人原代胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞攝取轉(zhuǎn)運(yùn)模型的建立及氟西汀對(duì)胎盤(pán)P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的影響*

王晶晶， 馬雯婷， 王茜， 王丹， 馬翠， 張峻△

人原代胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞攝取轉(zhuǎn)運(yùn)模型的建立及氟西汀對(duì)胎盤(pán)P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的影響*

王晶晶1， 馬雯婷1， 王茜1， 王丹2， 馬翠3， 張峻1△

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1臨床藥學(xué)科，2神經(jīng)內(nèi)科，3產(chǎn)科，云南 昆明 650032）

建立人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“滋養(yǎng)層細(xì)胞”）轉(zhuǎn)運(yùn)模型，應(yīng)用該模型考察氟西?。╢luoxetine，F(xiàn)XT）暴露下外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的功能變化，探討FXT對(duì)胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)能力的影響。從足月胎盤(pán)中分離、消化、培養(yǎng)得到合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞，并從形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)等方面對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，應(yīng)用P-gp蛋白的特異性底物羅丹明123及抑制劑維拉帕米對(duì)其功能進(jìn)行評(píng)估，確定最適底物濃度及抑制劑濃度，隨后采用低、中、高濃度的FXT分別干預(yù)滋養(yǎng)層細(xì)胞0.5 h、48 h和72 h，應(yīng)用特異性底物開(kāi)展細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)，考查FXT對(duì)P-gp功能、蛋白表達(dá)、轉(zhuǎn)錄水平的影響?；谌颂ケP(pán)滋養(yǎng)層攝取轉(zhuǎn)運(yùn)模型，P-gp底物羅丹明123的最適濃度為1 μmol/L，抑制劑維拉帕米的最適濃度為10 μmol/L；低、中、高濃度FXT分別干預(yù)滋養(yǎng)層細(xì)胞0.5 h、48 h和72 h后，P-gp的底物羅丹明123在細(xì)胞內(nèi)蓄積水平升高（<0.05）。FXT可顯著性下調(diào)P-gp蛋白表達(dá)（<0.05），但對(duì)P-gp mRNA水平無(wú)顯著影響（>0.05）。FXT可能通過(guò)下調(diào)P-gp的蛋白表達(dá)而抑制其外排轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

人胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞；氟西??；P-糖蛋白；抑郁癥

世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)顯示，截至2017年，全球各年齡階段約超過(guò)3.5億人患有抑郁癥［1］，發(fā)展中國(guó)家的抑郁癥患病率更甚［2-3］。妊娠期是女性特殊的生理時(shí)期，由于體內(nèi)激素、免疫系統(tǒng)和生物節(jié)律等生理變化以及社會(huì)角色的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致妊娠期抑郁癥發(fā)病率是普通人群的兩倍，女性在妊娠期間的首次患病率約為7.5%，抑郁癥復(fù)發(fā)者約占12%［4］。氟西?。╢luoxetine，F(xiàn)XT）作為中國(guó)抑郁障礙防治指南推薦的一線(xiàn)抗抑郁藥，大量研究表明妊娠期服用FXT并無(wú)致畸作用［5-7］，但是近年來(lái)有部分回顧性研究指出，妊娠期使用FXT可能造成胎兒早產(chǎn)、心臟畸形或神經(jīng)發(fā)育遲緩等風(fēng)險(xiǎn)［8-10］，可見(jiàn)，F(xiàn)XT在妊娠期使用的安全性仍存在爭(zhēng)議。

胎盤(pán)是母體與胎兒之間進(jìn)行物質(zhì)交換的重要場(chǎng)所，亦是胎兒的第一道屏障。胎盤(pán)主要由羊膜、葉狀絨毛膜和底蛻膜構(gòu)成，其主體部分為葉狀絨毛膜，葉狀絨毛膜從外層到內(nèi)層分別是滋養(yǎng)層、結(jié)締組織及胎兒毛細(xì)血管。妊娠初期，胎盤(pán)中含有大量滋養(yǎng)層細(xì)胞，隨著妊娠的發(fā)展，滋養(yǎng)層細(xì)胞逐漸融合形成合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞，合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞是構(gòu)成胎盤(pán)屏障的主要組成部分，其細(xì)胞膜表達(dá)了大量的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的定位受合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞極化生長(zhǎng)影響而分布在母體側(cè)或者子體側(cè)。合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞母體側(cè)的刷狀絨毛膜上主要表達(dá)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC），又稱(chēng)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞所表達(dá)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一［8-10］。P-gp底物譜廣泛，包括臨床上常用的HIV蛋白酶抑制劑、抗抑郁藥和抗癲癇藥等藥物以及具有致畸作用的乙醇、尼古丁等環(huán)境毒物［11］。P-gp可將其底物從合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞泵出，外排至母體循環(huán)，從而減少有關(guān)物質(zhì)對(duì)胎兒的暴露，起到保護(hù)胎兒的作用；P-gp功能異常則可能增加其底物在胎兒側(cè)的暴露量，增加安全性風(fēng)險(xiǎn)。多項(xiàng)研究表明妊娠早期胎盤(pán)上P-gp蛋白表達(dá)量顯著高于妊娠晚期甚至到40倍以上［12］。妊娠早期是胚胎器官分化及發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，因此P-gp的功能與胚胎暴露于藥物或環(huán)境毒物等危險(xiǎn)因素密切相關(guān)。課題組前期應(yīng)用體外人類(lèi)胎盤(pán)灌注模型研究發(fā)現(xiàn)FXT可以透過(guò)胎盤(pán)屏障（與國(guó)外小樣本體內(nèi)研究結(jié)果一致），那么長(zhǎng)期服用FXT是否會(huì)改變胎盤(pán)P-gp功能目前尚不清楚。因此，通過(guò)研究FXT對(duì)胎盤(pán)轉(zhuǎn)運(yùn)能力的影響，可為妊娠期服用FXT的安全性評(píng)估提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)對(duì)臨床妊娠期抑郁癥患者開(kāi)展藥物治療具有重要的指導(dǎo)意義。

材料和方法

1　材料

1.1胎盤(pán)組織由昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科提供，胎盤(pán)在獲取前經(jīng)由產(chǎn)婦及其家屬知情同意，并簽署胎盤(pán)處置告知書(shū)。選取足月（37～41周）自然分娩或剖宮產(chǎn)娩出的新鮮健康胎盤(pán)，排除需進(jìn)行病理學(xué)檢查、產(chǎn)婦自留、產(chǎn)婦有基礎(chǔ)疾病且放置時(shí)間過(guò)久（放置時(shí)間>1 h）的胎盤(pán)。收集的胎盤(pán)立即放入4 ℃含1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B（penicillin-streptomycin-amphotericin B solution，PSN）混合液的生理鹽水中，并在0.5 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)胞提取。

1.2試劑及儀器DMEM/high glucose（HyClone）；胰蛋白酶、PSN溶液、小牛血清（Gibco）；DNaseI酶（Sigma）；胎牛血清（BI）；Percoll分離液（GE Healthcare Bio-Sciences）。生物安全柜（中國(guó)山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）；Water-Jacketed二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo）；倒置顯微鏡DMi1（Leica）；酶標(biāo)儀（Molecular Devices）；高速低溫離心機(jī)（Eppendorf）；臺(tái)式離心機(jī)（中國(guó)上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）。

2　方法

2.1滋養(yǎng)層細(xì)胞提取在無(wú)菌操作臺(tái)中，將胎盤(pán)剪成2～3 cm3的小塊狀，無(wú)菌手術(shù)剪去除組織的蛻膜、羊膜、血管及血塊，生理鹽水反復(fù)沖洗組織至表面呈淡粉色，隨后，載玻片刮取組織至肉糜狀，再次去除其中血塊、血管及鈣化部分，取120 g肉糜狀組織，加入150 mL含1% PSN、胰酶以及DNase I的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃水浴搖床中進(jìn)行第1次消化，時(shí)間為20 min，消化后的肉糜組織用350目網(wǎng)篩過(guò)濾，棄去第1次消化液，保留濾渣，加入150 mL上述消化液進(jìn)行第2次消化（20 min），然后用350目網(wǎng)篩過(guò)濾，保留消化液并加入小牛血清以終止消化，消化液在常溫狀態(tài)以1 260×離心15 min，棄去上清液并加入含1% PSN、10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基（即完全培養(yǎng)基）重懸細(xì)胞。

2.2滋養(yǎng)層細(xì)胞分離純化采用Percoll連續(xù)密度梯度分離法進(jìn)行細(xì)胞分離，在50 mL離心管中緩慢的依次加入5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%和65%共13個(gè)密度梯度的Percoll溶液，每個(gè)濃度3 mL。將細(xì)胞懸液緩慢加至Percoll分離液上，常溫狀態(tài)1 340離心20 min，取離心管20%～30%位置（即密度為1.04～1.06 g/mL）的云霧狀細(xì)胞（即滋養(yǎng)層細(xì)胞）轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入適量完全培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，室溫狀態(tài)1 200 r/min離心5 min，棄去上清液，加5 mL完全培養(yǎng)基將所得細(xì)胞充分混勻，隨后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按照2×109/L種于6孔板，置于細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)。

2.3滋養(yǎng)層細(xì)胞鑒定（1）免疫組化分析檢測(cè)細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的標(biāo)志物E-鈣粘蛋白（E-cadherin）和細(xì)胞角蛋白7（cytokeratin-7）［4，9］：在細(xì)胞培養(yǎng)4 h及72 h時(shí)，取出置于6孔板中的細(xì)胞爬片，冰PBS清洗3次，在4%多聚甲醛中固定15 min，0.1%Triton X-100孵育20 min，加入含5% BSA的PBS孵育細(xì)胞1 h以阻斷可能存在的非特異性染色。隨后，分別加入鼠抗人cytokeratin-7及鼠抗人E-cadherin單克隆抗體在4 ℃孵育過(guò)夜。PBS清洗細(xì)胞3次，加入生物素標(biāo)記的Ⅱ抗并在37 ℃孵育1 h，PBS清洗后，DAB顯色，蘇木精復(fù)染并用乙醇脫水，晾干封固，鏡下觀(guān)察并拍照。（2）滋養(yǎng)層細(xì)胞功能分化的主要標(biāo)志物人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）［11］含量的測(cè)定：分別在12 h、24 h、36 h、48 h及60 h取出6孔板內(nèi)的培養(yǎng)基，將其送至昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科進(jìn)行分析測(cè)定。

2.4滋養(yǎng)層細(xì)胞P-gp功能的評(píng)估應(yīng)用P-gp特異性底物羅丹明123在加或不加抑制劑情況下進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)，以考查滋養(yǎng)層細(xì)胞中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。將提取的滋養(yǎng)層細(xì)胞以1×108/L接種到96孔板中培養(yǎng)72 h，預(yù)熱HBSS清洗細(xì)胞2次，再孵育細(xì)胞15 min以排除培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞可能產(chǎn)生的影響。隨后，加入P-gp抑制劑維拉帕米（0、2.5、5和10 μmol/L）預(yù)孵育0.5 h，再加入羅丹明123（1、2和5 μmol/L）于37 ℃、5% CO2孵箱中孵育90 min，冰PBS清洗細(xì)胞2次以終止反應(yīng)，加入100 μL裂解液（1% Triton X-100）裂解細(xì)胞后進(jìn)行熒光測(cè)定。

2.5FXT對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞P-gp功能的影響根據(jù)FXT血藥濃度峰值確定了使用低、中、高（200 μg/L、600 μg/L和1 800 μg/L）共3個(gè)濃度的FXT孵育滋養(yǎng)層細(xì)胞，分別孵育0.5 h、48 h和72 h。待孵育結(jié)束后，再加入最適濃度P-gp底物羅丹明123孵育90 min，棄去廢液，冰PBS清洗細(xì)胞2次，隨后每孔加入1% Triton X-100裂解液100 μL裂解細(xì)胞后進(jìn)行熒光測(cè)定。

2.6FXT對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞P-gp蛋白表達(dá)的影響使用200、600和1 800 μg/L共3個(gè)濃度的FXT孵育滋養(yǎng)層細(xì)胞，分別孵育0.5 h和48 h。待孵育結(jié)束，每孔加入150 μL RIPA裂解液進(jìn)行裂解，收集上清液進(jìn)行蛋白定量及Western blot實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)滋養(yǎng)層細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp蛋白的表達(dá)。

2.7FXT對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞P-gp轉(zhuǎn)錄水平的影響利用RT-qPCR技術(shù)對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp的mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，引物見(jiàn)表1。

表1　RT-qPCR引物

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0作圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用雙因素方差分析（two-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)

鏡下觀(guān)察所提取的滋養(yǎng)層細(xì)胞，培養(yǎng)4 h后可見(jiàn)均一、圓形的單核細(xì)胞開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)；培養(yǎng)72 h后可見(jiàn)單核細(xì)胞融合為多核的合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞并連接成片生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Microscopic observation of primary trophoblast cells. After cultured for 72 h，the cytotrophoblasts consistently transformed into syncytiotrophoblasts.

2　免疫組化細(xì)胞鑒定

由圖2可見(jiàn)，與培養(yǎng)4 h的細(xì)胞相比，培養(yǎng)72 h的滋養(yǎng)層細(xì)胞基本分化為合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞，E-cadherin定位于合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，cytokeratin-7則多分布于合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)部。

Figure 2.Expression of E-cadherin and cytokeratin-7 on the surface of isolated trophoblast cells. Representative images （×200） of E-cadherin or cytokeratin-7 （red） in the syncytiotrophoblasts after 4 h and 72 h of culture were showed.

3　hCG含量的測(cè)定

收集12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)基上清液檢測(cè)hCG含量，結(jié)果顯示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，hCG含量逐漸升高，可確定所提取的細(xì)胞為合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Secretion of hCG by cultured trophoblasts at different time points. The hCG was concomitant with increasing numbers of syncytiotrophoblasts. Mean±SD. n=3.

4　外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp的功能驗(yàn)證

使用P-gp的特異性底物羅丹明123和抑制劑維拉帕米進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的驗(yàn)證并確定不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的最適底物濃度和抑制劑濃度，結(jié)果見(jiàn)圖4。

當(dāng)羅丹明123濃度為1和2 μmol/L時(shí)，隨著維拉帕米濃度的升高，細(xì)胞內(nèi)羅丹明123含量逐漸增加，表明P-gp外排轉(zhuǎn)運(yùn)功能受到抑制，所提取滋養(yǎng)層細(xì)胞的P-gp外排功能正常；當(dāng)羅丹明123濃度為5 μmol/L時(shí)，隨著維拉帕米濃度升高細(xì)胞內(nèi)羅丹明123未出現(xiàn)明顯升高的趨勢(shì)，推測(cè)底物在該濃度下已過(guò)飽和。因此羅丹明123最適濃度為1 μmol/L，維拉帕米最適濃度為10 μmol/L（<0.01）。

Figure 4.Verification of P-gp transplacental capability. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs 0μmol/L verapamil group.

5　FXT對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞P-gp功能的影響

低、中、高濃度FXT與滋養(yǎng)層細(xì)胞共孵育0.5 h、48 h和72 h后，應(yīng)用羅丹明123進(jìn)行細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)以評(píng)估轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比，中濃度FXT干預(yù)48 h后細(xì)胞內(nèi)羅丹明123顯著性升高（<0.05），表明在FXT的干預(yù)下P-gp外排功能受到抑制，見(jiàn)圖5。

Figure 5.The effect of FXT on transporter fuction of P-gp in primary human trophoblast cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs0 μg/L FXT group.

6　FXT對(duì)P-gp蛋白表達(dá)和mRNA水平的影響

低、中、高濃度FXT與滋養(yǎng)層細(xì)胞共孵育0.5 h和48 h后，分析P-gp的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平的變化，結(jié)果見(jiàn)圖6。

（1）與空白對(duì)照組相比，F(xiàn)XT干預(yù)0.5 h后，P-gp蛋白的表達(dá)水平隨FXT濃度的升高而升高，其中低濃度組與高濃度組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P-gp的mRNA水平隨FXT濃度升高而先升高后降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。與空白對(duì)照組相比，高濃度FXT干預(yù)48 h后，P-gp蛋白的表達(dá)水平隨FXT濃度的升高而顯著性降低（<0.01）；P-gp的mRNA轉(zhuǎn)錄水平隨FXT濃度升高先升高后降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，見(jiàn)圖6。

Figure 6.Relative protein （A and B） and mRNA （C and D） expression levels of P-gp after FXT intervention for 0.5 h （A and C） or for 48 h （B and D）. Mean±SD. n=5. *P<0.05，**P<0.01 vs 0 μg/L FXT group.

討論

妊娠期抑郁癥輕者易引起妊娠劇吐、自發(fā)性流產(chǎn)、產(chǎn)后出血等并發(fā)癥［5］，重者可能增加產(chǎn)婦的自殺風(fēng)險(xiǎn)［6］；另一方面，抑郁情緒亦可能對(duì)胎兒產(chǎn)生影響，導(dǎo)致胎兒早產(chǎn)、新生兒低出生體重［7-9］以及影響學(xué)前初期孩童大腦神經(jīng)的發(fā)育［10］。因此，妊娠期抑郁癥的治療顯得尤為重要。妊娠期抑郁癥常使用的治療方法包括心理治療、藥物治療和物理療法等。對(duì)于輕度妊娠期抑郁患者而言可首選心理治療。原發(fā)中重度妊娠期抑郁癥患者或懷孕前已在使用藥物治療的抑郁癥患者則首選藥物治療合并心理療法作為治療方案。藥物治療可以顯著改善中重度妊娠期抑郁患者的癥狀，其有效率可達(dá)60%～70%［11］。氟西汀是目前妊娠期抗抑郁治療中使用較多的藥物之一［12-14］，但其妊娠安全性尚存在爭(zhēng)議［15-18］。

P-gp是胎盤(pán)合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞上表達(dá)較多的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一，P-gp底物譜廣，包括各種藥物及環(huán)境毒物等，其可將底物外排至母體側(cè)。在妊娠早期也就是發(fā)育敏感期，P-gp在合胞體滋養(yǎng)層的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于妊娠晚期，因此，P-gp的功能在一定程度上與胎盤(pán)的功能及子代安全性密切相關(guān)。針對(duì)合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞相關(guān)研究的細(xì)胞類(lèi)型有原代培養(yǎng)滋養(yǎng)層細(xì)胞和BeWo、JAR及JEG-3等細(xì)胞系，細(xì)胞系來(lái)源于癌細(xì)胞且P-gp的表達(dá)量較低，幾乎都不表達(dá)［19］。因此，本研究采用原代合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞開(kāi)展研究。原代合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞提取效率受多種因素影響，本研究應(yīng)用Percoll連續(xù)密度梯度分離法［20］提取分離合胞體滋養(yǎng)層細(xì)胞，并通過(guò)胎盤(pán)篩選等方法大大提高了細(xì)胞提取分離效率及細(xì)胞活性。首先，在選取胎盤(pán)時(shí)，將妊娠女性生理狀況、飲食習(xí)慣和基礎(chǔ)疾病等情況考慮在內(nèi)，排除體重指數(shù)異常、患有基礎(chǔ)疾病及未能正常膳食等妊娠女性的胎盤(pán)，以提高滋養(yǎng)層細(xì)胞的提取效率及活性；其次，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胎盤(pán)分娩后0.5 h內(nèi)且放置時(shí)間不超過(guò)1 h的新鮮胎盤(pán)，其細(xì)胞提取效率和活性比分娩后長(zhǎng)時(shí)間放置的更高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)FXT低中高濃度與胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞共孵育0.5 h后，P-gp的mRNA和蛋白表達(dá)水平均有升高趨勢(shì)，其原因可能為：短期的FXT暴露，細(xì)胞出于自我保護(hù)機(jī)制逐漸上調(diào)P-gp mRNA的表達(dá)來(lái)增加蛋白的外排作用，從而減少外源性物質(zhì)的暴露［21］。但隨時(shí)間增加，特別是在48 h高濃度組中P-gp的mRNA轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達(dá)均受到抑制。進(jìn)一步對(duì)P-gp的功能進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間暴露于FXT后胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的水平顯著升高，表明其功能受到抑制，該結(jié)果與mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)水平一致。在發(fā)育敏感期的妊娠早期，胎盤(pán)高表達(dá)P-gp有助于減少胚胎外源性物質(zhì)的暴露達(dá)到保護(hù)胚胎正常發(fā)育的目的。目前，在胎盤(pán)上進(jìn)行FXT對(duì)P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)功能影響的研究較少，僅有部分血腦屏障上的研究表明FXT可輕度抑制血腦屏障上P-gp的功能［22］。P-gp轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平受多種核受體及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，包括孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）和雌激素受體等。PXR是配體依賴(lài)性轉(zhuǎn)錄因子，其結(jié)構(gòu)包括配體結(jié)合域和DNA結(jié)合域，當(dāng)配體與PXR結(jié)合后，復(fù)合物可與視黃醛X受體結(jié)合，之后形成的異二聚體可調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)［23］。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XT可下調(diào)PXR的表達(dá)，并在轉(zhuǎn)錄水平抑制PXR［24］。由此推測(cè)FXT可能通過(guò)影響PXR的表達(dá)從而抑制P-gp的功能；此外，雌二醇可通過(guò)與雌二醇β受體結(jié)合影響P-gp的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)［25］，而部分動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)FXT可通過(guò)5-羥色胺-雌激素系統(tǒng)降低體內(nèi)雌二醇水平，因此FXT亦可能通過(guò)5-羥色胺-雌二醇系統(tǒng)影響P-gp的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)及功能［26］。

因此，根據(jù)本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知妊娠期長(zhǎng)時(shí)間暴露于FXT可能改變胎盤(pán)屏障上外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，從而帶來(lái)妊娠安全性風(fēng)險(xiǎn)。

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Establishment of human placental trophoblasts cell transport model and influence of fluoxetine on P-gp function in placenta

WANG Jing-jing1，MA Wen-ting1，WANG Xi1，WANG Dan2，MA Cui3，ZHANG Jun1△

（1，，650032，；2，，650032，；3，，650032，）

To establish a placental transport model with primary human placental trophoblasts （hereinafter referred to as "trophoblast cells"） and investigate the influence of fluoxetine （FXT） on the function of P-glycoprotein （P-gp） during pregnancy and the transporter involved.The primary human placenta trophoblast cells were isolated and validated by morphological observation and immunocytochemical staining. Rhodamine 123，the specific substrates were used to assess the functions of P-gp and to find out the optimal concentrations of substrate and inhibitor. A serials concentration of FXT were incubated with trophoblast cells for 0.5 h，48 h and 72 h and then the function of P-gp and BCRPwere assessed with specific substrate uptake assay.The function of P-gp was conducted with specific substrate and inhibitor. For P-gp the optimal concentration of substrate was 1 μmol/L and the optimal concentration of inhibitors was 10 μmol/L. The cellular accumulation of Rhodamine123 in trophoblast cells was significantly increased after incubation FXT for 0.5 h，48 h and 72 h（<0.05）. FXT significantly inhibited the trans-placental transport of P-gp and BCRP. The protein expression of P-gp was significantly downregulated in the presence of FXT （<0.05）.The exposure of FXT may inhibit the expression and function of P-gp.

Human placental trophoblasts； Fluoxetine； P-glycoprotein； Depression

R329.21+1； R749.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.02.016

1000-4718（2022）02-0318-07

2021-08-09

2021-12-24

［基金項(xiàng)目］云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)研究聯(lián)合專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目［No. 2018FE001（-167）； No. 2018FE001（-207）； No. 2019FE001（-208）］；云南省高層次衛(wèi)生計(jì)生技術(shù)人才培養(yǎng)專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助（No. H-2017050）

Tel： 0871-65324888-2550； E-mail： zhangjunyang@126.com

（責(zé)任編輯：宋延君，余小慧）