基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析苦參治療心律失常的潛在分子機(jī)制

韓曉雯，徐惠梅

心律失常(cardiac arrhythmia)是心臟活動(dòng)的起源和(或)傳導(dǎo)障礙導(dǎo)致心臟搏動(dòng)的頻率和(或)節(jié)律異常，是臨床常見病、多發(fā)病。常見于中老年病人，然而，由于現(xiàn)代人生活工作壓力大，心律失常發(fā)病越來越年輕化，且發(fā)病率也在不斷升高，醫(yī)療消耗巨大。苦參是中醫(yī)藥治療心律失常的常用藥，在臨床上常用于治療氣陰兩虛以及氣滯血瘀型心律失常。本研究旨在以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為背景，探究苦參治療心律失常的靶點(diǎn)成分及作用機(jī)制，以期為苦參治療心律失常的機(jī)制研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 苦參主要活性成分及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過查詢相關(guān)文獻(xiàn)及檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(TCMSP)，設(shè)置生物口服利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選依據(jù)，獲得苦參的主要活性成分，并于TCMSP提取所有活性成分相關(guān)的潛在作用靶點(diǎn)，而后于UniProt數(shù)據(jù)庫將相關(guān)靶點(diǎn)統(tǒng)一成基因名。

1.2 苦參與心律失常共同靶點(diǎn)篩選 以“cardiac arrhythmia”為關(guān)鍵詞，在基因名片數(shù)據(jù)庫(GeneCards)及DurgBank數(shù)據(jù)庫整理心律失常相關(guān)的作用靶點(diǎn)基因，利用Draw Venn Diagram對(duì)苦參靶點(diǎn)和心律失常靶點(diǎn)基因進(jìn)行交集映射，獲得苦參和心律失常的交集基因。

1.3 藥物成分靶點(diǎn)及疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 在Excel數(shù)據(jù)表中整理苦參活性成分靶點(diǎn)的type、network數(shù)據(jù)表，導(dǎo)入Cytoscape，建立藥物活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)圖，進(jìn)行可視化處理。

1.4 藥物-疾病蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將苦參與心律失常的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，物種限定為homospain，獲得苦參治療心律失常的核心靶蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)圖，并導(dǎo)出string-interaction.tsv文件，以與各個(gè)基因相關(guān)連節(jié)點(diǎn)數(shù)目為標(biāo)準(zhǔn)篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 基因本體(GO)富集分析及京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路分析 于基因功能分析網(wǎng)站Metascape(http://metascape.org)導(dǎo)入交集靶點(diǎn)基因，物種設(shè)置為homospains，得到苦參治療心律失常的主要通路及主要作用靶點(diǎn)，結(jié)果將以氣泡圖來展示。

2 結(jié) 果

2.1 苦參活性成分篩選結(jié)果 以“苦參”為關(guān)鍵詞進(jìn)行文獻(xiàn)搜索及TCMSP數(shù)據(jù)查詢，得到苦參的主要作用成分24種，去重后得到相關(guān)靶點(diǎn)202個(gè)，其中作用靶點(diǎn)數(shù)目>20個(gè)的活性成分有5個(gè)，分別為MOL000098槲皮素，靶點(diǎn)149個(gè)；MOL000456菜豆蛋白，靶點(diǎn)23個(gè)；MOL003542去甲脫水淫羊藿黃素，靶點(diǎn)28個(gè)；MOL000392刺芒柄花素，靶點(diǎn)36個(gè)；MOL000006木犀草素，靶點(diǎn)56個(gè)。詳見表1。以“cardiac arrhythmia”為關(guān)鍵詞分別檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫和DrugBank數(shù)據(jù)庫，共獲得978個(gè)與心律失常相關(guān)的靶點(diǎn)信息，將苦參主要活性成分的作用靶標(biāo)與cardiac arrhythmia的疾病靶標(biāo)取交集，共獲得交集靶點(diǎn)75個(gè)。為苦參的主要成分及相關(guān)靶點(diǎn)信息建立network、type文件夾，導(dǎo)入Cytoscape，繪制相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。詳見圖1。

表1 苦參主要成分及其相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)目信息

圖1 苦參活性成分靶點(diǎn)圖

2.2 心律失常相關(guān)靶點(diǎn) 以cardiac arrhythmia為關(guān)鍵詞，在GeneCards及DrugBank數(shù)據(jù)庫整合心律失常主要作用靶點(diǎn)共978個(gè)。

2.3 苦參-心律失常交集靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用在線繪圖工具Draw Venn Diagram對(duì)苦參靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集進(jìn)行交集映射，獲得苦參與心律失常的交集靶點(diǎn)75個(gè)。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將苦參與心律失常的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，得到蛋白與蛋白相互作用的tsv文件，再將文件導(dǎo)入Cytoscape，并設(shè)置以節(jié)點(diǎn)(node)大小來反映度值(degree)的大小，以邊(edge)的粗細(xì)設(shè)置來反映關(guān)聯(lián)度的大小，獲得最終的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。詳見圖2。由圖2可見主要起作用的靶點(diǎn)蛋白有白介細(xì)胞素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)、蛋白激酶B1(Akt1)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、絲裂原激活的蛋白激酶1(MAPK1)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、胱天蛋白酶3(CASP3)、腫瘤抑制蛋白(TP53)、Jun原癌基因(JUN)等。

圖2 交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 交集基因的富集分析 在Metascape行交集靶點(diǎn)的GO分析、KEGG富集分析。從生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)3種水平對(duì)75個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析得到：GO-BP分析到1 806條通路，GO-MF分析到90條通路，GO-CC分析到50條通路，根據(jù)P值篩選出GO分析的主要作用通路為血管發(fā)育、對(duì)無機(jī)物的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、白細(xì)胞分化、活性氧代謝過程等。交集靶點(diǎn)KEGG分析得到174條通路，其中主要包括白細(xì)胞介素-17(IL-17)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、甲狀腺癌、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)-糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)信號(hào)通路、胰島素抵抗、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、鈣信號(hào)通路等。再根據(jù)P值篩選出前20位，制成氣泡圖。詳見圖3～圖6。

圖3 苦參、心律失常共有基因的GO-BP分析

圖4 苦參、心律失常共有基因的GO-MF分析

圖5 苦參、心律失常共有基因的GO-CC分析

圖6 苦參、心律失常共有基因的KEGG通路富集分析

3 討 論

心律失常歸屬于中醫(yī)學(xué)“心悸”“怔忡”范疇。心血管疾病病死率為城鄉(xiāng)居民首位，其中心律失常發(fā)病率高，而且醫(yī)療費(fèi)用較高，但是臨床常用西藥治療本病的作用靶點(diǎn)單一，并有潛在的致心律失常作用，且長(zhǎng)期服藥肝腎毒副作用較大，西醫(yī)手術(shù)主要是射頻消融術(shù)，效果明顯，但是射頻消融手術(shù)治療是損傷性治療，且費(fèi)用較高，而中藥治療心律失常作用靶點(diǎn)較多，療效明顯且毒副作用較少，相較西醫(yī)手術(shù)治療來說，病人接受率更高，但還需要更多的現(xiàn)代藥理挖掘來為中醫(yī)藥治療心律失常提供更多的數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

《名醫(yī)別錄》記載：“苦參……養(yǎng)肝膽氣，安五臟，定志，益精，利九竅”，表明苦參有寧神定悸的作用。《神農(nóng)本草經(jīng)》：“苦參……主心腹氣結(jié)，癥瘕積聚，黃疸，溺有余瀝，逐水，除癰腫?！笨鄥⑹浅Ｓ玫男穆墒СＶ委熕幬?，可通過多個(gè)靶點(diǎn)來達(dá)到治療目的，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析為苦參的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，苦參的主要活性成分有24種，靶點(diǎn)數(shù)目>10個(gè)的活性成分有13個(gè)，其中與心律失常關(guān)系較為密切的有效成分主要有芒柄花黃素、木犀草素、苦參堿、槲皮素等，芒柄花黃素能通過減低肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)活性和丙二醛(MDA)含量，對(duì)缺氧損傷的H9c2心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[1]。木犀草素可上調(diào)小鼠肝臟肝X受體α基因(LxRα)表達(dá)，并能改善高膽固醇血癥和糖耐量異常，可增加HepG2細(xì)胞LxRα依賴蛋白的表達(dá)，參與膽固醇外流的LxRα、ATP轉(zhuǎn)運(yùn)盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G1(ABCG1)和B型1類清道夫受體(SRB1)的表達(dá)增加，以控制血脂，進(jìn)而減少對(duì)心臟的影響，降低心律失常發(fā)生率[2]?？鄥A在體外無β受體阻斷作用，但能產(chǎn)生短暫的心動(dòng)過緩(靜脈注射后3～4 min)，降低離體心肌收縮性，阿托品(205)不能阻斷該作用[3]。研究表明，苦參堿治療可以抑制蛋白激酶B(Akt)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路的激活，苦參堿通過抑制小鼠心臟成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和分化，從而預(yù)防肝纖維化重塑和心功能不全的發(fā)生，其機(jī)制可能是通過上調(diào)核糖體蛋白s5(rps5)在體內(nèi)和體外的表達(dá)來抑制p38通路，達(dá)到阻斷心臟肌細(xì)胞纖維化的誘導(dǎo)和進(jìn)展，從而減少心功能不全，因此，苦參堿可能是治療病理性心肌纖維化的一種有前途的治療藥物；另外，苦參堿治療能明顯阻攔阿霉素導(dǎo)致的心臟肌細(xì)胞凋亡，顯著減少人心臟成纖維細(xì)胞膠原合成，苦參堿治療甚至可以逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)小鼠先前存在的心臟纖維化；苦參堿已被批準(zhǔn)用來醫(yī)治病毒性肝炎和肝腫瘤，提示苦參堿是有效、安全的抗心肌纖維重塑和心功能不全的成分[4]。槲皮素可以下調(diào)高血壓大鼠血清中Toll樣受體4(TLR4)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)p65表達(dá)，下調(diào)心肌組織中TLR4蛋白及mRNA，以減少血管功能障礙、血管結(jié)構(gòu)改變，達(dá)到降低血壓、改善心室重構(gòu)的效果[5]。

苦參與心律失常的交集靶點(diǎn)蛋白有IL-6、VEGFA、EGF、Akt1、MMP9、MAPK1、CASP3、TNF、TP53、JUN等，其中VEGFA、EGF、IL-6與冠心病、心肌肥大等病情進(jìn)展密切相關(guān)，而VEGFA廣泛分布于腦、心等組織與細(xì)胞之中，在血管形成、動(dòng)脈粥樣硬化等方面有重要的調(diào)節(jié)作用[6]。VEGFA可有效促進(jìn)受損血管愈合，創(chuàng)傷中含有的VEGFA的數(shù)量與傷口恢復(fù)程度、速度呈正相關(guān)。表皮生長(zhǎng)因子可以加速內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞向創(chuàng)傷部位聚集移動(dòng)，加速創(chuàng)傷恢復(fù)。TNF的生物學(xué)功能包括抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、參與炎癥反應(yīng)等，通過多種途徑達(dá)到干預(yù)治療心律失常的目的。

GO功能富集分析顯示，苦參可通過作用于對(duì)受傷的反應(yīng)、血管發(fā)育、對(duì)無機(jī)物的反應(yīng)、對(duì)細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)等多條信號(hào)通路來達(dá)到治療心律失常的目的。根據(jù)苦參與心律失常交集基因的KEGG信號(hào)通路分析可以了解到，苦參對(duì)于心律失常作用與拮抗晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)誘導(dǎo)的細(xì)胞肥大、凋亡、炎癥反應(yīng)相關(guān)，另外還可以通過作用于IL-17信號(hào)通路、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移等炎性通道發(fā)揮作用，此外還可作用于鈣信號(hào)通道，調(diào)節(jié)離子通道，達(dá)到改善心律失常的目的[7]。KEGG分析中涉及的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種免疫性疾病，可作用于全身多個(gè)器官，除骨關(guān)節(jié)外，心臟是最常受累的器官，苦參可調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通道，治療心律失常。鈣離子通道是心律失常的重要離子通道，通過苦參的KEGG作用通路的詳細(xì)分析可了解到，苦參可對(duì)其鈣離子調(diào)節(jié)產(chǎn)生直接作用，達(dá)到治療心律失常的目的。

綜上所述，苦參通過調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)相關(guān)通路及免疫調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白等治療心律失常，通過調(diào)節(jié)相關(guān)炎性因子、生長(zhǎng)因子等來達(dá)到改善心律失常的目的。另外，還可以通過改善血糖、血脂情況來干預(yù)心律失常的進(jìn)展速度?？鄥⒂行С煞值淖饔冒悬c(diǎn)與心律失常的交集靶點(diǎn)數(shù)目多，可以通過作用于多條信號(hào)通路來達(dá)到治療心律失常的目的。