circ_HECTD1在癲癇模型細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響

呂麥扣，席 聰

癲癇是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性疾病，由腦部神經(jīng)元同步化異常放電導(dǎo)致，臨床表現(xiàn)的主要特征為短暫性、反復(fù)性、發(fā)作性和刻板性，目前仍缺乏有效的預(yù)防和治療措施[1]。神經(jīng)元損傷是癲癇發(fā)作的最終結(jié)果，也是引起癲癇再發(fā)及形成難治性癲癇的主要原因[2]。因此，尋找有效的減輕神經(jīng)元損傷的方法具有重要意義。環(huán)狀RNA(circular RNAs，circRNAs)是一類具有5′末端帽子和3′末端 poly A尾結(jié)構(gòu)的單鏈環(huán)狀、共價(jià)閉合的非編碼RNA，可通過多種機(jī)制廣泛調(diào)控多種疾病的進(jìn)程[3-4]。研究表明，circRNAs與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。含HECT結(jié)構(gòu)域的E3泛素鏈接酶(HECT domain E3 ubiquitin ligase，HECTD1)在多種細(xì)胞中均有表達(dá)，且發(fā)揮多種功能[6-7]。研究顯示，在小鼠短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞模型中，缺血腦組織中circ_HECTD1表達(dá)升高，急性缺血性腦卒中病人血漿樣本circ_ HECTD1表達(dá)升高，抑制circ_HECTD1表達(dá)可減少梗死面積，減輕神經(jīng)元損傷[8]。circ_HECTD1對(duì)癲癇的影響及機(jī)制尚未明確。因此，本研究建立無鎂癲癇模型細(xì)胞，檢測(cè)沉默circ_HECTD1表達(dá)對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞活力、凋亡率及炎性因子表達(dá)的影響，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康的24 h新生SD大鼠，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物操作按照西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求進(jìn)行。DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、蛋白酶K均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；四唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、多聚賴氨酸均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法(TUNEL)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL發(fā)光液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、cleaved caspase 3和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)/p65抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司；circ_HECTD1小干擾RAN(si-circ_HECTD1)、小干擾RNA陰性序列(si-NC)購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.2 海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng) 取新生24 h的SD大鼠，75%乙醇消毒全身，無菌條件下斷頭取腦，置于解剖液中，光學(xué)顯微鏡下使用解剖鑷分離海馬組織，剔除掉腦膜和血管，眼科剪將組織剪成小塊(1 mm3)，加等體積的胰酶消化5 min，期間輕搖2次，用含10%血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)吹打至無肉眼可見的團(tuán)塊。細(xì)胞經(jīng)70 μm濾篩過濾，4 ℃離心，棄掉上清，加入神經(jīng)元培養(yǎng)基，巴氏管吹打混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL，接種于經(jīng)多聚賴氨酸(0.1 mg/mL)包被的培養(yǎng)皿中，置于5%體積分?jǐn)?shù)CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)12～24 h后，更換為神經(jīng)元維持培養(yǎng)基，之后每3～4 d換液1次，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，將生長(zhǎng)良好的神經(jīng)元細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及癲癇模型的建立 實(shí)驗(yàn)分為4組。對(duì)照組：取培養(yǎng)10 d的海馬神經(jīng)元，正常細(xì)胞外液洗滌(1 min×3次)，加入正常細(xì)胞外液，于5 %體積分?jǐn)?shù)CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h，更換為維持液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。無鎂致癇組(無鎂組)：取培養(yǎng)10 d的原代海馬神經(jīng)元，無鎂細(xì)胞外液洗滌(1 min×3次)，于5%體積分?jǐn)?shù)CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h進(jìn)行無鎂誘導(dǎo)，恢復(fù)維持液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。無鎂+si-NC組：取培養(yǎng)10 d的海馬神經(jīng)元，加終濃度為100 nmol/L的si-NC，反應(yīng)30 min進(jìn)行無鎂誘導(dǎo)，恢復(fù)維持液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。無鎂+si-circ_HECTD1組：取培養(yǎng)10 d的海馬神經(jīng)元，加終濃度為100 nmol/L的si-HECTD1，反應(yīng)30 min進(jìn)行無鎂誘導(dǎo)，恢復(fù)維持液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)circ_HECTD1、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)表達(dá) 應(yīng)用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，ODNano Drop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，OD260/OD280比值在1.8～2.0以內(nèi)且純度合格RNA用于實(shí)驗(yàn)。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照試劑盒說明配置PCR反應(yīng)體系及設(shè)置反應(yīng)條件，其中反應(yīng)體系為20 μL，所用引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，以GAPDH作為內(nèi)參基因，以所得Ct均值，采用2-△△Ct法計(jì)算circ_HECTD1、IL-6和IL-1β基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力 以1×105個(gè)/mL密度接種各組神經(jīng)元細(xì)胞于96孔板，每孔100 μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)至單層鋪滿孔底時(shí)，向每孔中加MTT溶液(5 mg/mL)10 μL，于37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h，吸除孔內(nèi)培養(yǎng)液，在每孔中加150 μL的DMSO，放置于搖床上低速震蕩10 min使結(jié)晶溶解充分。酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm處的吸光度值(OD)。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 種植海馬神經(jīng)元細(xì)胞懸液(1×105個(gè)/mL)于包被過的細(xì)胞爬片上，按照分組處理培養(yǎng)，然后進(jìn)行TUNEL染色。細(xì)胞爬片樣本經(jīng)固定液固定1 h、蛋白酶K處理15～30 min及封閉液處理10 min后，使用濾紙吸干爬片上的水分。在爬片上滴加50 μL的TUNEL反應(yīng)液，置于37 ℃、暗室、濕盒加蓋孵育1 h，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌。在爬片上滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，5 min后吸出，PBS洗滌。在爬片上滴加15 μL的抗淬滅劑封片。熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)死亡神經(jīng)元數(shù)目。

1.7 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)Bcl-2、Bax、cleaved caspase 3和NF-κB/p65表達(dá) 收集各處理組細(xì)胞，每孔加適量含PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液，放置于冰上反應(yīng)15 min，轉(zhuǎn)移細(xì)胞至離心管，4 ℃離心，收集上清，上清即為細(xì)胞總蛋白。應(yīng)用BCA法測(cè)定蛋白濃度。按照4∶1比例將總蛋白與5×上樣緩沖液混勻，100 ℃煮沸5 min使蛋白變性。根據(jù)蛋白樣品濃度計(jì)算上樣體積，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，倒去封閉液，加一抗稀釋液(1∶1 000稀釋的Bcl-2、Bax、cleaved caspase3和NF-κB/p65抗體)，4 ℃孵育過夜，洗膜。加二抗稀釋液(1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記抗體)，置于搖床上孵育1.5 h，洗膜。膜含蛋白面滴加ECL顯色液，曝光、顯影、定影，Image J軟件分析灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 circ_HECTD1在癲癇模型細(xì)胞中的表達(dá) 與對(duì)照組比較，無鎂組和無鎂+si-NC組circ_HECTD1表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與無鎂+si-NC組比較，無鎂+si-circ_HECTD1組circ_ HECTD1表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組circ_HECTD1在癲癇模型細(xì)胞中的表達(dá)比較 (±s)

2.2 沉默circ_ HECTD1表達(dá)對(duì)無鎂誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞活力和凋亡的影響 與對(duì)照組比較，無鎂組和無鎂+si-NC組細(xì)胞活力明顯降低，凋亡率明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與無鎂+si-NC組比較，無鎂+si-circ_HECTD1組細(xì)胞活力明顯升高，凋亡率明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組神經(jīng)元細(xì)胞活力和凋亡率比較 (±s)

P<0.05。

2.3 沉默circ_ HECTD1表達(dá)對(duì)無鎂誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞Bcl-2、Bax和cleaved caspase 3表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，無鎂組和無鎂+si-NC組Bcl-2表達(dá)明顯降低，Bax和cleaved caspase 3表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與無鎂+si-NC組比較，無鎂+si-circ_HECTD1組Bcl-2表達(dá)明顯升高，Bax和cleaved caspase 3表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1、表3。

圖1 各組神經(jīng)元細(xì)胞Bcl-2、Bax和cleaved caspase 3表達(dá)條帶圖

表3 各組神經(jīng)元細(xì)胞Bcl-2、Bax和cleaved caspase 3的蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 (±s)

2.4 沉默circ_ HECTD1表達(dá)對(duì)無鎂誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞IL-6和IL-1β表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，無鎂組和無鎂+si-NC組IL-6和IL-1β表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與無鎂+si-NC組比較，無鎂+si-circ_HECTD1組IL-6和IL-1β表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組神經(jīng)元細(xì)胞IL-6和IL-1β表達(dá)比較(±s)

P<0.05。

2.5 沉默circ_ HECTD1表達(dá)對(duì)無鎂誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞NF-κB/p65表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，無鎂組和無鎂+si-NC組NF-κB/p65表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與無鎂+si-NC組比較，無鎂+si-circ_HECTD1組NF-κB/p65表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2、表5。

圖2 各組神經(jīng)元細(xì)胞NF-κB/p65表達(dá)條帶圖

表5 各組神經(jīng)元細(xì)胞NF-κB/p65的蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 (±s)

P<0.05。

3 討 論

circRNA是一種環(huán)形非編碼RNA，可通過抑制miRNA的功能參與炎癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，在人體各組織中，腦組織circRNA含量最高[11]。在神經(jīng)發(fā)育過程中，在大腦的各部位circRNA水平均較高，提示在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中circRNA可能發(fā)揮重要作用[12-13]。神經(jīng)細(xì)胞損傷包括凋亡和壞死，神經(jīng)細(xì)胞損傷是癲癇發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要原因[14-15]。在癲癇發(fā)作后，部分神經(jīng)元損傷可通過調(diào)控Bcl-2/Bax、caspase家族等與凋亡相關(guān)的基因途徑實(shí)現(xiàn)[16]。Bcl-2發(fā)揮抗凋亡作用抑制細(xì)胞凋亡，而Bax發(fā)揮促凋亡作用促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2量大于Bax量時(shí)可抑制細(xì)胞凋亡，反之細(xì)胞凋亡增加[17]。caspase 3是caspase家族成員之一，發(fā)揮核心作用，其活化后可引起細(xì)胞凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示，無鎂誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞中circ_HECTD1表達(dá)升高，細(xì)胞活力降低，凋亡率升高，而抑制circ_HECTD1表達(dá)細(xì)胞活力增加，凋亡率降低，提示circ_HECTD1表達(dá)升高可能是引起神經(jīng)元細(xì)胞損傷的原因之一。

多項(xiàng)研究表明，腦部炎癥是癲癇形成及發(fā)作的一個(gè)重要機(jī)制，癲癇和炎癥間存在相互作用[19]。有研究表明，IL-1β、IL-6、TNF-α等多種炎性因子及相關(guān)受體參與癲癇發(fā)作[20]。在大腦中IL-1β及其受體分布廣泛，尤其在海馬中密度最高，有研究報(bào)道，在癲癇發(fā)作前IL-1β已升高，且持續(xù)至癲癇活動(dòng)結(jié)束，提示IL-1β可能通過增加神經(jīng)元敏感性，從而促進(jìn)癲癇發(fā)生[21]。IL-6是一種糖蛋白，由中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生，在正常狀態(tài)下，IL-6濃度很低，而在神經(jīng)元異?；顒?dòng)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時(shí)IL-6可大量產(chǎn)生，有研究顯示，在癲癇發(fā)作后，血清中IL-6濃度增加，提示IL-6可能通過影響神經(jīng)元從而提高癲癇的易感性[22]。有研究顯示，急性缺血性腦卒中circ_HECTD1表達(dá)與IL-6、TNF-α等促炎因子相關(guān)[23]。本研究結(jié)果顯示，抑制circ_HECTD1表達(dá)可明顯降低無鎂誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞IL-1β和IL-6表達(dá)。提示抑制circ_HECTD1表達(dá)可降低癲癇炎癥反應(yīng)。

NF-κB是一類可與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強(qiáng)子κB序列結(jié)合的蛋白因子，p50/p65異源二聚體是該家族成員之一，也是發(fā)揮主要作用的因子，在神經(jīng)細(xì)胞中廣泛存在，特別是大鼠海馬及皮質(zhì)區(qū)域[24]。多項(xiàng)研究表明，NF-κB的過度活化可參與急性炎癥過程，參與突觸可塑性變化、神經(jīng)元凋亡等過程，其過度激活可加重癲癇的發(fā)病[25]。本研究結(jié)果顯示，抑制circ_HECTD1表達(dá)可明顯降低無鎂誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞NF-κB/p65表達(dá)。

綜上所述，抑制circ_HECTD1表達(dá)可降低無鎂誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制NF-κB信號(hào)的過度活化有關(guān)。目前，circ_HECTD1對(duì)癲癇的影響研究較少，值得進(jìn)一步深入探究。