn)品中的多酚含量簡(jiǎn)單方便、穩(wěn)定性好、精密度高、結(jié)果準(zhǔn)確可信，可有效用于酵素產(chǎn)品中多酚含量檢測(cè)。