右美托咪定對左向右分流型先天性心臟病大鼠心臟功能與認知功能的影響*

劉新燕 周佩佩 馬漫漫 李東興 侯俊德 韓銀鋒

左向右分流型心臟病，亦稱“非紫紺型先天性心臟病”，患兒一般都會出現(xiàn)呼吸困難、心律失常和肺功能異常，嚴重影響身體健康。其常見病變?yōu)榉块g隔缺損、室間隔缺損和動脈導(dǎo)管未閉，分別占先天性心臟病約10-20%、12-20%、12-15%[1]，可引起心臟負荷加重、肺動脈高壓、肺血管重構(gòu)，其中以肺動脈高壓較嚴重，隨著肺動脈平均壓升高，右心室壓力逐漸增加，最終導(dǎo)致右心室衰竭[2，3]。外科手術(shù)干預(yù)是目前治療左向右分流型心臟病的主要方法，但是手術(shù)麻醉劑的使用，會影響患兒生長發(fā)育和認知功能[4]。右美托咪定是一種選擇性腎上腺素能受體激動劑，除作為外科手術(shù)常用鎮(zhèn)靜劑和輔助劑以及重癥監(jiān)護鎮(zhèn)定劑[5]外，近些年研究表明它還具有保護神經(jīng)元、抗炎及保護心臟功能等作用[6，7]，因而受到臨床關(guān)注。本文通過左向右分流型先天性心臟病大鼠模型觀察右美托咪定對模型大鼠生長發(fā)育、心臟功能及認知功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組處理

6周齡SPF級雄性SD大鼠30只，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，體重(200±10)g，實驗動物許可證號：SCXK(京)2019-0010。采用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為正常對照組(n=6)、模型組(n=12)和模型干預(yù)組(n=12)。模型組和模型干預(yù)組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(70mg/kg)麻醉后行套管法右頸總動脈-頸外靜脈分流術(shù)，建立左向右分流型先天性心臟病大鼠模型：麻醉大鼠頸部正中縱向切口，長度為下頜骨下緣至胸骨上方，暴露右頸外靜脈，于遠心端結(jié)扎并切斷，近心端穿線備用。分離頸總動脈，穿線遠心端并結(jié)扎，血管鉗夾住近心端，在遠心端結(jié)扎線以下約0.5cm處切斷。頸總動脈游離端穿過套管，并使其內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)套在套管上，結(jié)扎固定，而近心端套在翻轉(zhuǎn)的頸總動脈上，結(jié)扎固定， 此時松開血管鉗， 見血管搏動明顯即為造模成功[8]，兩組大鼠均造模成功。正常對照組大鼠同法麻醉后僅游離右側(cè)頸總動脈及頸外靜脈，不進行其它手術(shù)操作。模型干預(yù)組大鼠手術(shù)麻醉時腹腔注射右美托咪定(100mg/kg)1次，術(shù)后每3天一次，劑量同前，共干預(yù)6周。正常對照組和模型組平行注射等量生理鹽水。術(shù)畢切口涂抹青霉素粉預(yù)防感染，縫合切口，蘇醒后按組別分籠飼養(yǎng)，三組大鼠的飼養(yǎng)條件完全相同：常規(guī)飼喂普通飼料、自由飲食進水，光照晝夜節(jié)律明暗各12h(早6點至晚6點)，室溫(22±2)℃，并保持安靜。實驗過程中無大鼠死亡。

CT技術(shù)檢測出552枚淋巴結(jié)，188枚淋巴結(jié)為良性，其中病理證實為良性者139枚，惡性者49枚，CT技術(shù)檢測出364枚為惡性，其中病理證實為良性者63枚，惡性者301枚。統(tǒng)計檢測所得數(shù)據(jù)，并對結(jié)果進行分析，具體統(tǒng)計情況見表3。

術(shù)后第1周至第6周，每周用電子計數(shù)天平(上海恒平電子天平Y(jié)P20KN)稱量、記錄一次體重(g)。第2、4、6周末各進行一次Morris水迷宮實驗。第6周末腹腔注射戊巴比妥鈉(70mg/kg)麻醉后行超聲檢查心功能，之后斷頭處死各組大鼠。對大鼠心臟采血檢測炎性指標和心肌損傷指標，并立即摘取大腦和心臟，組織學觀察海馬神經(jīng)元細胞損傷和心肌纖維；同時檢測海馬和心肌組織的炎性細胞因子表達水平。

羊群感染布魯氏桿菌病后癥狀不明顯，因此，極易與其他傳染病混淆，養(yǎng)殖戶也未對其給予足夠的重視和關(guān)注。母羊感染此類傳染性疾病后容易出現(xiàn)流產(chǎn)現(xiàn)象，通常流產(chǎn)時間為妊娠后3個月或4個月，在流產(chǎn)前并沒有明顯的癥狀，即使誘發(fā)病癥，多數(shù)情況也是患有關(guān)節(jié)炎或者乳房炎。公羊感染此類疾病后會與公牛一樣引發(fā)附睪炎或者睪丸炎。

1.2 Morris水迷宮試驗觀察大鼠逃避潛伏時間

自制試驗裝置包括圓形恒溫水池(直徑120cm、水深50cm)、水下平臺(直徑10cm、高49cm)。將水池分為四個象限，每個象限用不同顏色貼紙作為標記，水池溫度控制在25±1℃。術(shù)前4天開始訓(xùn)練，每天四個象限各訓(xùn)練4次。第一次訓(xùn)練時潛伏平臺放在第一象限內(nèi)，將大鼠置于平臺上停留15s進行適應(yīng)(之后每天各象限訓(xùn)練不再重復(fù)此動作)。依次從四個象限將大鼠放入水中，若大鼠在60s內(nèi)找到平臺并停留超過3s判定為尋臺成功，記錄大鼠從入水到尋臺成功的時間(逃避潛伏時間)，若大鼠在60s內(nèi)不能找到平臺，則由實驗人員將其引導(dǎo)至潛伏平臺，記錄逃避潛伏時間60s。術(shù)后第2、4、6周末對各組大鼠同術(shù)前訓(xùn)練方法進行Morris水迷宮試驗，記錄逃避潛伏時間。

分析師建議：從目前的養(yǎng)殖環(huán)境來看，養(yǎng)羊成本是增加的，一方面，人工增加，另一方面，隨著環(huán)保部門對自然資源的保護力度加大，要求退牧還草，從以前的散養(yǎng)型轉(zhuǎn)變到現(xiàn)在的圈養(yǎng)型，讓羊肉的生產(chǎn)成本逐年增加，間接促成了羊價的上漲。雖然現(xiàn)在市場行情較好，但養(yǎng)殖戶一定不能盲目擴養(yǎng)。盲目擴養(yǎng)會導(dǎo)致整羊增多，有可能會使羊肉賣不上好價格。養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖的過程中一定要科學養(yǎng)殖，在銷路、深加工上下功夫。（信息來源：央廣網(wǎng)）

1.3 超聲心動圖檢測大鼠心功能指標

麻醉后大鼠采用小動物超聲成像系統(tǒng)(型號Vevo770，加拿大Visualsonics公司)，按常規(guī)操作，檢測各組大鼠心功能，考慮到右心室功能變化是左向右分流型先天性心臟病與心肌纖維化的共同病理變化，選取右室舒張末期前后徑(RVEDD)、右室前壁舒張末期厚度(RVWTd)、室間隔舒張末期厚度(IVSd)三指標進行觀察分析。

三組大鼠術(shù)后逃避潛伏時間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。模型組大鼠術(shù)后2、4、6周末的逃避潛伏時間相比正常對照組顯著延長(t值分別為4.137，3.458，2.278，P<0.05)，而模型干預(yù)組較模型組顯著縮短(t值分別為3.144，2.767，2.160，均P<0.05)，見表1。

1.4 ELISA檢測大鼠血清炎性指標和心肌損傷指標

各組大鼠第6周末體重均較試驗前明顯增加，其中正常對照組增至262.12±9.38g,模型組增至223.28±7.15g，模型干預(yù)組增至240.52±8.09g，三組實驗6周末體重差異有統(tǒng)計學意義(F=48.341，P<0.01)；兩兩比較，模型組低于正常對照組(t=9.815，P<0.01)，模型干預(yù)組高于模型組(t=5.531，P<0.01)。

隨著人們生活水平的提升，對富含特色的產(chǎn)品更加追求，對此富含傳統(tǒng)居民元素的藝術(shù)文化產(chǎn)品、作品更被市場看好。傳統(tǒng)居民元素利用鄉(xiāng)土文化氣息這一文化特征，可提高人們的舒適度。在陶瓷藝術(shù)設(shè)計中的應(yīng)用，可以突顯作品返璞歸真的文化特征。不僅對傳統(tǒng)民族文化有傳承作用，同時也拓展了傳統(tǒng)文化的傳播途徑，間接帶動了陶瓷設(shè)計作品的特色發(fā)展。傳統(tǒng)民居元素的設(shè)計，強調(diào)與自然環(huán)境和諧相處，圍繞自然生態(tài)理念，將陶瓷藝術(shù)設(shè)計作品回歸到自然生態(tài)的本源。傳統(tǒng)居民元素在現(xiàn)代建筑中的應(yīng)用另類感強，對此其文化功用在建筑中難以有效體現(xiàn)。在陶瓷藝術(shù)設(shè)計中的應(yīng)用，將自然觀等生態(tài)文化充分體現(xiàn)，側(cè)面烘托出了設(shè)計者的思想、人文情懷。

1.5 HE染色和Masson染色觀察大鼠海馬、神經(jīng)元和心肌纖維化

HE染色顯示，術(shù)后6周末正常對照組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細胞排列整齊規(guī)則、致密有序，形態(tài)、大小正常，核清晰可見，且分布規(guī)則；模型組神經(jīng)元細胞出現(xiàn)排列無規(guī)則、細胞結(jié)構(gòu)不清晰、細胞密度顯著下降等病理損傷現(xiàn)象；模型干預(yù)組神經(jīng)元細胞上述變化較模型組減輕。見圖1。

1.6 Western blotting檢測大鼠海馬、心臟炎性因子蛋白表達

將大鼠大腦海馬及右心室用RIPA裂解液進行裂解，30min后蛋白洗脫，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：abs9232)檢測總蛋白濃度(25mg/ml)。SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜。一抗(1∶1 000)孵育，將PVDF膜蛋白面朝下放于抗體液面上4℃過夜；二抗(1∶200)孵育，將PVDF膜蛋白面朝下放于二抗液面上室溫孵育2h?；瘜W曝光、顯影。美國Chemilmager 5500型凝膠成像儀照像后，用Image J軟件分析電泳條帶灰度，以GAPDH作為內(nèi)參。用灰度比值(目的蛋白灰度/內(nèi)參灰度)表示目的蛋白表達量。比值越大，目的蛋白的表達水平越高，反之亦然?？勾笫驡APDH、IL-1β、IL-6、TNF-α一抗及二抗均購于美國Abcam公司(批號：400-31、E-20533、BA0992、BA0131)。

1.7 統(tǒng)計學處理

ELISA結(jié)果顯示，三組大鼠炎性指標IL-1β、IL-6、TNF-α差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)。相比于正常對照組，模型組顯著升高(t值分別為5.801，5.461，7.487，均P<0.01)，而模型干預(yù)組顯著低于模型組(t值分別為3.338，3.374，3.745，均P<0.01)。見表4。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體重比較

斷頭處死大鼠后心臟取血3ml，室溫2 500r/min離心15min，分離血清。采用ELISA檢測白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-a(TNF-α)、氨基端前B型鈉尿肽(NT-proBNP)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白(cTnI)水平，具體方法參照試劑盒說明書。IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒購于美國R&D System公司(批號：110810、210603、330244)；NT-proBNP、CK-MB、cTnI ELISA試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司(批號：2400162、M25082、20161101)。

2.2 各組大鼠逃避潛伏時間比較

當電感L和電池的等效電阻r不可忽略時，只需將上式中sL項相應(yīng)變化，再對其進行求解，即推導(dǎo)出非理想情況下Boost電路的開環(huán)輸出阻抗Zoo（s）：

表1 各組大鼠術(shù)后逃避潛伏時間比較

2.3 各組大鼠部分心功能指標比較

Masson染色顯示，正常對照組大鼠右心室膠原纖維散在分布或呈條索狀；模型組大鼠右心室心肌明顯纖維化，表現(xiàn)為膠原纖維粗大且交織或堆積成片狀，沉積增多；模型干預(yù)組心肌纖維化較模型組減輕。見圖2。

表2 右美托咪定對左向右分流型先天性心臟病大鼠部分心功能指標的影響

2.4 各組大鼠心肌損傷指標比較

三組大鼠心肌損傷各指標組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。相比于正常對照組，模型組大鼠血清NT-proBNP、CK-MB、cTnI水平顯著升高(t值分別為8.881，7.519，8.228，均P<0.01)，模型干預(yù)組大鼠顯著低于模型組(t值分別為3.284，3.011，3.000，均P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠部分心肌損傷指標比較

2.5 各組大鼠海馬神經(jīng)元病理變化

各組大鼠大腦海馬及心臟組織采用10%福爾馬林溶液固定24h，然后按常規(guī)方法脫水，包埋、切片，分別按照所購試劑盒常規(guī)方法進行HE染色和改良Masson染色。海馬神經(jīng)元HE染色后，鏡下觀察神經(jīng)元的膠核顯出藍色，其它染成紅色。心臟組織Masson染色后鏡下觀察心肌的胞核呈藍黑色，膠質(zhì)纖維呈藍色，其它呈紅色。

圖1 各組大鼠海馬神經(jīng)元組織病理變化(HE染色，×200)

2.6 各組大鼠心肌纖維化

三組大鼠心功能各指標差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。相比于正常對照組，模型組大鼠的RVEDD、RVWTd、IVSd水平顯著增加(t值分別為11.429，12.571，10.286，均P<0.01)，而模型干預(yù)組較模型組顯著改善(t值分別為4.899，4.648，4.648，均P<0.01)。見表2。

圖2 各組大鼠右心室心肌纖維化(Masson染色，×200)

2.7 各組大鼠血清、海馬及心肌組織炎性因子水平比較

表4 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平變化

Western blotting結(jié)果顯示，三組大鼠海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(F值分別為87.444，39.338，52.597，均P<0.01)與心肌組織中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達的差異有統(tǒng)計學意義(F值分別為38.339，18.991，8.335，均P<0.01)。模型組海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(t值分別為11.292，7.685，9.352，均P<0.01)及心肌組織中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達水平(t值分別為6.722，5.810，38.563，均P<0.01)較正常對照組顯著升高，而模型干預(yù)組較模型組顯著降低(海馬組織：t值分別為7.731，9.153，4.038，均P<0.01；心肌組織：t值分別為6.049，2.152，4.070，均P<0.05)。見圖3。

兩組患者術(shù)后均于24 h內(nèi)控制排便，術(shù)后5～7 d常規(guī)應(yīng)用抗生素抗感染，觀察切口變化，進行對癥、支持治療，同時保持切口干凈、干燥，每天換藥1次，術(shù)后7～10 d拆線。

注：A、B分別為海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白電泳圖和電泳條帶灰度比值直方圖；C、D分別為心肌組織IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白電泳圖和電泳條帶灰度比值直方圖；與正常對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

3 討 論

左向右分流型先天性心臟病患兒隨著病情發(fā)展，會出現(xiàn)認知功能衰退，表現(xiàn)為注意力不集中、記憶力減退；此外，由于心臟負荷加重、肺血管重構(gòu)，容易導(dǎo)致肺動脈高壓的發(fā)生，引發(fā)心力衰竭。臨床外科手術(shù)是根治左向右分流型先天性心臟病的主要方法，但手術(shù)麻醉會影響患兒生長發(fā)育和認知功能，是患兒手術(shù)后的常見并發(fā)癥，因而成為臨床麻醉科的研究重點。右美托咪定是外科手術(shù)常用的鎮(zhèn)靜劑和麻醉輔助劑。已有研究表明右美托咪定具有鎮(zhèn)定作用和抑制神經(jīng)元細胞凋亡作用[9]，本研究中發(fā)現(xiàn)，右美托咪定干預(yù)左向右分流型心臟病能夠使模型大鼠體重增加，即可能促進模型大鼠的生長發(fā)育[10]，同時明顯提高模型大鼠的空間學習記憶能力，顯著逆轉(zhuǎn)海馬組織中神經(jīng)元細胞損傷，以及有效改善模型大鼠心功能和心肌纖維化。進一步檢測發(fā)現(xiàn)，左向右分流型先天性心臟病模型大鼠血清心肌及海馬、組織處于高炎癥狀態(tài)，表現(xiàn)為IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高，而經(jīng)過右美托咪定干預(yù)，模型大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低。提示右美托咪定上述功效可能通過抑制相關(guān)炎癥而得以實現(xiàn)。

有研究認為[11，12]，手術(shù)創(chuàng)傷、臟器再灌注損傷等可誘發(fā)左向右分流型先天性心臟病氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，使血清IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子分泌增加，同時促進炎性細胞滲出；炎性細胞產(chǎn)生的花生四烯酸在各種相關(guān)酶類的作用下生成白三烯、前列腺素等具有促進心肌纖維化介質(zhì)，激活心肌纖維化通路，造成心肌纖維化[13]。而右美托咪定可通過激活中樞α2受體來抑制交感神經(jīng)活性，減少兒茶酚胺釋放，抑制去甲腎上腺素誘導(dǎo)的炎性因子RNA表達，同時減少巨噬細胞和單核細胞釋放炎性因子，減輕炎癥反應(yīng)，從而抑制心肌纖維化，減輕心功能損傷[14]。還有研究報道，左向右分流型先天性心臟病產(chǎn)生的大量炎性因子也會對中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元造成損害，影響腦組織代謝及認知功能。采用右美托咪定可降低交感神經(jīng)興奮性，抑制神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細胞分泌炎癥介質(zhì)，減輕活性氧、神經(jīng)毒素對神經(jīng)元的損傷，并通過抑制細胞凋亡、促進神經(jīng)元細胞對谷氨酸攝取等途徑保護神經(jīng)元，從而改善認知功能[15]。此外，右美托咪定還可起到穩(wěn)定血流動力學以及通過對磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路、NLRP3/Caspase-1通路的調(diào)控作用發(fā)揮神經(jīng)元保護及腦保護作用，協(xié)同改善認知功能。

綜上，右美托咪定可顯著改善左向右分流型先天性心臟病大鼠心臟功能、認知功能和炎癥反應(yīng)，驗證了其在防治左向右分流型心臟病中的作用。

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