膠質(zhì)母細胞瘤病人SOX21基因與預后的關(guān)系

盧 玲，黃其柳，黃小妹，呂婷婷，何乾超，梁 妮，刁麗梅

膠質(zhì)母細胞瘤又叫多形性膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma，GBM)，是最常見和最具侵襲性的原發(fā)性腦瘤，中位生存時間只有15個月[1]。盡管采用手術(shù)、放療、化療等治療策略病人生存時間有所改善，但預后仍較差，5年死亡率大于90%[2]。隨著轉(zhuǎn)錄組學研究的進展，對膠質(zhì)母細胞瘤的潛在分子機制的認識不斷提高，且提出了不同的臨床見解和治療決策。目前，分子治療仍被認為是膠質(zhì)母細胞瘤治療的重要突破口之一。多種mRNA分子標記已被證實在膠質(zhì)母細胞瘤中發(fā)揮重要作用，包括表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、酪氨酸激酶受體2(v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog，ERBB2)和異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)等[3-6]。因此，通過挖掘膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)病的潛在分子機制，識別潛在的分子生物標記物，可對膠質(zhì)母細胞瘤進行早期的診斷、預防和個性化治療。SOX基因是一組編碼轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)育調(diào)控基因，在人和小鼠中有20個SOX相關(guān)基因的表達[7]。早期的研究已經(jīng)證實，SOX基因參與了許多發(fā)育過程，如性別決定和分化、神經(jīng)發(fā)生、軟骨發(fā)生和胸腺細胞分化[8]。近期研究還發(fā)現(xiàn)，SOX基因的突變和異常表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[9-11]。既往研究發(fā)現(xiàn)，SOX2表面蛋白在正常胃黏膜中表達，但在部分人胃癌組織中表達下調(diào)，SOX2通過影響細胞周期阻滯和凋亡，在抑制胃上皮細胞的生長中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[12]。在小細胞肺癌病人血清中也檢測到SOX(SOX1、SOX2、SOX3、SOX21)基因表達上調(diào)[13]。此外，SOX家族抗體(包括SOX1、SOX2、SOX3、SOX21)在區(qū)分小細胞肺癌(SCLC)、Lambert-Eaton肌無力綜合征(LEMS)和非腫瘤LEMS中具有診斷價值[14]。SOX21基因在小細胞肺癌中的作用已被研究證實。且有研究報道，SOX21可以通過抑制SOX2在膠質(zhì)瘤細胞系中誘導膠質(zhì)瘤細胞凋亡[19]。但是，SOX21與膠質(zhì)瘤病人的臨床病理特征的關(guān)系及預后作用尚未見報道。

本研究基于癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)探討SOX21基因與膠質(zhì)母細胞瘤臨床特征的相關(guān)性，分析SOX21在膠質(zhì)母細胞瘤中的預后作用。通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫中SOX21基因在膠質(zhì)母細胞瘤和非腫瘤組織中的表達值，并通過單因素和多因素COX分析確定了SOX21在膠質(zhì)母細胞瘤病人中的預后價值。同時，通過基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)檢測了SOX21與GBM相關(guān)的生物學途徑。

1 資料與方法

1.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的獲取 從癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(TCGA，https：//portal.gdc.cancer.gov)中獲取了膠質(zhì)母細胞瘤隊列(Project Id is TCGA-LUAD and Workflow Type is HTSeq-FPKM and Data Category is Transcriptome Profiling and Data Type is Gene Expression Quantification)的174個轉(zhuǎn)錄組測序樣本數(shù)據(jù)，并從TCGA數(shù)據(jù)庫下載病人對應的臨床病理信息。

1.2 基因集富集分析 本研究采用基因集富集分析，探討SOX21高表達組和低表達組存在顯著差異的可能性?；蚋患治龅臉藴剩篏SEA 中|NES|>1、NOM p-val<0.05和FDR q-val<0.25的富集結(jié)果被認為差異有統(tǒng)計學意義，為顯著富集[15-16]。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用Wilcoxon非參數(shù)檢驗比較多形性膠質(zhì)母細胞瘤與非腫瘤組織的基因表達水平差異情況。根據(jù)SOX21基因表達的中位值作為截斷閾值，將多形性膠質(zhì)母細胞瘤病人分為高、低表達兩組。采用Wilcoxon符號秩次檢驗或Kruskal檢驗以及Logistic回歸來評估SOX21與其他臨床特征的關(guān)系。采用單變量COX回歸分析多形性膠質(zhì)母細胞瘤病人的臨床病理特征與總生存時間的相關(guān)性。采用多變量COX回歸分析確定SOX21基因是否獨立于其他臨床病理特征。所有的統(tǒng)計分析均使用R語言軟件(v.3.5.1)操作完成。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 樣本納入情況及多形性膠質(zhì)母細胞瘤的基線資料 TCGA數(shù)據(jù)庫中共有膠質(zhì)母細胞瘤樣本174例，其中腫瘤樣本169例，非腫瘤樣本5例，剔除了生存時間和生存狀態(tài)不完整的5個膠質(zhì)母細胞瘤樣本。最終，本研究納入了159例膠質(zhì)母細胞瘤病人樣本。159例膠質(zhì)母細胞瘤病人的臨床病理資料。詳見表1。

表1 TCGA膠質(zhì)母細胞瘤病人隊列的臨床病理特征 單位：例(%)

2.2 SOX21在膠質(zhì)母細胞瘤組織和非腫瘤組織中表達情況 通過 Wilcoxon 符號秩檢驗比較SOX21在膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤組織和非腫瘤組織中的表達，本研究發(fā)現(xiàn)SOX21在腫瘤組織中高表達(P=0.004)。詳見圖1。

圖1 SOX21基因在膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤組織和非腫瘤組織中的表達量

2.3 SOX21表達與膠質(zhì)母細胞瘤臨床特征的關(guān)系 通過Kruskal檢驗和Wilcox檢驗比較SOX21表達與不同臨床特征的關(guān)系(見圖2)。使用Logistic回歸分析SOX21基因與不同臨床病理特征的關(guān)系(見表2)。結(jié)果表明，TCGA亞型與SOX21表達相關(guān)(P<0.001)。與經(jīng)典型比較，間質(zhì)型、神經(jīng)元型和前神經(jīng)元型的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 SOX21基因表達與膠質(zhì)母細胞瘤不同臨床病理特征的關(guān)系圖(A為SOX21基因表達與TCGA亞型的關(guān)系；B為SOX21基因表達與年齡的關(guān)系；C為SOX21基因表達與性別的關(guān)系；D為SOX21基因表達疾病新事件類型的關(guān)系；E為SOX21基因表達與KPS生活質(zhì)量評分的關(guān)系)

表2 Logistic回歸分析SOX21基因與不同臨床病理特征的關(guān)系

2.4 生存結(jié)果和COX分析 以SOX21的中位表達值為截斷點的Kaplan-Meier曲線顯示，SOX21高表達與較好的總生存率相關(guān)，而SOX21低表達與較差的總生存率相關(guān)(P=0.006)。單因素COX分析表明，SOX21的高表達與更好的OS相關(guān)[HR=0.69；95%CI(0.54，0.88)，P=0.01)]。多變量COX分析中，SOX21仍與OS保持獨立關(guān)系，HR=0.70，95%CI(0.55，0.90)，P=0.01。詳見表3、圖3。

表3 單因素及多因素COX回歸分析

圖3 SOX21基因高低表達組的生存曲線圖

2.5 基于基因集富集分析的SOX21相關(guān)信號通路 將 159例癌組織樣本按 SOX21 表達量中位值分為高表達和低表達兩個表型進行基因富集分析。本研究分析了SOX21高表達組和SO21低表達組兩個表型之間的膠質(zhì)母細胞瘤相關(guān)的信號通路。根據(jù)標準富集評分(normalized enrichment score，NES)選擇富集最顯著的信號通路，結(jié)果顯示，在SOX21高表達表型中，丙酸代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、過氧化物酶體和賴氨酸降解顯著富集。詳見表4、圖4。

表4 SOX21基因高表達表型的GSEA最顯著富集通路的參數(shù)值

圖4 SOX21基因高表達表型的GSEA最顯著富集通路結(jié)果圖

3 討 論

本研究結(jié)果表明，SOX21的低表達與多形性膠質(zhì)母細胞瘤病人較差的生存狀態(tài)有關(guān)。總生存時間的生存曲線也顯示，SOX21低表達與膠質(zhì)母細胞瘤病人的不良預后相關(guān)。單因素和多因素COX分析顯示，SOX21的表達可能是膠質(zhì)母細胞瘤預后的一個獨立的預后因素。

已有研究證明，SOX21在脊椎動物神經(jīng)發(fā)生過程中起著舉足輕重的作用，SOX21通過調(diào)節(jié)自身表達與SOX1-3活性之間的平衡，決定神經(jīng)細胞是保持在祖細胞狀態(tài)，還是向神經(jīng)元分化[17]。體外實驗表明，SOX21表達上調(diào)或添加siRNA對抗SOX2，可以抑制膠質(zhì)瘤細胞中SOX2的表達，而SOX2的表達下調(diào)可誘導凋亡導致細胞增殖下降[18]。此外，在人膠質(zhì)瘤細胞中誘導SOX21的表達可以抑制腫瘤生長，延長異種移植小鼠的生存期，SOX21降低了腫瘤細胞的干細胞樣特性，導致腫瘤細胞分化異常、凋亡增多、增殖減少[19]。這些證據(jù)表明，轉(zhuǎn)錄因子SOX21作為抑癌基因在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它可能是潛在的生物標志物，且膠質(zhì)瘤的診斷和治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本研究的結(jié)果表明，SOX21在膠質(zhì)母細胞瘤病人中的表達降低與膠質(zhì)母細胞瘤分子亞型相關(guān)，并預示著不良預后。富集途徑主要有丙酸代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、過氧化物酶體和賴氨酸降解。美國NIH項目的研究資料提示丙酸代謝可能與乳腺癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，作為支鏈氨基酸(BCAAs)的亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸在腫瘤中優(yōu)先被攝取以合成蛋白質(zhì)或通過腫瘤氧化獲得能量[20]。此外，BCAA代謝酶如細胞醇支鏈轉(zhuǎn)氨酶1(cytosol branch-chain aminotransferase 1，BCAT1)在膠質(zhì)瘤細胞系中有抑制BCAT1的作用，在體外可以阻斷谷氨酸排泄，降低細胞增殖和侵襲性，并顯著降低移植瘤模型的腫瘤生長[21]。過氧化物酶體的生物學發(fā)生、酶功能和自噬降解已經(jīng)被文獻報道與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[22]。GSEA富集分析結(jié)果揭示了SOX21基因在膠質(zhì)母細胞瘤中的潛在通路，為進一步深入研究提供了一定的參考。

綜上所述，SOX21的表達上調(diào)可能是膠質(zhì)母細胞瘤病人良好生存的潛在預后分子標記。此外，丙酸代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解、過氧化物酶體和賴氨酸的降解可能是SOX21在GBM中調(diào)控的關(guān)鍵信號通路。但SOX21基因如何通過這些潛在的代謝通路對膠質(zhì)母細胞瘤的疾病進展和預后發(fā)揮作用仍有待進一步的實驗驗證。同時，需要在分子生物學水平和蛋白水平進行更多的實驗，對SOX21基因的功能進行深入研究。