補(bǔ)體1q／腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白9抑制心肌成纖維細(xì)胞的激活和遷移

李香敏，譚延振，張 冰，趙 榮，金振曉，易定華，孫 陽，易 蔚，張 平

心肌梗死后心力衰竭的發(fā)病過程中抗心肌纖維化研究探索一直是心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，但是尚未研究出確實(shí)有效的治療靶點(diǎn)和方法。心肌成纖維細(xì)胞（cardiac fibroblasts，CFs）在心肌梗死后慢性心力衰竭的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。補(bǔ)體1q／腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白9（complement 1q／tumor necrosis factor related protein 9，CTRP9）作為一種分泌糖蛋白在心臟高度表達(dá)，在心血管疾病的保護(hù)中發(fā)揮重要的作用。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor－β，TGF－β）家族是當(dāng)前研究最多的纖維反應(yīng)調(diào)節(jié)因子之一，控制多種細(xì)胞過程，它在心肌損傷后的適應(yīng)不良和重塑中起著中心作用。蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）底物的磷酸化對細(xì)胞的代謝、分化、突觸傳遞、離子通道活性、生長發(fā)育等多種功能至關(guān)重要。

本研究應(yīng)用SD仔鼠原代CFs從細(xì)胞水平及蛋白分子水平研究介導(dǎo)CTRP9抗心肌纖維化作用及分子信號通路，從而研究出CTPR9通過PKA抑制CFs活性從而發(fā)揮抗心肌纖維化的作用及分子機(jī)理。

1 資料與方法

1.1材料 出生1～3天SD仔鼠由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)條件嚴(yán)格按照國家科學(xué)技術(shù)委員會頒布的《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》進(jìn)行。抗－CD31抗體、抗－膠原蛋白（Collagen）Ⅰ抗體、抗－CollagenⅢ抗體、抗－波形蛋白抗體購于abcam公司，CellTiter 96?Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay（MTS）購于Promega公司，細(xì)胞培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）低糖液體培養(yǎng)基購于HyClone公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購于gibco公司，H－89（dihydrochloride）購于MedChemExpress公司，磷酸－PKA C（Thr197）（D45D3）兔單克隆抗體、PKA RI－α（D54D9）兔單克隆抗體購于CST公司，rCTRP9由本實(shí)驗(yàn)室合成，Ⅱ型膠原酶購于Solarbio公司。

1.2方法

1.2.1原代CFs分離培養(yǎng)及純度鑒定 采用酶消化聯(lián)合差速貼壁方法分離SD仔鼠左心室CFs。采用光鏡觀察及免疫熒光染色鑒定分離的CFs純度。方法參考文章《原代SD仔鼠CFs分離培養(yǎng)方法改進(jìn)》。CFs純度可達(dá)95%以上，滿足實(shí)驗(yàn)需要。

1.2.2CFs增殖檢測 MTS法檢測CFs相對數(shù)量。

1.2.3CFs向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用免疫熒光染色及Western Blotting檢測CFsα－平滑肌肌動蛋白（α－smooth muscle actin，α－SMA）表達(dá)變化評估CFs向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

1.2.4細(xì)胞遷徙能力檢測 應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測CFs遷徙能力變化。

1.2.5CFs纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)變化檢測 Western Blotting檢測細(xì)胞CollagenⅠ、CollagenⅢ、結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）表達(dá)水平變化，應(yīng)用Image Lab 4．0．1軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 文中和圖中的所有數(shù)值均以n個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（standard error of mean，SEM）表示。數(shù)據(jù)用Graph Pad Prism－5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。對多組數(shù)據(jù)首先對所有實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行單向方差分析，然后進(jìn)行Bonferroni's多重比較檢驗(yàn)。P值≤0．05（雙側(cè)）認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CTRP9通過PKA通路抑制TGF－β1誘導(dǎo)CFs

的增殖活性作用 應(yīng)用MTS法檢測CFs相對數(shù)量，TGF－β1可誘導(dǎo)CFs的增殖活性，CTRP9可抑制TGF－β1誘導(dǎo)的CFs增殖活性的作用，PKA抑制劑H－89可阻斷CTRP9抑制TGF－β1誘導(dǎo)的CFs增殖活性的作用，且CTRP9＋H－89及H－89對CFs增殖活性無影響。見圖1。

圖1 CTRP9通過PKA通路抑制TGF－β1誘導(dǎo)CFs的增殖活性作用

2.2CTRP9通過PKA抑制TGF－β1誘導(dǎo)CFs向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化 應(yīng)用免疫熒光染色研究CFsα－SMA蛋白表達(dá)變化：無干預(yù)的Control組CFs表達(dá)很少的α－SMA蛋白，應(yīng)用TGF－β1刺激誘導(dǎo)后，CFs大量表達(dá)α－SMA蛋白，細(xì)胞表型向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變，應(yīng)用rCTRP9處理后可抑制TGF－β1刺激誘導(dǎo)的α－SMA蛋白表達(dá)，而應(yīng)用PKA抑制劑H－89后rCTRP9抑制TGF－β1誘導(dǎo)的α－SMA蛋白大量表達(dá)的作用減弱，rCTRP9聯(lián)合H－89及單用H－89對CFs表達(dá)α－SMA蛋白基本無影響；應(yīng)用Western Blotting研究得到相同結(jié)果：TGF－β1可誘導(dǎo)CFs表達(dá)α－SMA蛋白向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，CTRP9可抑制TGF－β1誘導(dǎo)的CFs表達(dá)α－SMA蛋白，抑制其向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而PKA抑制劑H－89可阻斷CTRP9抑制TGF－β1誘導(dǎo)CFs表達(dá)α－SMA蛋白的作用，且CTRP9＋H－89及H－89對CFs表達(dá)α－SMA蛋白無影響。見圖2。

圖2 TGF－β1誘導(dǎo)CFsα－SMA表達(dá)免疫熒光染色圖像及Western Blotting圖像及統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3CTRP9通過PKA抑制TGF－β1誘導(dǎo)的CFs遷徙 應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測rCTRP9及PKA抑制劑H－89不同干預(yù)處理對TGFβ1誘導(dǎo)CFs遷徙影響：TGF－β1可刺激誘導(dǎo)CFs遷徙，CTRP9可抑制TGF－β1誘導(dǎo)的CFs遷徙，而PKA抑制劑H－89可阻斷CTRP9的抑制TGF－β1誘導(dǎo)CFs遷徙的作用，且CTRP9＋H－89及H－89對CFs遷徙無影響。見圖3。

圖3 生長因子β1誘導(dǎo)的心肌成纖維細(xì)胞遷徙試驗(yàn)圖像及統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.4CTRP9通過PKA抑制TGF－β1誘導(dǎo)CFs纖維化相關(guān)蛋白表達(dá) 應(yīng)用Western Blotting檢測rCTRP9及PKA抑制劑H－89不同干預(yù)處理對TGF－β1誘導(dǎo)CFs表達(dá)CollagenⅠ、CollagenⅢ、CTGF三種纖維化相關(guān)蛋白影響：TGF－β1可誘導(dǎo)CFs CollagenⅠ、CollagenⅢ、CTGF三種常用的纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)水平增高，rCTRP9可抑制TGF－β1誘導(dǎo)的CFs CollagenⅠ、CollagenⅢ、CTGF表達(dá)增多，而PKA抑制劑H－89可阻斷CTRP9抑制TGF－β1誘導(dǎo)的CFs CollagenⅠ、CollagenⅢ、CTGF表達(dá)增多的作用。見圖4。

圖4 不同干預(yù)處理對TGF－β1誘導(dǎo)CFs表達(dá)纖維化相關(guān)蛋白的影響Western Blotting圖片及統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討 論

成纖維細(xì)胞是心肌纖維化過程中最直接的參與細(xì)胞，在心臟修復(fù)期，常駐的CFs群被激活［1－2］，通過合成α－SMA向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并分泌大量結(jié)構(gòu)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白［3－5］。心肌組織中TGF－β的表達(dá)在心肌梗死和心衰的動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭芯@著增加［6－7］，以TGF－β信號通路作為抑制纖維化治療的目標(biāo)被長期探索［8－10］。本研究應(yīng)用膠原酶消化聯(lián)合差速貼壁的方法分離出原代SD仔鼠CFs作為細(xì)胞模型，應(yīng)用在心肌損傷后的適應(yīng)和重塑中起著重要作用的TGF－β1［6，11］，在細(xì)胞水平研究CTRP9抗纖維化的作用及分子機(jī)理。

心臟損傷后成纖維細(xì)胞的擴(kuò)張和激活對心肌修復(fù)很重要，但也可能導(dǎo)致纖維化、重塑和功能障礙［5］。非梗死區(qū)成纖維細(xì)胞持續(xù)增殖激活是過度纖維化的發(fā)展一個重要方面，表達(dá)α－SMA是成纖維細(xì)胞激活的標(biāo)志。TGF－β1可刺激誘導(dǎo)SD仔鼠CFs增殖激活。本團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用CTRP9可明顯降低TGF－β1誘導(dǎo)CFs的增殖活性，但未完全阻斷CFs增殖活性。

TGF－β1可誘導(dǎo)CFs表達(dá)α－SMA，促使其向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。本團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CTRP9可明顯降低TGF－β1刺激誘導(dǎo)的SD仔鼠CFs表達(dá)α－SMA，應(yīng)用PKA抑制劑H－89后CTRP9的這種作用消失；CTRP9激活的促生存信號分子PKA不僅從抗心肌細(xì)胞凋亡方面減輕心肌重塑［12］，還可以通過抑制CFs過度增殖激活參與抗心肌纖維化作用。

心肌梗死后CFs遷徙能力增強(qiáng)也是心肌纖維化的一個重要原因，本課題應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用刺激TGF－β1誘導(dǎo)的CFs遷徙能力增強(qiáng)可被CTRP9明顯減弱，CTRP9的這種作用需要通過PKA通路，通過減弱CFs的遷徙能力，可減輕心肌梗死后成纖維細(xì)胞的過多聚集，發(fā)揮抗纖維化作用。

CollagenⅠ和Ⅲ是最常見的細(xì)胞外基質(zhì)成分，它們分別占心臟細(xì)胞外基質(zhì)膠原的85%～90%和5%～11%［13］。大多數(shù)心臟病都會導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)中膠原沉積增加和重排，這些變化是組織修復(fù)和纖維化的一種形式［14－15］。在心臟損傷或TGF－β刺激后CTGF表達(dá)上調(diào)，分泌儲存在細(xì)胞外基質(zhì)中，作為一種基質(zhì)細(xì)胞蛋白［16］，是一個纖維化效應(yīng)因子［17－18］。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)CTRP9對TGF－β1誘導(dǎo)的CFs分泌CollagenⅠ、Ⅲ及CTGF功能具有明顯抑制作用，且這種抑制作用可被PKA抑制劑H－89阻斷。

本研究發(fā)現(xiàn)CTRP9通過PKA通路可以降低TGF－β1誘導(dǎo)的CFs的增殖活性、向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化及遷徙的作用，從而減低纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)來發(fā)揮抗纖維化作用。對篩選心肌梗死后纖維化的治療靶點(diǎn)具有很重要的意義。