黃芪多糖對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞能量代謝的影響

劉莉莉，王國(guó)良

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是各種心臟疾病發(fā)展的終末階段，5年生存率與惡性腫瘤相似，且隨著我國(guó)人口老齡化的加劇，CHF發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，增加家庭及社會(huì)負(fù)擔(dān)[1]。目前CHF的藥物治療以醛固酮拮抗劑、β-受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑等神經(jīng)內(nèi)分泌抑制劑為主，盡管可取得一定臨床療效，但該病致殘率及病死率仍居高不下[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，心力衰竭時(shí)心室擴(kuò)大及功能異常的病理學(xué)機(jī)制可能與心肌能量代謝障礙有關(guān)，成為CHF治療的新思路[4]。黃芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)提取自補(bǔ)氣中藥黃芪，具有抗炎、抗氧化、增強(qiáng)免疫能力、降血糖、抗腫瘤等多種藥理學(xué)活性[5]。近年來(lái)，有研究將APS用于糖尿病性心臟病的治療，效果滿意，且可改善膿毒癥大鼠心臟功能，證明其在心臟系統(tǒng)疾病治療中的作用[6-7]。然而，目前鮮有關(guān)于APS對(duì)CHF心肌細(xì)胞能量代謝的影響及相關(guān)機(jī)制的研究。鑒于此，本研究通過(guò)建立CHF模型大鼠，研究APS對(duì)其心肌細(xì)胞能量代謝的影響，并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60只無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)SD雄性大鼠，6周齡，體質(zhì)量(200±20)g，來(lái)自華北制藥股份有限公司[許可證號(hào)：SYXK(冀)2019-011]。飼養(yǎng)條件：溫度22～26 ℃，濕度40%～60%，正常飲食、飲水。

1.2 藥物、主要試劑和儀器 三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司)，凋亡細(xì)胞原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(上海通蔚生物科技有限公司)，5-單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體共激活因子-1(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1，PGC-1α)單抗(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，APS(西安明澤生物科技有限公司)，AMPK抑制劑Compound C(美國(guó)Apexbio公司)，卡托普利(四川太平洋藥業(yè)有限責(zé)任公司)，VEVO3100小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)(加拿大VisualSonics公司)，1200高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)，H-9500透射電鏡(日本株式會(huì)社日立制作所)，SM2010R徠卡切片機(jī)(德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司)；IX71-F22FL/PH顯微鏡(日本Olympus株式會(huì)社)；1658001 Mini-PROTEAN小型蛋白垂直電泳槽、ChemiDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型建立及分組 參照文獻(xiàn)[8]采用腹主動(dòng)脈縮窄法建立大鼠CHF模型。取60只SD大鼠，用2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位，用大鼠固定器固定，腹部常規(guī)剃毛、消毒，劍突下1 cm位置縱向切口，長(zhǎng)度約2 cm，分離腎動(dòng)脈上方腹主動(dòng)脈，長(zhǎng)度約1 cm。10只大鼠僅進(jìn)行以上手術(shù)操作，不結(jié)扎腹主動(dòng)脈，設(shè)為對(duì)照組。其余50只大鼠采用7號(hào)針頭平行于腹主動(dòng)脈放置，針頭與腹主動(dòng)脈一起結(jié)扎，結(jié)扎后抽出7號(hào)針頭，抽針時(shí)以感覺(jué)到箍筋感為宜，使腹主動(dòng)脈部分狹窄60%～70%。術(shù)后所有大鼠腹腔注射青霉素，每只2×105U/d，連續(xù)3 d。腹主動(dòng)脈結(jié)扎后8周，如大鼠出現(xiàn)勞力性呼吸困難、呼吸急促、心動(dòng)過(guò)速等失代償性癥狀，且經(jīng)小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)檢查左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricle ejection fraction，LVEF)<50%，則提示建模成功。將建模成功的41只大鼠隨機(jī)分為CHF組(10只)、挽回組(10只)、APS組(10只)、陽(yáng)性藥物組(11只)。

1.3.2 干預(yù)方式 APS組采用APS干預(yù)，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)確定APS使用劑量為400 mg/kg，溶于5 mL生理鹽水中灌胃給藥，每天1次，藥物干預(yù)后再采用生理鹽水2 mL灌胃，8 h后重復(fù)采用生理鹽水2 mL灌胃1次[9]；挽回組采用APS+AMPK抑制劑Compound C干預(yù)，400 mg/kg APS灌胃給藥，每天1次，Compound C水溶液2 mL(濃度10 μmol/L)灌胃，8 h后重復(fù)采用Compound C水溶液2 mL灌胃1次；陽(yáng)性藥物組采用卡托普利干預(yù)，卡托普利劑量為10 mg/kg，溶于5 mL生理鹽水灌胃給藥，每天1次，再采用生理鹽水2 mL灌胃，8 h后重復(fù)采用生理鹽水2 mL灌胃1次[10]；對(duì)照組與CHF組先給予5 mL生理鹽水灌胃，每天1次，再采用生理鹽水2 mL灌胃，8 h后重復(fù)采用生理鹽水2 mL灌胃1次。連續(xù)干預(yù)28 d。

1.3.3 超聲心動(dòng)圖測(cè)定心功能指標(biāo) 末次干預(yù)后4 h固定大鼠，采用超聲心動(dòng)儀測(cè)定心功能指標(biāo)：LVEF、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter，LVESD)、左心室短軸縮短率(left ventricular fraction shortening，LVFS)。

1.3.4 組織取材方式 心功能指標(biāo)測(cè)定完成后脫頸處死大鼠，迅速分離其心臟，用生理鹽水沖洗干凈心臟表面血液，去除周圍脂肪，濾紙吸干，沿房室溝減掉兩心房、肺動(dòng)脈、主動(dòng)脈，緊貼室間隔右側(cè)將右心室壁游離，剩余組織即為左心室。順左心室中部橫軸，取0.5 cm左右厚的左心室心肌組織用于測(cè)定ATP含量、觀察心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)、蘇木精-伊紅(HE)染色、TUNEL染色，剩余左心室組織保存于液氮中用于蛋白免疫印跡(Western Blot)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 測(cè)定心肌ATP含量 取左心室心肌組織，勻漿后12 000 r/min離心10 min(離心半徑8 cm)，取上清。以每孔50 μL置于96孔酶標(biāo)板中，按照ATP試劑盒說(shuō)明書(shū)要求采用高效液相色譜儀檢測(cè)。采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)測(cè)定樣本總蛋白濃度，換算為nmol/mg·prot形式表示。

1.3.6 透射電鏡觀察心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu) 取左心室心肌組織，用4%戊二醛磷酸緩沖液固定30 min后，制成1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm組織塊，4 ℃固定，脫水、浸透、包埋、染色，制作成超薄切片，厚度50～70 nm，透射電鏡下觀察心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)。

1.3.7 HE染色觀察心肌組織病理變化 取左心室組織，采用40%多聚甲醛固定，流水沖洗30 min后乙醇脫水、二甲苯透明、浸潤(rùn)石蠟制作成蠟塊，以病理切片機(jī)制作成5 μm連續(xù)切片，脫蠟后采用HE染色，顯微鏡下觀察梗死區(qū)心肌組織病理變化。

1.3.8 TUNEL染色觀察心肌細(xì)胞凋亡 取左心室心肌組織切片，用40%中性甲醛固定，脫水并包埋后采用病理切片機(jī)制作成連續(xù)切片，厚度4 μm，嚴(yán)格根據(jù)TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒操作要求進(jìn)行，加入TUNEL反應(yīng)混合液，于37 ℃濕盒中孵育，時(shí)間60 s，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)充分沖洗，加入植物過(guò)氧化物酶(POD)轉(zhuǎn)化劑，同條件繼續(xù)孵育30 s，PBS充分沖洗，加入辣根過(guò)氧化物酶顯色底物(DAB)溶液，常溫孵育3 s，PBS溶液充分沖洗，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水后采用中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞核被染成不同程度棕黃色為凋亡細(xì)胞，凋亡率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。每張切片任選5個(gè)視野計(jì)數(shù)，求平均值。

1.3.9 Western Blot法檢測(cè)心肌組織磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、AMPK、PGC-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量 取液氮保存的心肌組織40 mg，研磨充分后轉(zhuǎn)至離心管中，經(jīng)裂解液冰上裂解30 min，用12 000 r/min離心10 min(離心半徑8 cm)，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取30 μg待檢測(cè)樣本混合等體積上樣緩沖液，沸水浴5 min，用12 000 r/min離心20 min(離心半徑8 cm)，取上清，12% SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)儀將條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗大鼠一抗稀釋液[p-AMPK、AMPK、PGC-1α單抗(1∶1 000)]，4 ℃搖床孵育過(guò)夜，Tris緩沖生理鹽水(TBST)洗滌，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌。暗室顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析條帶灰度值，以p-AMPK、AMPK、PGC-1α與內(nèi)參β-actin條帶灰度值比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組心功能指標(biāo)比較 各組LVEF、LVEDD、LVESD、LVFS比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，CHF組、挽回組、APS組、陽(yáng)性藥物組LVEF、LVFS均降低，LVEDD、LVESD均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CHF組比較，挽回組、APS組、陽(yáng)性藥物組LVEF、LVFS均升高，LVEDD、LVESD均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與挽回組比較，APS組、陽(yáng)性藥物組LVEF、LVFS均升高，LVEDD、LVESD均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；APS組、陽(yáng)性藥物組LVEF、LVEDD、LVESD、LVFS比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組心功能指標(biāo)比較 (±s)

2.2 各組心肌組織ATP含量比較 各組心肌組織ATP含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，CHF組、挽回組、APS組、陽(yáng)性藥物組心肌組織ATP含量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CHF比較，挽回組、APS組、陽(yáng)性藥物組心肌組織ATP含量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與挽回組比較，APS組、陽(yáng)性藥物組心肌組織ATP含量均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；APS組、陽(yáng)性藥物組心肌組織ATP含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組心肌組織ATP 含量比較(±s) 單位：nmol/mg·prot

2.3 心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu) 對(duì)照組心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，大小均勻；CHF組心肌細(xì)胞線粒體排列紊亂、大小不一、數(shù)量減少，可觀察到明顯空泡變性，腫脹線粒體嵴減少，大部分發(fā)生斷裂，心肌細(xì)胞橫紋、潤(rùn)盤(pán)模糊，間質(zhì)中纖維結(jié)構(gòu)數(shù)量增加，部分區(qū)域纖維溶解、斷裂；挽回組、APS組、陽(yáng)性藥物組線粒體排列與大小變規(guī)則，數(shù)量逐漸增加，空泡變性及腫脹減輕，線粒體嵴增加，心肌橫紋、潤(rùn)盤(pán)變清晰。3個(gè)干預(yù)組中陽(yáng)性藥物組改善最為明顯，其次為APS組，最后為挽回組。詳見(jiàn)圖1。

圖1 透射電鏡觀察心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)(×20 000，標(biāo)尺20 μm)

2.4 心肌組織病理變化 對(duì)照組心肌細(xì)胞排列致密、整齊，心肌橫紋清晰；CHF組可觀察到心肌細(xì)胞發(fā)生明顯的變性及壞死，部分細(xì)胞核溶解、碎裂，部分心肌纖維變性、溶解、斷裂，心肌橫紋模糊或消失；挽回組、APS組、陽(yáng)性藥物組心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷有所減輕，心肌橫紋較為清晰。3個(gè)干預(yù)組中陽(yáng)性藥物組改善最為明顯，其次為APS組，最后為挽回組。詳見(jiàn)圖2。

圖2 HE染色觀察大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)(×200，標(biāo)尺100 μm)

2.5 各組心肌細(xì)胞凋亡情況比較 對(duì)照組、CHF組、挽回組、APS組、陽(yáng)性藥物組心肌細(xì)胞凋亡率分別為(3.57±0.46)%、(63.20±7.41)%、(31.97±4.58)%、(20.58±3.02)%、(12.54±1.57)%，各組凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=308.589，P<0.001)。與對(duì)照組比較，CHF組、挽回組、APS組、陽(yáng)性藥物組心肌細(xì)胞凋亡率均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與CHF組比較，挽回組、APS組、陽(yáng)性藥物組心肌細(xì)胞凋亡率均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與挽回組比較，APS組、陽(yáng)性藥物組心肌細(xì)胞凋亡率均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與APS組比較，陽(yáng)性藥物組心肌細(xì)胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。詳見(jiàn)圖3。

圖3 TUNEL染色觀察心肌細(xì)胞凋亡情況(×400，標(biāo)尺50 μm)

2.6 各組心肌組織PGC-1α蛋白、p-AMPK/AMPK比較 各組心肌組織PGC-1α蛋白、p-AMPK/AMPK比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組比較，CHF組、挽回組、APS組、陽(yáng)性藥物組PGC-1α蛋白、p-AMPK/AMPK均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與CHF比較，挽回組、APS組、陽(yáng)性藥物組PGC-1α蛋白、p-AMPK/AMPK均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與挽回組比較，APS組、陽(yáng)性藥物組PGC-1α蛋白、p-AMPK/AMPK均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；APS組、陽(yáng)性藥物組PGC-1α蛋白、p-AMPK/AMPK比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表3、圖4。

表3 各組心肌組織PGC-1α蛋白、p-AMPK/AMPK比較 (±s)

圖4 心肌組織p-AMPK、AMPK、PGC-1α 蛋白表達(dá)條帶圖

3 討 論

CHF是指心臟功能或結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致心室射血能力或心室充盈受損而引發(fā)的一組臨床綜合征，以肺循環(huán)、體循環(huán)淤血及組織血液灌注不足為主要病理表現(xiàn)，最終導(dǎo)致心臟泵血功能降低[11]。研究顯示，神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞因子過(guò)度激活導(dǎo)致的心室重構(gòu)是CHF發(fā)展的基礎(chǔ)[12]。心室重構(gòu)是一種極為復(fù)雜的過(guò)程，與心肌細(xì)胞肥厚、凋亡、能量代謝、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、基因表達(dá)異常、多種基因相互作用等一系列分子、細(xì)胞機(jī)制關(guān)系密切，從而導(dǎo)致心肌表型、結(jié)構(gòu)、功能改變[13]。隨著CHF治療從短期逆轉(zhuǎn)血流動(dòng)力學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)期、修復(fù)性策略，心室重構(gòu)及心肌細(xì)胞能量代謝逐漸成為研究熱點(diǎn)，有望為CHF治療提供新策略。心肌收縮與舒張都需要足夠能量供應(yīng)，ATP是心肌組織唯一可直接使用的能源，經(jīng)能量代謝途徑存儲(chǔ)在葡萄糖與脂肪酸中。心力衰竭時(shí)，ATP供應(yīng)不足，導(dǎo)致心肌收縮-耦聯(lián)障礙及收縮、舒張功能異常，從而誘發(fā)心力衰竭與能量代謝重構(gòu)[14]。此外，心肌細(xì)胞凋亡在CHF中發(fā)揮重要作用，過(guò)度凋亡將導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量不足，心肌收縮功能降低，引發(fā)CHF進(jìn)行性惡化。本研究中，與CHF組比較，APS組LVEF、LVFS升高，LVEDD、LVESD降低，心肌組織ATP含量較高，心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)、心肌組織病理變化較輕，心肌細(xì)胞凋亡率較低，提示APS可改善CHF大鼠心功能，改善心肌細(xì)胞能量代謝、心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)破壞、心肌組織病理變化，減少心肌細(xì)胞凋亡。APS是中藥黃芪的主要活性成分之一，除抗衰老、抗病毒、降血糖、調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤等藥理作用外，還具有抗血管內(nèi)皮損傷、抗心律失常、抗心肌重塑及抗心肌缺血的功效，提示其可用于心血管疾病治療[15]。陳彥等[16]研究顯示，黃芪及其組分可保護(hù)心肌線粒體結(jié)構(gòu)，激活生物氧化相關(guān)酶，調(diào)節(jié)肌酸激酶表達(dá)，從而發(fā)揮改善心肌能量代謝、延長(zhǎng)心力衰竭進(jìn)展的作用，本研究結(jié)果與其部分相似，提示APS在改善CHF心肌細(xì)胞能量代謝、減輕心室重構(gòu)方面的優(yōu)勢(shì)。

AMPK/PGC-1α信號(hào)通路是新發(fā)現(xiàn)的缺血缺氧、能量代謝調(diào)節(jié)相關(guān)通路。AMPK是一種異源性三聚體結(jié)構(gòu)，其催化亞基α亞基上第172位蘇氨酸磷酸化后可激活A(yù)MPK，通過(guò)影響細(xì)胞物質(zhì)代謝途徑促進(jìn)脂肪酸氧化及ATP生成，以維持細(xì)胞能量平衡，因此AMPK作為“能量調(diào)節(jié)器”及“細(xì)胞內(nèi)燃料機(jī)”備受關(guān)注。PGC-1α是重要的能量代謝輔助調(diào)節(jié)因子，其作為AMPK下游效應(yīng)分子，可被AMPK直接激活，通過(guò)促進(jìn)線粒體生物合成控制心肌能量動(dòng)態(tài)平衡。Quan等[17]研究發(fā)現(xiàn)，AMPK/PGC-1α信號(hào)通路與心肌缺血性損傷密切相關(guān)，心肌梗死后該通路表達(dá)水平明顯下調(diào)，導(dǎo)致線粒體功能異常，心肌能量供應(yīng)不足。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用中草藥混合物調(diào)節(jié)AMPK相關(guān)的葡萄糖代謝途徑增加肝臟和肌肉中琥珀酸脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶含量來(lái)改善糖原的儲(chǔ)存[18]。本研究結(jié)果顯示，CHF組、挽回組、APS組LVEF、LVFS依次升高，LVEDD、LVESD依次降低，心肌組織ATP含量依次升高，心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)、心肌組織病理變化依次減輕，心肌細(xì)胞凋亡率依次降低，p-AMPK/AMPK、PGC-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量依次升高，提示APS對(duì)CHF大鼠的治療作用可能與激活A(yù)MPK/PGC-1α信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，APS可改善CHF大鼠心功能及心肌細(xì)胞能量代謝，減輕心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)破壞及心肌組織病理變化，減少心肌細(xì)胞凋亡，推測(cè)其作用機(jī)制與激活A(yù)MPK/PGC-1α信號(hào)通路有關(guān)。