20（S）-人參皂苷Rg3抑制人急性單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞遷移和侵襲*

蘭金劍， 高瑞蘭， 趙燕娜， 馬閃閃， 王博林， 沈鳳麟， 余瀟苓

20（S）-人參皂苷Rg3抑制人急性單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞遷移和侵襲*

蘭金劍， 高瑞蘭， 趙燕娜， 馬閃閃， 王博林， 沈鳳麟， 余瀟苓△

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310006）

觀察低極性20（S）-人參皂苷Rg3（S-Rg3）體外抑制人急性單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞遷移和侵襲的作用。將不同濃度（0、20、40和80 mg/L）的S-Rg3加入THP-1細(xì)胞培養(yǎng)體系，Transwell小室檢測S-Rg3抑制細(xì)胞遷移的作用。采用免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫熒光、Western blot和RT-qPCR等多種方法，檢測S-Rg3對(duì)THP1細(xì)胞黏附、遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響及其相關(guān)機(jī)制。S-Rg3能有效地抑制THP-1細(xì)胞遷移，下調(diào)黏附相關(guān)蛋白N-cadherin，遷移相關(guān)蛋白C-X-C趨化因子受體4（CXCR4）和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（SDF-1），以及侵襲相關(guān)蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）的表達(dá)，但上調(diào)抑制遷移侵襲相關(guān)蛋白E-cadherin金屬蛋白酶組織抑制物1（TIMP1）和TIMP3表達(dá)，同時(shí)下調(diào)CXCR4 mRNA表達(dá)，上調(diào)E-cadherin和TIMP1 mRNA表達(dá)，呈劑量依賴性。此外，S-Rg3降低PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白激酶的磷酸化水平。S-Rg3能有效抑制人急性單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞的遷移和侵襲，其機(jī)制可能與降低細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白激酶的磷酸化水平有關(guān)。

20（S）-人參皂苷Rg3；THP-1細(xì)胞；細(xì)胞遷移；細(xì)胞侵襲；PI3K/AKT信號(hào)通路

白血病是一類造血組織的惡性克隆性疾病，急性單核細(xì)胞白血病髓外侵襲的發(fā)生率約20%～40%，可出現(xiàn)在腦組織、肝、脾、淋巴結(jié)、皮膚和齒齦等，是最嚴(yán)重的并發(fā)癥和主要死亡原因之一［1］，目前尚無有效的治療手段，因此很有必要尋找安全有效抗髓外侵襲的中藥及其有效部位和成分。研究顯示，人參皂苷Rg3可抑制B16黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移，降低B16細(xì)胞侵襲力，并明顯延長荷瘤小鼠的生存期［2］。文獻(xiàn)報(bào)道中成藥參一膠囊［含20（R）-人參皂苷Rg3］的研究較多，該藥能有效抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的黏附和侵襲能力［3］。然而，有關(guān)20（S）-人參皂苷Rg3（S-Rg3）的報(bào)道很少，S-Rg3抑制單核細(xì)胞白血病細(xì)胞遷移和侵襲的作用及其可能的機(jī)制未見報(bào)道。本項(xiàng)工作以人急性單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞為靶細(xì)胞，觀察S-Rg3抑制單核細(xì)胞白血病細(xì)胞遷移和侵襲的作用。

材料和方法

1　實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及藥物

THP-1細(xì)胞由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液病研究所提供。S-Rg3購自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，經(jīng)核磁共振譜、質(zhì)譜、紅外光譜和紫外吸收光譜鑒定其結(jié)構(gòu)，純度>98%，分子式為C42H72O13，分子量為785.02。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)THP-1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中，隔天換液1次，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2Transwell小室檢測細(xì)胞遷移能力收集THP-1細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×108/L，分別加入0、10、20、40和80 mg/L的S-Rg3，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育2 d。用無血清的RPMI-1640過夜饑餓24 h，調(diào)整各組細(xì)胞濃度為5×105/L，取200 μL細(xì)胞懸液接種于小室，24孔板下室中加入600 μL含15%新生牛血清的IMDM，置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去小室內(nèi)培養(yǎng)液，將小室置于800 μL 4%多聚甲醛的孔中室溫固定20 min，隨后加入結(jié)晶紫染液，染色后顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)隨機(jī)視野的細(xì)胞數(shù)量，取其平均值。

2.3免疫細(xì)胞化學(xué)法用0、20、40和80 mg/L的S-Rg3處理THP-1細(xì)胞2 d，收集細(xì)胞，細(xì)胞懸液經(jīng)離心涂片機(jī)制成細(xì)胞涂片，4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100破膜。加Ⅰ抗，置于4 ℃孵育過夜，加Ⅱ抗工作液，37 ℃孵育30 min，DAB顯色10 min。用蘇木精復(fù)染，中性樹脂封片。鏡下觀察棕褐色陽性反應(yīng)的細(xì)胞，陽性程度判斷標(biāo)準(zhǔn)采用ImageJ軟件分析。

2.4免疫熒光法0、20、40和80mg/L的S-Rg3處理THP-1細(xì)胞2 d，收集細(xì)胞，細(xì)胞懸液經(jīng)離心涂片機(jī)制片，4%多聚甲醛固定，0.5% TritonX-100破膜。加Ⅰ抗，置于4 ℃孵育過夜，加熒光Ⅱ抗，37 ℃孵育1 h。用含DAPI染料封片劑封片，用熒光顯微鏡（×630）觀察細(xì)胞。陽性程度判斷標(biāo)準(zhǔn)采用ImageJ軟件分析。

2.5Western blot法0、20、40和80 mg/L的S-Rg3處理THP-1細(xì)胞2 d，收集細(xì)胞，加入裂解液提取細(xì)胞總蛋白。每孔加樣40 μg總蛋白，經(jīng)10% SDS-PAGE分離，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至NC膜上，室溫下用5% BSA封閉1 h，分別加p-PI3K、p-AKT、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和C-X-C趨化因子受體4（C-X-C chemokine receptor 4，CXCR4）等Ⅰ抗（Cell Signaling Technology），4 ℃孵育過夜，加Ⅱ抗，室溫孵育1 h，ECL發(fā)光劑顯影。采用使用ImageJ軟件分析特異性條帶的灰度值。

2.6RT-qPCR法0、20、40和80 mg/L的S-Rg3處理THP-1細(xì)胞2 d，收集細(xì)胞，Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別采用特異性引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。內(nèi)參照β-actin的上游引物序列為5′-CATCAAGGAGAAACTGTGT-3′，下游引物序列為5′-AGGCAACTCGTAACTCTT-3′；TIMP1的上游引物序列為5′-CTTCTGCAATTCCGACCTCGT-3′，下游引物序列為5′-ACGCTGGTATAAGGTGGTCTG-3′；E-cadherin的上游引物序列為5′-CGAGAGCTACACGTTCACGG-3′，下游引物序列為5′-GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′；CXCR4的上游引物序列為5′-ACTACACCGAGGAAATGGGCT-3′，下游引物序列為5′-CCCACAATGCCAGTTAAGAAGA-3′。PCR條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　S-Rg3抑制THP-1細(xì)胞遷移

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，S-Rg3處理THP-1細(xì)胞2 d后，小劑量10 mg/L組遷移細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比無顯著差異，而20、40和80 mg/L組遷移細(xì)胞數(shù)顯著低于對(duì)照組，抑制率約為10.5%～43.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.01），見圖1。

Figure 1.The inhibitory effect of S-Rg3 on the migration of THP-1 cells detected by Transwell migration assay. A： control （0 mg/L S-Rg3） group； B： 10 mg/L S-Rg3 group； C： 20 mg/L S-Rg3 group； D： 40 mg/L S-Rg3 group； E： 80 mg/L S-Rg3 group. Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs A.

2　S-Rg3調(diào)控黏附相關(guān)蛋白的表達(dá)

經(jīng)20、40和80 mg/L的S-Rg3處理2 d，免疫熒光染色結(jié)果顯示THP-1細(xì)胞表達(dá)E-cadherin蛋白的熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組（<0.01），見圖2；免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，S-Rg3處理細(xì)胞后，N-cadherin蛋白的陽性反應(yīng)顯著低于對(duì)照組（<0.01），見圖3。

Figure 2.Effect of S-Rg3 on the protein expression of CXCR4 and E-cadherin in THP-1 cells detected by immunofluorescence （scale bar=50 μm）. A1 to A6： control （0 mg/L S-Rg3） group； B1 to B6： 20 mg/L S-Rg3 group； C1 to C6： 40 mg/L S-Rg3 group； D1 to D6： 80 mg/L S-Rg3 group. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs control （0 mg/L S-Rg3） group.

Figure 3.Effect of S-Rg3 on the protein levels of CXCR4，N-cadherin，p-AKT and SDF-1 in THP-1 cells detected by immunocytochemistry （scale bar=50 μm）. A1 to A4： control （0 mg/L S-Rg3） group； B1 to B4： 20 mg/L S-Rg3 group； C1 to C4： 40 mg/L S-Rg3 group； D1 to D4： 80 mg/L S-Rg3 group. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs control （0 mg/L S-Rg3） group.

3　S-Rg3下調(diào)遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)

經(jīng)20、40和80 mg/L的S-Rg3處理2 d，免疫熒光染色結(jié)果顯示THP-1細(xì)胞表達(dá)CXCR4蛋白的熒光強(qiáng)度顯著低于對(duì)照組（<0.01），見圖2；免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，THP-1細(xì)胞表達(dá)SDF-1蛋白的陽性反應(yīng)顯著低于對(duì)照組（<0.01），見圖3。

Western blot結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果一致，經(jīng)20、40和80 mg/L的S-Rg3處理2 d，CXCR4蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組（<0.01），見圖4。

Figure 4.Effect of S-Rg3 on the protein levels of MMP2，CXCR4，p-PI3K and p-AKT in THP-1 cells detected by Western blot.A： control （0 mg/L S-Rg3） group； B： 20 mg/L S-Rg3 group； C： 40 mg/L S-Rg3 group； D： 80 mg/L S-Rg3 group. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs A.

4　S-Rg3調(diào)控侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)

經(jīng)20、40和80 mg/L的S-Rg3處理2 d，免疫熒光染色結(jié)果顯示THP-1細(xì)胞表達(dá)TIMP1和TIPM3蛋白的熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組（<0.01），見圖5；而表達(dá)MMP2蛋白的熒光強(qiáng)度則顯著低于對(duì)照組（<0.01），見圖6。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，S-Rg3處理細(xì)胞后，TIMP1和TIPM3蛋白表達(dá)的陽性程度顯著高于對(duì)照組（<0.01），見圖7。

Figure 5.Effect of S-Rg3 on the protein expression of TIMP1 and TIMP3 in THP-1 cells detected by immunofluorescence （scale bar=50 μm）. A1 to A6： control （0 mg/L S-Rg3） group； B1 to B6： 20 mg/L S-Rg3 group； C1 to C6： 40 mg/L S-Rg3 group； D1 to D6： 80 mg/L S-Rg3 group. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs control （0 mg/L S-Rg3） group.

Figure 6.Effect of S-Rg3 on the protein expression of MMP2 in THP-1 cells detected by immunofluorescence （scale bar=50 μm）. A1 to A3： control （0 mg/L S-Rg3） group； B1 to B3： 20 mg/L S-Rg3 group； C1 to C3： 40 mg/L S-Rg3 group； D1 to D3： 80 mg/L S-Rg3 group. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs control （0 mg/L S-Rg3） group.

Figure 7.Effect of S-Rg3 on the protein expression of TIMP1 and TIMP3 in THP-1 cells detected by immunocytochemical staining （scale bar=50 μm）. A1 and A2： control （0 mg/L S-Rg3） group； B1 and B2： 20 mg/L S-Rg3 group； C1 and C2： 40 mg/L S-Rg3 group； D1 and D2： 80 mg/L S-Rg3 group. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs control （0 mg/L S-Rg3） group.

Western blot結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果一致，經(jīng)20、40和80 mg/L的S-Rg3處理2 d，MMP2蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照組（<0.01），見圖4。

5　S-Rg3降低PI3K和AKT的磷酸化水平

免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，經(jīng)20、40和80 mg/L的S-Rg3處理2 d，THP-1細(xì)胞中p-AKT蛋白的陽性反應(yīng)顯著低于對(duì)照組（<0.01），見圖3。

Western blot結(jié)果顯示，經(jīng)20、40和80 mg/L的S-Rg3處理2 d，THP-1細(xì)胞中p-AKT和p-PI3K蛋白水平顯著低于對(duì)照組（<0.01），見圖4。

6S-Rg3調(diào)控遷移和侵襲相關(guān)mRNA的表達(dá)

RT-qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，20、40和80 mg/L的S-Rg3處理2 d，THP-1細(xì)胞CXCR4的mRNA表達(dá)水平顯著降低（<0.01），而TIMP1和E-cadherin的mRNA表達(dá)水平顯著升高（<0.01），見圖8。

Figure 8.Effect of S-Rg3 on the mRNA expression of CXCR4 （A），E-cadherin （B） and TIMP1 （C） in THP-1 cells detected by RT-PCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs control （0 mg/L S-Rg3） group.

討論

低極性人參皂苷S-Rg3是從中藥人參中分離出多種人參皂苷單體成分之一。低極性人參皂苷是指含有2個(gè)以上糖的原生苷，經(jīng)水解失去部分糖而得到的苷，在人參屬植物中含量低，文獻(xiàn)報(bào)道此成分具有抗腫瘤的活性。在腸癌、胃癌、肺癌及乳腺癌等多種腫瘤研究中，人參皂苷Rg3具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制遷移和侵襲等抗腫瘤作用［4-5］。人參皂苷Rg3可以通過調(diào)控caspase-8及PARP相關(guān)蛋白的表達(dá)而激活及誘導(dǎo)凋亡過程，并通過下調(diào)p-AKT蛋白水平而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用［6］。但S-Rg3抗單核細(xì)胞白血病細(xì)胞黏附、遷移和侵襲的作用尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果提示S-Rg3具有抑制THP-1單核細(xì)胞白血病細(xì)胞遷移及侵襲的作用。

急性單核細(xì)胞白血病常發(fā)生髓外侵襲，受細(xì)胞因子嚴(yán)格調(diào)控，包括白血病細(xì)胞的趨化、黏附、遷移和降解基質(zhì)等多個(gè)環(huán)節(jié)，與SDF-1/CXCR4、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、黏附分子（E-cadherin/N-cadherin）等有關(guān)。SDF-1/CXCR4參與調(diào)控白血病細(xì)胞的趨化、遷移及侵襲等環(huán)節(jié)［7］，MMPs與白血病細(xì)胞的降解基質(zhì)密切相關(guān)［8］，黏附分子參與白血病細(xì)胞的黏附、遷移等多個(gè)生物活性［9］。有文獻(xiàn)報(bào)道白血病細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)喪失，引起細(xì)胞黏附能力降低，增殖能力增強(qiáng)［10］；急性白血病患者腦脊液E-cadherin的表達(dá)與白血病腦侵襲的發(fā)生密切相關(guān)［11］。研究表明，N-cadherin可以促進(jìn)體內(nèi)白血病細(xì)胞的骨髓歸巢、植入和自我更新［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示S-Rg3作用于THP-1細(xì)胞后，可上調(diào)E-cadherin蛋白，但下調(diào)N-cadherin蛋白的表達(dá)，提示S-Rg3具有抑制THP-1細(xì)胞的黏附和遷移的作用。

SDF-1為趨化因子家族成員，已被證實(shí)參與造血干細(xì)胞的增殖及歸巢，通過與CXCR4結(jié)合，參與許多惡性腫瘤細(xì)胞的存活，局部侵襲及轉(zhuǎn)移，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用［13-14］。有研究顯示，降低白血病細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)水平，可以減弱白血病細(xì)胞的遷移能力［15］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示S-Rg3作用于THP-1細(xì)胞后，可下調(diào)SDF-1和CXCR4其蛋白表達(dá)，提示S-Rg3具有抑制THP-1細(xì)胞的遷移和侵襲作用。

MMPs為一種鋅依賴的內(nèi)蛋白酶，屬于細(xì)胞外基質(zhì)降解酶家族，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)的胞外水解酶，其中起主要作用的是MMP2和MMP9。TIMPs是MMPs的主要生理性抑制因子，其功能涉及抑制MMPs家族成員的活性［16］。已有研究表明，白血病細(xì)胞生成的MMP2，為其髓外侵襲發(fā)揮作用［17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示S-Rg3作用于THP-1細(xì)胞后，可上調(diào)TIMP1和TIMP3的mRNA及蛋白表達(dá)水平，并抑制MMP2蛋白的表達(dá)，提示S-Rg3可通過調(diào)控TIMP1、TIMP3和MMP2蛋白而抑制THP-1細(xì)胞的侵襲。

在腫瘤組織中PI3K和AKT是調(diào)控細(xì)胞生長、分化、侵襲和遷移的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［18-19］。另有報(bào)道PI3K和AKT與白血病細(xì)胞的侵襲和遷移能力相關(guān)［20］。AKT是PI3K下游最重要的靶蛋白，PI3K發(fā)生磷酸化（p-PI3K）可促進(jìn)AKT活化，活化的AKT可在細(xì)胞漿中發(fā)生磷酸化反應(yīng)而傳遞生物學(xué)信號(hào)，從而參與細(xì)胞增殖、周期、侵襲等生理過程［21］。鑒于磷酸化是蛋白激酶發(fā)揮其功能的活性狀態(tài)，本研究顯示S-Rg3通過下調(diào)PI3K和AKT的磷酸化水平而抑制THP-1細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，我們的研究表明人參皂苷S-Rg3具有抑制人急性單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞黏附、遷移和侵襲的作用，其機(jī)制與下調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)PI3K和AKT蛋白的磷酸化水平有關(guān)。但S-Rg3是否通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路而發(fā)揮抑制THP-1細(xì)胞黏附、遷移和侵襲的作用，尚待深入研究。

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Inhibitory effect of 20(S)-ginsenoside Rg3on migration and invasion of human acute monocytic leukemia THP-1 cells

LAN Jin-jian，GAO Rui-lan，ZHAO Yan-na，MA Shan-shan，WANG Bo-lin，SHEN Feng-lin，YU Xiao-ling△

（，310006，）

To observe the effect of low-polarity 20（S）-ginsenoside Rg3（S-Rg3） on the migration and invasion of human acute monocytic leukemia THP-1 cells.The THP-1 cells were treated with various concentrations （0，20，40 and 80 mg/L） of S-Rg3. The cell migration was detected by Transwell assay. Immunocytochemistry，immunofluorescence，Western blot and RT-qPCR were used to detect the expression of various proteins related to adhesion，migration，invasion and the related mechanisms.Treatment with S-Rg3inhibited the migration of THP-1 cells，and down-regulated the expression of adhesion-related protein N-cadherin，migration-related proteins C-X-C chemokine receptor 4 （CXCR4） and stromal cell-derived factor-1 （SDF-1），and invasion-related protein matrix metalloproteinase 2 （MMP2），but up-regulated the expression of E-cadherin，tissue inhibitor of metalloproteinase 1 （TIMP1） and TIMP3. It also decreased CXCR4 mRNA expression，and stimulated E-cadherin and TIMP1 mRNA expression in a dose-dependent manner. In addition，S-Rg3inhibited PI3K/AKT signaling pathway.Treatment with S-Rg3effectively inhibits the migration and invasion of THP-1 cells，which may be related to inhibition of PI3K/AKT signaling pathway.

20（S）-Ginsenoside Rg3； THP-1 cells； Cell migration； Cell invasion； PI3K/AKT signaling pathway

R730.23； R733.7

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.02.012

1000-4718（2022）02-0284-08

2021-11-25

2022-02-05

［基金項(xiàng)目］浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. LQ19H290002； No. LY20H290004）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 81774068）

Tel： 0571-87071625； E-mail： usually07@126.com

（責(zé)任編輯：盧萍，羅森）