基于IKK/IκB/NF-κB信號(hào)通路探討?zhàn)B心顆粒干預(yù)急性心肌梗死后心室重構(gòu)的作用機(jī)制

姜芊竹，張 琪，楊建飛，萬(wàn)冬梅，孫 靜，邢露茗，封 笑，周亞濱

近年來(lái)，隨著我國(guó)人口結(jié)構(gòu)的老齡化，心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病率日益升高，其中急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)由于發(fā)病急、預(yù)后差，嚴(yán)重危害中老年人群的健康。冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊破裂形成血栓或者血管痙攣致使冠狀動(dòng)脈閉阻，相應(yīng)血管的供血區(qū)心肌出現(xiàn)持續(xù)性的缺血而導(dǎo)致AMI的發(fā)生[1]。隨著診療水平的提高和病人健康意識(shí)的增強(qiáng)，近10年來(lái)AMI急性期住院病人的死亡率大幅下降，但AMI急性期過(guò)后的心室重構(gòu)嚴(yán)重影響病人的預(yù)后，表現(xiàn)為梗死區(qū)域的心肌厚度及張力下降，非梗死區(qū)域的心肌肥厚擴(kuò)張，心室腔內(nèi)形態(tài)發(fā)生改變，進(jìn)而影響心室的收縮功能，隨之引發(fā)心律失常、心力衰竭等[2]。因此，AMI急性期過(guò)后對(duì)抗心室重構(gòu)的治療就顯得十分重要。

中醫(yī)在治療AMI及其并發(fā)癥中積累了大量的臨床經(jīng)驗(yàn)，具有獨(dú)特的療效，安全性較好的優(yōu)勢(shì)。研究報(bào)道，養(yǎng)心顆粒具有明確的治療不穩(wěn)定型心絞痛的作用[3]。本課題組前期研究表明，養(yǎng)心顆?？梢酝ㄟ^(guò)保護(hù)心肌細(xì)胞、抑制炎性因子的表達(dá)來(lái)改善心力衰竭大鼠的心肌功能[4]。本研究探討?zhàn)B心顆粒對(duì)抗AMI后心室重構(gòu)的作用，并通過(guò)抑制性核因子激酶κB(IKK)/磷酸化IκB(p-IκB)/核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號(hào)通路探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性清潔級(jí)SD大鼠60只，6～8月齡，體重(250±10)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(黑)2016004。飼養(yǎng)環(huán)境：早晚明暗自動(dòng)切換(07：00～19：00)，獨(dú)立通風(fēng)換氣系統(tǒng)，相對(duì)濕度40%～70%，溫度(24±2)℃。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 養(yǎng)心顆粒粉末，由黑龍江省藥材公司提供，組成(13味)：黃芪、人參、白茯苓、當(dāng)歸、半夏、川芎、酸棗仁、遠(yuǎn)志、茯神、辣桂、五味子、柏子仁、炙甘草，每克粉末含生藥量7 g，以蒸餾水配制成0.4 g/mL藥液，2～8 ℃冷藏保存。馬來(lái)酸依那普利片，由揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇制藥股份有限公司提供(批準(zhǔn)文號(hào)：H32026568)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-2(TIMP-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、干擾素-γ(IFN-γ)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(森貝伽生物公司)；兔抗大鼠NF-κB p65、IKK、核因子κB抑制劑(IκB-α)、p-IκBα-抗(Abcam公司)；Trizol(Ambion公司，批號(hào)：135306)。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 酶標(biāo)儀(美國(guó)Awareness公司，型號(hào)：Stat Fax-2100)；數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Alpha公司，型號(hào)：ALPHA1000-2)；光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司，型號(hào)：YS100)；動(dòng)物呼吸機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型號(hào)：R419智能型)；超薄切片機(jī)(德國(guó)Lecia公司，型號(hào)：RM2135)；多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)(北京航空航天大學(xué)圖像中心，型號(hào)：CMIA-008)；多道生理記錄儀(普升科技有限公司，型號(hào)：MP-160)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 分組及模型復(fù)制 將60只SD大鼠，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組(12只)和手術(shù)組(48只)，手術(shù)組大鼠按照如下方法復(fù)制大鼠AMI模型：腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉后，采用多道生理記錄儀監(jiān)測(cè)大鼠心電圖(ECG)，剔除ECG不正常者。將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，經(jīng)口進(jìn)行氣管插管，連接智能呼吸機(jī)，呼吸頻率90次/min，呼吸氣量比1∶1，潮氣量4～6 mL。用剃毛剪刀清理大鼠左側(cè)胸部毛，剪開(kāi)皮膚，用止血鉗固定，鈍性剝離左側(cè)第3肋～第4肋間肌肉，胸腔開(kāi)2 cm左右小口，輕輕按壓右側(cè)胸肋骨，暴露出心臟，鈍性剝離心包膜，在左心耳與肺動(dòng)脈圓錐左下緣處(左心耳下2～3 cm)進(jìn)針(3×8弧形針)，用醫(yī)用6-0號(hào)手術(shù)線(xiàn)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)。假手術(shù)組大鼠只穿線(xiàn)、不結(jié)扎[5]。將大鼠心臟放回胸腔，逐層縫合肌肉層，并用負(fù)壓管抽盡胸腔內(nèi)空氣，以免造成氣胸?？p合毛皮層。以大鼠結(jié)扎后ECG中S-T段抬高(產(chǎn)生J點(diǎn)位移)或者倒置為模型復(fù)制成功的標(biāo)志。術(shù)后腹腔注射青霉素2×105U/d，連續(xù)3 d，以預(yù)防胸腔感染。

本研究假手術(shù)組12只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部存活。手術(shù)組模型復(fù)制成功且術(shù)后存活的大鼠共36只，隨機(jī)分為模型組、養(yǎng)心顆粒組、依那普利組，每組12只。

1.5.2 給藥方法 模型復(fù)制成功后24 h內(nèi)，養(yǎng)心顆粒組大鼠每日灌胃養(yǎng)心顆粒12.07 g/kg(分早、晚2次給藥)；依那普利組每日灌胃依那普利混懸液10 mg/kg；模型組和假手術(shù)組灌胃等體積的生理鹽水。連續(xù)給藥8周。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察大鼠心肌組織病理變化 取實(shí)驗(yàn)大鼠外周血后，立即脫頸處死，迅速開(kāi)胸暴露心臟，取左心室梗死周?chē)募〗M織，4%多聚甲醛固定，用10%的EDTA脫鈣處理，梯度濃度乙醇脫水處理后用石蠟包埋，切片后HE染色，封片，光鏡下觀察各組大鼠心肌組織的病理學(xué)改變。

1.6.2 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清MMP-2及TIMP-2的含量 于末次給藥后3 h用毛細(xì)管引流眼底靜脈叢取靜脈血1 mL，靜置15 min后，低溫離心10 min(3 000 r/min)，取上層血清，采用ELISA法測(cè)定MMP-2及TIMP-2含量。

1.6.3 ELISA法測(cè)定大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6以及IFN-γ的含量 取各組大鼠梗死部位心肌組織，精密稱(chēng)量0.1 g，加入0.5 mL無(wú)菌生理鹽水，在冰浴上低溫勻漿3 min，勻漿液低溫離心10 min(3 000 r/min)，取上清液，采用ELISA法測(cè)定TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ含量。

1.6.4 蛋白免疫印跡法(Western Blot)測(cè)定大鼠心肌組織NF-κBp65、IKK-β、IκB-α和p-IκBα蛋白的表達(dá) 取梗死心肌組織，精密稱(chēng)量0.2 g，-80 ℃低溫保存。將低溫保存的大鼠心肌組織粉碎后，在液氮中研磨，加入細(xì)胞裂解液(Trizol)提取蛋白。加入等體積緩沖液，經(jīng)10%SDS-PAGE電泳(蛋白上樣量為50 μg)后，恒流電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，Tbs-Tween漂洗，加入5%的脫脂奶粉避光封閉1 h，Tbs-Tween漂洗3次，加入一抗(NF-κBp65、IKK-β、IκB-α、p-IκBα，1∶1 000)，4 ℃恒溫過(guò)夜。次日08：00用Tbs-Tween漂洗3次后，加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶2 500)，室溫溫育1 h，反復(fù)漂洗3次后，加入ECL，暗室曝光后進(jìn)行光密度掃描，分析條帶分子量及灰度值(β-actin為內(nèi)參蛋白)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理變化 假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核明顯，無(wú)形態(tài)改變及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)形態(tài)的改變，表現(xiàn)為伸長(zhǎng)、腫脹甚至是壞死，電鏡下可見(jiàn)水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞間可見(jiàn)膠原纖維增生；養(yǎng)心顆粒組和依那普利組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊度有所改善，腫脹和變形有所減輕，膠原纖維增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理變化(HE染色，×400)

2.2 各組大鼠外周血MMP-2及TIMP-2含量比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠外周血MMP-2明顯升高，TIMP-2明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，養(yǎng)心顆粒組和依那普利組大鼠外周血MMP-2明顯下降，TIMP-2明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；養(yǎng)心顆粒組與依那普利組大鼠外周血MMP-2、TIMP-2比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠外周血MMP-2及TIMP-2含量比較 (±s) 單位：ng/mL

2.3 各組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ含量變化 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，養(yǎng)心顆粒組和依那普利組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；養(yǎng)心顆粒組與依那普利組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ含量比較 (±s) 單位：pg/mL

2.4 養(yǎng)心顆粒對(duì)大鼠心肌組織NF-κBp65、IKK-β、IκB-α和p-IκBα蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織NF-κBp65和p-IκBα蛋白相對(duì)表達(dá)均明顯升高，IKK-β和IκB-α蛋白表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，養(yǎng)心顆粒組和依那普利組大鼠心肌組織NF-κBp65和p-IκBα蛋白相對(duì)表達(dá)均明顯降低，IKK-β和IκB-α蛋白表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；養(yǎng)心顆粒組與依那普利組大鼠心肌組織NF-κBp65、IKK-β、IκB-α和p-IκBα蛋白表達(dá)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)圖2、表3。

圖2 各組心肌細(xì)胞NF-κBp65、IKK-β、IκB-α和p-IκBα蛋白表達(dá)條帶圖

表3 各組大鼠心肌組織NF-κBp65、IKK-β、IκB-α和p-IκBα蛋白表達(dá)比較 (±s) 單位：ng/mL

3 討 論

心室重構(gòu)是慢性心力衰竭的主要病理基礎(chǔ)。心室長(zhǎng)期負(fù)荷過(guò)重，心肌收縮與舒張功能下降，不能維系正常的心排血量，導(dǎo)致心室發(fā)生代償性形態(tài)的改變[6]。大量研究表明，中藥復(fù)方可以通過(guò)多靶點(diǎn)、多信號(hào)通路改善梗死后的心室重構(gòu)[7-8]?！督饏T要略》中最早對(duì)此提出了“胸痹”“心水”“支飲”的概念，根據(jù)本課題組的臨床經(jīng)驗(yàn)，心室重構(gòu)的病人多見(jiàn)氣虛血瘀，其次為氣陰兩虛，少見(jiàn)痰阻血瘀證、氣滯血瘀證和陽(yáng)虛水泛證。根據(jù)心神失養(yǎng)、氣虛血瘀的病機(jī)，周亞濱教授擬方養(yǎng)心顆粒用于臨床多年，療效及安全性頗佳[9]。

養(yǎng)心顆?；A(chǔ)方來(lái)源于《證治準(zhǔn)繩·雜病證治類(lèi)方》之養(yǎng)心湯，由養(yǎng)心安神藥與補(bǔ)氣活血藥組成，主治心虛血少、驚惕不寧。方中人參、黃芪為君藥，人參定志安神、益肺補(bǔ)脾，黃芪益衛(wèi)固表、補(bǔ)氣升陽(yáng)。臣藥為白茯苓、茯神、川芎和當(dāng)歸。白茯苓與茯神兩藥合用寧心安神；川芎行氣活血、止痛祛風(fēng)，當(dāng)歸補(bǔ)血活血，兩藥合用補(bǔ)血養(yǎng)心。佐為遠(yuǎn)志、半夏、五味子、辣桂、酸棗仁、柏子仁。遠(yuǎn)志可安神寧心、祛痰開(kāi)竅；半夏燥濕化痰，以散擾心之痰涎；五味子生津斂汗、安神寧心，以收攝耗散之心氣；辣桂助陽(yáng)補(bǔ)心，加強(qiáng)補(bǔ)氣之功效，可引諸藥入心經(jīng)；酸棗仁、柏子仁兩藥合用安神養(yǎng)心、補(bǔ)斂心氣。使藥為炙甘草，可和胃補(bǔ)脾，益氣復(fù)脈，奏補(bǔ)土養(yǎng)心之效，助參芪成益氣之功。

心肌組織細(xì)胞外基質(zhì)降解在心室重構(gòu)過(guò)程中扮演著重要角色。MMP-2是MMPs家族重要的成員之一，是能特異性地使細(xì)胞外基質(zhì)降解的蛋白水解酶，TIMP-2可抑制MMP-2的活性，進(jìn)而降低心肌組織細(xì)胞外基質(zhì)的降解[10-12]。因此，MMP-2/TIMP-2存在一個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡，這個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡對(duì)維持心肌組織的完整結(jié)構(gòu)和穩(wěn)態(tài)內(nèi)環(huán)境具有重要的生理意義[13]。本研究結(jié)果表明，養(yǎng)心顆?？梢悦黠@降低細(xì)胞外基質(zhì)的降解，部分恢復(fù)心室重構(gòu)過(guò)程中MMP-2/TIMP-2的失衡。

炎癥反應(yīng)是AMI后心室重構(gòu)的發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[14]。炎性細(xì)胞因子受到細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境改變的刺激而激活后，促進(jìn)下游炎性信號(hào)通路的啟動(dòng)與傳導(dǎo)，進(jìn)而誘導(dǎo)心室重構(gòu)的發(fā)生與發(fā)展[15]。TNF-α、白細(xì)胞介素類(lèi)(ILs)等炎性細(xì)胞因子在心肌組織中的大量堆積，會(huì)降低心肌收縮力，并能導(dǎo)致心肌組織血管內(nèi)皮的損傷，使流經(jīng)心肌組織的血液處于高凝狀態(tài)。由此可見(jiàn)，此類(lèi)炎性因子在心肌組織中蓄積水平是衡量心室重構(gòu)嚴(yán)重程度的重要客觀指標(biāo)。與此同時(shí)抑制炎性反應(yīng)也是心室重構(gòu)的主要治療手段之一[16]。

IKK/IκB/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)了AMI后心肌細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和凋亡，是梗死后心室重構(gòu)逐漸形成過(guò)程中的主要發(fā)病機(jī)制[17]。NF-κB是一類(lèi)心肌細(xì)胞內(nèi)具有多項(xiàng)轉(zhuǎn)錄功能的蛋白，其中NF-κBp65是其主要的活性形式。生理狀態(tài)下，IκB與NF-κBp65在胞漿中結(jié)合成無(wú)活性的三聚體[18]。AMI發(fā)病后，刺激信號(hào)由心肌細(xì)胞外的IKK介導(dǎo)，活化的IKK復(fù)合物使IκB分子N端第32位和第36位的Ser磷酸化，導(dǎo)致IκB的分子結(jié)構(gòu)改變，p-IκB與NF-κB p65的三聚體解離，釋放出游離的NF-κB p65進(jìn)入心肌細(xì)胞核調(diào)控多個(gè)炎性相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄[19]。同時(shí)，細(xì)胞核內(nèi)促炎性基因的高表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)了相關(guān)炎性因子(如IL-1β、TNF-α、IFN-γ等)的合成和釋放，導(dǎo)致心肌組織進(jìn)一步損傷，這就形成了炎性因子激活和核內(nèi)轉(zhuǎn)錄的惡性循環(huán)。因此，多靶點(diǎn)治療抑制心肌細(xì)胞炎性連鎖反應(yīng)對(duì)抗心室重構(gòu)的治療就顯得格外重要，這也是中醫(yī)藥多靶點(diǎn)起效的優(yōu)勢(shì)所在[20]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，養(yǎng)心顆?？梢酝ㄟ^(guò)降低心肌組織的炎性細(xì)胞因子水平同時(shí)抑制IKK/IκB/NF-κB信號(hào)的傳遞來(lái)緩解AMI后的心室重構(gòu)，其作用效果與依那普利相當(dāng)。