表達的影響

許方方，張 珊，李建玲，蔣 淼

認知功能障礙是阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)特征性的臨床表現(xiàn)。人參皂苷Rb1是人參主要活性成分，通過抑制炎癥反應、激活抗凋亡相關(guān)通路，從而保護腦細胞功能、改善學習記憶[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，臨床常用的吸入性麻醉藥物以及手術(shù)創(chuàng)傷刺激可以加重或誘發(fā)AD臨床前期、臨床期病人的認知功能障礙[3-5]。本研究通過圍術(shù)期給藥，觀察人參皂苷Rb1對APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠肝葉部分切除術(shù)后認知功能以及海馬內(nèi)突觸后致密蛋白-95(postsynaptic density proteinP-95，PSD-95)、神經(jīng)元尼氏體表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 3月齡APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因雄性小鼠，體質(zhì)量30 g，由南京大學動物模式中心提供，許可證號：SCXK(蘇)2015-0001。

1.2 主要試劑和儀器 Morris水迷宮裝置(上海吉量軟件科技有限公司)；人參皂甙Rb1(純度>95%，批號：17080421)購自上海同田生物技術(shù)有限公司，經(jīng)生理鹽水稀釋后備用；小鼠單克隆PSD抗體(1∶1 000，Abcam)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG(1∶1 000，Aggen)。

1.3 分組 本實驗已經(jīng)通過上海市寶山區(qū)仁和醫(yī)院倫理委員會的倫理論證(編號：201812)，并在其監(jiān)督下進行。將3月齡APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠120只隨機分為3組，每組40只，手術(shù)組(S組)：小鼠腹腔注射0.1%戊巴比妥 0.3 mg/kg，麻醉后行肝葉部分切除術(shù)；人參皂甙Rb1 組(Rb1 組)：術(shù)前5 d注射人參皂甙60 mg/kg；對照組(N組)：術(shù)前5 d注射同體積的生理鹽水。從以上各組中隨機抽取8只小鼠，采用Morris水迷宮檢測術(shù)后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d、28 d學習記憶能力。剩余APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠同樣在術(shù)后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d時間點取標本行蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測海馬內(nèi)PSD-95的表達及尼氏染色分析尼氏體累積光密度值(IOD)。

1.4 Morris水迷宮行為學測試 實驗程序包括：①定位航行實驗(place navigation)用于測量小鼠獲取空間學習記憶的能力。將小鼠從4個入水點隨機放入水中，通過自動錄像系統(tǒng)記錄小鼠90 s內(nèi)找到平臺的時間(逃避潛伏期，escape latency)。②空間探索實驗(spatial probe test)用于測量小鼠對平臺空間位置記憶的能力。拆除平臺，將小鼠從離平臺最遠的象限放入水中，記錄90 s內(nèi)小鼠在原目標象限的時間百分比。

1.5 手術(shù)處理 小鼠翻正反射消失后，消毒，在劍突下腹部正中線切開，進入腹腔游離肝臟左側(cè)葉，在遠端蒂部用一號絲線結(jié)扎切除肝左側(cè)葉。

1.6 尼氏染色 腹腔注射戊巴比妥深度麻醉小鼠，迅速開胸暴露心臟，經(jīng)左心室向主動脈插管，剪開右心房，甲醛50 mL經(jīng)升主動脈快速沖洗，斷頭，液氮速凍組織切片(5 μm)4 ℃丙酮固定15 min，純蒸水沖洗3次，每次5 min，用1%甲苯胺藍水溶液置50 ℃溫箱中染色30 min，純蒸水沖洗3次，每次5 min，95%乙醇迅速分化，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察拍照分析，并用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析尼氏體IOD值。

1.7 Western Blot檢測 在各時間點將小鼠麻醉后斷頭，冰上取海馬組織，經(jīng)0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(PBS)清洗后，置于含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液(RIPA裂解液)中裂解，離心后取上清液，部分上清液用于蛋白質(zhì)濃度的測定(BCA法測定)，余上清液置100 ℃煮沸變性結(jié)束后，上樣行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、加一抗孵育過夜，HRP標記二抗處理。ECL發(fā)光液孵育、膠片曝光、顯影、定影。用BIO-RAD Quantity One 4.5.0軟件檢測目的蛋白PSD-95的條帶及內(nèi)參β-acting條帶的灰度值，將目的蛋白灰度值和內(nèi)參灰度值的比值作為目的蛋白表達的相對水平。

2 結(jié) 果

2.1 水迷宮實驗結(jié)果 與Rb1組比較，S組和N組術(shù)后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d平均逃避潛伏期延長(P<0.05)；S組和N組術(shù)后各時間點平均逃避潛伏期比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見圖1A。與Rb1組比較，S組和N組術(shù)后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d目標象限時間百分比及游泳距離明顯縮短(P<0.05)，詳見圖1B、圖1C。各組之間小鼠游泳速度比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見圖1D。

與S組同時間點比較，# P<0.05；與N組同時間點比較，＊ P<0.05。

2.2 尼氏染色結(jié)果 Rb1組小鼠術(shù)后7 d、14 d、21 d、28 d海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞排列密集，胞漿中尼氏體豐富；與Rb1組比較，S組和N組術(shù)后21 d、28 d神經(jīng)元內(nèi)尼氏小體部分溶解或消失，胞漿著色變淡神經(jīng)元細胞排列紊亂，尼氏體表達明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖2、圖3。

與Rb1組同時間點比較，＊ P<0.05。

圖2 APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠術(shù)后海馬CA1區(qū)尼氏染色結(jié)果(×400)

2.3 Western Blot檢測3組PSD-95蛋白表達 與Rb1組比較，S組和N組術(shù)后3 d、7 d、14 d 、21 d、28 d PSD-95蛋白表達逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；S組和N組比較，術(shù)后3 d、7 d、14 d 、21 d、28 d PSD-95蛋白表達，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見圖4。

與Rb1組同時間點比較，＊ P<0.05。

3 討 論

β-淀粉樣蛋白(amyloid-β protein，Aβ)的沉積，tau 蛋白高磷酸化是AD特征性病理改變。研究發(fā)現(xiàn)，手術(shù)創(chuàng)傷刺激引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性因子高表達可以誘發(fā)和加劇Aβ的異常聚集[5]。揮發(fā)性麻醉藥物(異氟醚、地氟烷)通過上調(diào)Aβ前體蛋白切割酶β分泌酶(BACE)的活性，促進Aβ寡聚化進而誘導神經(jīng)細胞凋亡[6-7]。圍術(shù)期低溫使神經(jīng)元骨架蛋白tau蛋白過度磷酸化，造成神經(jīng)元丟失，進而提示手術(shù)麻醉有可能是誘發(fā)和加劇AD高風險人群發(fā)病的潛在因素[8]。在本實驗中，手術(shù)組及對照組AD模型小鼠術(shù)后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d逃避潛伏期逐漸延長、目的象限時間百分比縮短，提示術(shù)后認知功能異常。人參皂苷是人參的生物活性成分之一，已發(fā)現(xiàn)大約有50多種，其中Rb1主要作用在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對免疫細胞、細胞因子、一氧化氮、活性氧(ROS)等炎癥介質(zhì)均有抑制作用，通過多種途徑不同環(huán)節(jié)在增強免疫力、活血、抗氧化、延緩衰老等方面發(fā)揮著重要的藥理作用[9-13]。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1通過改變β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)裂解途徑，減少Aβ的生成，抑制Aβ誘導的神經(jīng)毒性反應[14]；通過抑制細胞凋亡因子Bax、Caspase-3表達，激活抗細胞凋亡因子Bcl-2，保護神經(jīng)元細胞從而改善癡呆鼠的認知功能[2]。因此，從理論上講，人參皂甙Rb1有可能成為治療AD病人術(shù)后認知功能下降的潛在藥物。既往研究顯示，人參皂甙Rb1在60 mg/kg時可以有效改善老年鼠術(shù)后認知功能下降[15]。本研究結(jié)果顯示，與手術(shù)組及對照組同時間點比較，人參皂甙Rb1組小鼠術(shù)后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d找到安全平臺的逃避潛伏期明顯縮短，提示通過圍術(shù)期給藥，人參皂甙Rb1可以改善AD模型小鼠術(shù)后的記憶功能。

學習記憶與海馬內(nèi)突觸相關(guān)蛋白表達水平密切相關(guān)，PSD-95位于突觸后膜與F-actin骨架蛋白、神經(jīng)遞質(zhì)受體和信號蛋白分子共同形成復合物參與突觸后信號的轉(zhuǎn)導和整合[16]。因此，本實驗采用Western Blot檢測海馬內(nèi)PSD-95的表達水平，結(jié)果顯示，與Rb1組比較，手術(shù)組及對照組術(shù)后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d PSD-95蛋白條帶密度逐漸變小變淺，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示人參皂甙Rb1在保護突觸功能及防止突觸丟失中起重要作用。

神經(jīng)元尼氏小體是反映神經(jīng)元功能變化的重要指標，當神經(jīng)元功能受損時，尼氏小體會溶解甚至消失。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Rb1可以通過上調(diào)神經(jīng)元周期蛋白D1(Cyclin D1)表達、激活非磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)依賴的蛋白激酶B(Akt)信號轉(zhuǎn)導通路，進而保護神經(jīng)元細胞的活性[17-18]。在本實驗中，尼氏染色結(jié)果顯示，人參皂甙Rb1組小鼠術(shù)后7 d、14 d、21 d、28 d海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞排列密集、整齊，胞漿中尼氏體豐富，提示神經(jīng)元活性功能正常，而手術(shù)組與對照組術(shù)后21 d、28 d小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞排列紊亂，尼氏體表達減少。據(jù)此推測，人參皂苷Rb1通過誘導尼氏體的表達，進而維持神經(jīng)元細胞形態(tài)和功能的穩(wěn)定性。

綜上所述，人參皂甙Rb1可能通過誘導突觸相關(guān)蛋白PSD-95及神經(jīng)元尼氏體的表達，改善突觸結(jié)構(gòu)，保護神經(jīng)元活性，提高AD模型小鼠術(shù)后學習記憶能力。