高通量測序分析鎘污染土壤原位修復(fù)中細(xì)菌群落的研究

聶衍韜,黃 聰

(中南安全環(huán)境技術(shù)研究院股份有限公司，湖北 武漢 430062)

1 引言

微生物在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用，它不僅作用于農(nóng)作物的生長，也容易受外界環(huán)境影響而改變[1,2]。通常情況下，在農(nóng)田土壤原位修復(fù)的過程中，修復(fù)處理工藝會引起微生物群落的變化，進(jìn)而影響農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性[3,4]。以重金屬污染農(nóng)田土壤原位修復(fù)工程為例，市面上常用的修復(fù)劑主要為無機(jī)、有機(jī)和微生物三類。眾多工程案例已證明它們對鎘(Cd)有良好的穩(wěn)定作用，但是這些處理方法對Cd污染土壤中微生物的影響尚不明確。

本研究以湖北省黃石市市郊的Cd污染農(nóng)田土壤為對象，采用高通量測序技術(shù)對無機(jī)、有機(jī)和微生物等3種不同土壤修復(fù)劑處理下Cd污染土壤的細(xì)菌群落進(jìn)行解析，以探究細(xì)菌群落對不同土壤修復(fù)劑的響應(yīng)變化，揭示不同細(xì)菌群落與有效態(tài)Cd含量的關(guān)系，期望為后續(xù)尋找新的微生物修復(fù)方法提供理論參考。

2 材料與方法

2.1 土壤概況及處理工藝

Cd污染土壤來自湖北省黃石市市郊農(nóng)田，土壤類型為巖泥田水稻土。經(jīng)初步檢測，試驗(yàn)土壤的pH值為6.5，總Cd含量為7.67 mg/kg。本試驗(yàn)中使用的有機(jī)、無機(jī)和微生物修復(fù)劑分別為生石灰-海泡石混合劑(CaO≥ 34%、pH=12)、生物炭(主要成分秸稈、雞糞)和芽孢桿菌，皆為固態(tài)粉末修復(fù)劑。其中生物炭來自河南椰碳環(huán)保材料有限公司，生石灰-海泡石混合劑來自環(huán)保橋(湖南)生態(tài)環(huán)境工程股份有限公司，芽孢桿菌來自武漢豐甜生物科技有限公司。

本試驗(yàn)共設(shè)計(jì)4個處理，即對照組(不進(jìn)行修復(fù)處理，CK)；無機(jī)修復(fù)組(添加石灰-海泡石混合劑粉末，T1)；有機(jī)修復(fù)組(添加生物炭粉末，T2)；微生物修復(fù)組(添加芽孢桿菌粉末，T3)，每個處理分別稱取5 kg土壤，加入等量的除鹽水和土壤修復(fù)劑均勻混合，土壤修復(fù)劑添加量為1%，各處理3次重復(fù)。將各組土壤移入實(shí)驗(yàn)玻璃容器中，隨后將實(shí)驗(yàn)玻璃容器置于室外，模擬自然環(huán)境對土壤的影響。試驗(yàn)為期30 d。

2.2 樣品收集和預(yù)處理

采用3點(diǎn)取樣法收集試驗(yàn)后的土壤樣品(500 g)。使用2 mm篩子過濾土壤樣品，將過濾后土壤樣品分為2份，1份儲存于4 ℃下用于測定土壤中有效態(tài)Cd含量；1份儲存于-80 ℃下用于DNA提取。

2.3 土壤有效態(tài)Cd的分析

土壤有效態(tài)Cd含量采用M3溶液(HOAc-NH4NO3-NH4F-HNO3-EDTA)浸提，后采用石墨爐原子吸收分光光度法測定。

2.4 DNA提取與高通量測序

DNA提取選用PowerSoil?土壤DNA提取試劑盒，按照其說明書要求進(jìn)行采集。提取后的DNA使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳試劑盒評估其提取質(zhì)量。將合格的DNA委托武漢華大基因科技有限公司完成擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因V3-V4區(qū)域(338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)和Illumina Miseq雙端測序工作。

2.5 數(shù)據(jù)分析

使用USEARCH[5]軟件在≥97%的相似度下，對獲得的序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)的聚類、分析。通過比對親緣關(guān)系的方法，注釋每個OTU的分類學(xué)信息[6]，比較分析土壤樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及組成。基于OTU數(shù)據(jù)計(jì)算各土壤樣本的α-多樣性指數(shù)及各注釋水平的相對豐度。使用R軟件對有效態(tài)Cd與主要屬水平微生物的關(guān)系進(jìn)行相關(guān)性分析。

有效態(tài)Cd及α-多樣性指數(shù)數(shù)據(jù)分析均采用Excel軟件(2016版本)進(jìn)行處理，并使用SPSS軟件進(jìn)行組間方差分析，組間差異顯著性水平P<0.05。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同處理方式對土壤細(xì)菌群落OTUs組成及多樣性的影響

12個Illumina Miseq高通量測序土壤樣品共產(chǎn)生319801條優(yōu)質(zhì)序列，平均每個樣品18605～32003。稀釋性曲線是判斷樣品測序結(jié)果是否能夠反映樣品實(shí)際微生物信息的分析方法。如圖1所示，測序序列深度達(dá)到15000條以上，曲線趨于平坦，表明測序深度足夠覆蓋不同處理的土壤樣品中絕大多數(shù)微生物種群信息。因此，根據(jù)樣品的最低序列數(shù)進(jìn)行抽平，對抽平后序列進(jìn)行后續(xù)的細(xì)菌群落分析。

由表1可知，在本研究中，Chao1和ACE指數(shù)反映物種豐富度，Shannon、Simpson指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育多樣性(phylogenetic diversity,PD)指數(shù)反映物種多樣性。根據(jù)表1可知，4組土壤樣品都具有較高的覆蓋率(>99%)。CK組具有最高的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和PD指數(shù)，說明Cd污染土壤樣品具有較高的物種多樣性。除T1組外，T2和T3組Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)(P<0.05)均顯著低于CK組，說明T2和T3組會減少土壤細(xì)菌群落的物種豐富度，這與Li等[7]的研究結(jié)果相一致。其可能的原因是，石灰-海泡石屬于無機(jī)物，主要是通過吸附作用和提升土壤的pH值以達(dá)到修復(fù)土壤的目的，短期內(nèi)對細(xì)菌群落影響不大。而生物炭和芽孢桿菌處理直接作用于土壤微生物系統(tǒng)，提升了能穩(wěn)定有效態(tài)Cd的一類細(xì)菌在系統(tǒng)中的優(yōu)勢，從而導(dǎo)致了其他細(xì)菌群落的減少，綜合比較不同土壤修復(fù)劑處理后土壤細(xì)菌群落多樣性，CK>T1>T2>T3。

圖1 不同土壤修復(fù)劑處理后土壤細(xì)菌群落的稀疏曲線

表1 不同土壤修復(fù)劑處理后土壤細(xì)菌群落的α多樣性指數(shù)

3.2 不同處理方式對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)容易受到重金屬含量的影響，其可作為鑒定土壤修復(fù)進(jìn)展的指標(biāo)之一[8]。如圖2所示，土壤樣品中前10個優(yōu)勢菌門分別為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、酸桿菌門(Acidobacteriota)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidota)、第四門(Gemmatimodota)、厚壁菌門(Firmicutes)、Myxococcota、浮霉菌門(Planctomycetota)、GAL15，其平均相對豐度分別為28.28%、21.93%、17.82%、7.03%、6.65%、4.31%、3.71%、2.37%、2.15%、1.67%。其中變形菌門、放線菌門和酸桿菌門是Cd污染土壤中主要的優(yōu)勢菌門，三者相對豐度之和接近70%左右。該結(jié)果與Pei等[9]的研究結(jié)果相似。

需要額外說明的是，T3組中厚壁菌門的相對豐度可達(dá)11.51%，遠(yuǎn)高于其他組，說明外源添加的芽孢桿菌可以在含Cd土壤中定殖[10]。

如圖3可知，在屬水平上，T1組中主要的優(yōu)勢菌屬與CK組的優(yōu)勢菌屬的種類較為相似，但兩組中優(yōu)勢菌屬的平均相對豐度存在明顯差異。T2組中觀察到Subgroup_17、Sphingomos等優(yōu)勢菌屬的平均相對豐度變化顯著。T3組最主要差異在于芽孢桿菌屬(Bacillus)，其平均相對豐度分別在T3組達(dá)到11.25%。值得注意的是，norank_f_Vicimbacteraceae在T2和T3組中平均相對豐度與CK組無明顯差異，而在T1組的平均相對豐度僅為4.01%，比CK組降低了35.02%，說明石灰-海泡石處理會顯著改變norank_f_Vicimbacteraceae在土壤中的豐度，可能與石灰使得pH值呈堿性有關(guān)。

注：Others表示相對豐度<1%的微生物合集

注：Others表示相對豐度 < 1%的微生物合集

3.3 有效Cd含量與主要差異屬的關(guān)系

不同處理方式下的有效Cd含量見表2，隨后用相關(guān)性分析的方法探究不同處理的差異屬與有效Cd含量的關(guān)系。結(jié)果表明，有效Cd含量與MND1、Ellin6055、Lacunisphaera、P2-11E和UTCFX1呈正相關(guān)，無負(fù)相關(guān)的細(xì)菌屬(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)見表3。

表3 有效Cd含量與主要差異屬的關(guān)系的相關(guān)性系數(shù)

4 結(jié)論

(1)石灰-海泡石、生物炭和芽孢桿菌的處理均會影響土壤細(xì)菌群落的多樣性，其中芽孢桿菌處理對土壤細(xì)菌群落的影響最顯著。

(2)主要優(yōu)勢菌門組成為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)和酸桿菌門(Acidobacteriota)，不同處理方式對主要優(yōu)勢菌門結(jié)構(gòu)影響差異明顯，在屬水平細(xì)菌群落組成差異較大。

(3)與有效Cd含量有關(guān)的微生物屬主要是MND1、Ellin6055、Lacunisphaera、P2-11E和UTCFX1。