胃蛋白酶水解藏羊血清蛋白工藝研究

張婭俐 洪晶 曹竑 田曉靜 王婷婷 張福梅 柏家林 丁功濤 馬忠仁 宋禮

摘要 為進一步利用血液資源，以藏羊血清為原料，采用胃蛋白酶對其進行水解。以水解度為指標，研究pH、溫度、加酶量3個因素對藏羊血清水解度的影響規(guī)律;在此基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken響應面試驗優(yōu)化胃蛋白酶水解藏羊血清蛋白工藝條件。結(jié)果表明：底物濃度為5%、加酶量為6 200 U時，最佳水解條件：溫度為46 ℃、pH為2.25、酶解時間2 h，水解度為（23.41±0.23）%。

關(guān)鍵詞 胃蛋白酶;水解;羊血清蛋白;響應面

中圖分類號 TS 251.9? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）03-0174-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.03.047

Study on the Process of Gastric Protease Hydrolysis and Serum Protein in Sheep

ZHANG Ya-li， HONG Jing， CAO Hong et al

（School of Life Sciences and Engineering， Northwestern University of Nationalities， Lanzhou， Gansu 730124）

Abstract In order to make further use of blood resources， the serum of sheep was used as raw material and hydrolyzed by gastric protease. Taking hydrolysis as the index， the effect law of pH， temperature and enzyme addition on serum hydrolysis of Tibetan sheep was studied， and on this basis， the gastric protease hydrolysis process conditions of sheep serum protein were optimized by Box-Benhnken response surface test. The results showed that when the substrate concentration was 5% and the enzyme amount was 6 200 U， the optimal hydrolytic conditions were as follows： temperature 46 ℃， pH 2.25， enzymatic hydrolysis time 2 h， and the degree of hydrolysis was （23.41 ± 0.23）%.

Key words Gastric protease;Hydrolysis;Ovine serum protein;Response surface

基金項目 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助（31920200115）;科技部援助項目（KY201501005）;甘肅省自然科學基金資助（18JR3RA371）。

作者簡介 張婭俐（1996—），女，重慶人，碩士研究生，研究方向：特種經(jīng)濟動物飼養(yǎng)。通信作者，教授，從事食品生物技術(shù)及安全控制研究。

收稿日期 2021-05-18

血液一般占畜禽活體重4.0%～9.8%[1]。羊血是肉類加工業(yè)的主要副產(chǎn)物之一，羊血液中幾乎含有人體所需的全部營養(yǎng)物質(zhì)，包括大部分的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素以及鉀、鈉、鈣、鐵等微量元素[2]。它還可作為醫(yī)學和生物學中細菌培養(yǎng)、細菌鑒別及免疫學檢測的重要試驗材料，是動物血液中適合作培養(yǎng)基的物資，此外羊血中還含有專一性很強的凝血酶和超氧化物歧化酶等對人體有益的物質(zhì)[3]。但由于許多原因，我國羊血資源利用率很低，多數(shù)屠宰企業(yè)將血液直接排放，造成寶貴的蛋白質(zhì)資源浪費[3]。目前國內(nèi)外將動物血液用于林化工業(yè)、制藥、肥料、葡萄酒等工業(yè)[4]。

胃蛋白酶是一種消化性酸性蛋白酶，在適宜的環(huán)境中可將蛋白質(zhì)分解為肽片段和酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸。不同的蛋白酶水解羊血清蛋白速率、水解產(chǎn)物都有很大差異。近年來，對其的研究引起了食品學界的廣泛關(guān)注[5-6]。當前國內(nèi)外有關(guān)利用植物蛋白[7-8]和動物蛋白[9-10]進行蛋白酶水解生產(chǎn)多肽的研究很多，利用動物血液開發(fā)功能性成分已成為研究熱點，但研究多局限于豬血，關(guān)于羊血的研究鮮見報道。

筆者以胃蛋白酶對藏羊血清蛋白進行水解，測定其水解度，通過響應面試驗優(yōu)化其酶解條件，以期為藏羊血資源和藏羊血清功能多肽的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍干燥處理的藏系綿羊血清，簡稱“藏羊血清”（青海省海西州天峻縣）;胰蛋白酶（北京中生瑞泰發(fā)展有限公司，3 000 U/mg）;三氯乙酸、茚三酮、正丁醇、氫氧化鈉、鹽酸等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

722E型可見光分光光度計（上海光譜儀器有限公司）;HWS28電熱恒溫水浴鍋（上海-恒科技有限公司，上海-恒科學儀器有限公司）;GL-3250B控溫磁力攪拌器（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司）;TGL-16M高速臺式冷凍離心機（湘儀離心機儀器有限公司）;LabconcoFreezoneil臺式凍干系統(tǒng)（上海比朗儀器有限公司）;DHP-9272型恒溫干燥箱（上海一恒科技有限公司）;JA2003N型電子天平（上海精密科技儀器有限公司）;PB-10型精密pH計（Sartorius公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 藏羊血清蛋白酶解液的制備。

準確稱取5.0 g藏羊血清蛋白，加入100 mL超純水溶解，調(diào)節(jié)pH，加入適量胃蛋白酶，在特定的溫度下進行水解。水解后于95 ℃滅酶15 min，加入一定量10%三氯乙酸后，于8 000 r/min離心15 min，取上清液分析。

1.3.2 水解度的測定方法。

采用茚三酮比色法[11]測定樣品中氨基酸含量，并以式（1）計算水解度（degree of hydrolysis，DH）。為消除不同氨基酸因呈色不同而對測定造成的誤差[12-13]，式中采用待水解原料的完全水解液作為標準。

水解度的計算公式如下：

DH=（Ah-A0）/（A1-A0）×100%（1）

式中：Ah為酶解液中總游離氨基數(shù)，mmol;

A1為原料蛋白強酸水解后的總游離氨基數(shù)，mmol;

A0為原料蛋白中固有的游離氨基數(shù)，mmol。

以甘氨酸含量（mg）為x軸，吸光值為y軸繪制標準曲線，曲線的回歸方程為y=0.008 0x+0.043 5，R2=0.992 8。從圖1可見，在甘氨酸含量0～200 mg呈良好的線性關(guān)系。

1.3.3 胃蛋白酶活力的測定。

采用福林法測定胃蛋白酶活力[5]。

1.3.4 單因素試驗設(shè)計。

為優(yōu)化藏羊血清蛋白水解效果，在底物濃度為5%的條件下，研究pH（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0）、加酶量（3 000、4 500、6 000、7 500、9 000 U）和酶解溫度（20、30、40、50、60 ℃）對胃蛋白酶水解藏羊血清蛋白效果的影響。

1.4 響應面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用Box-Behnken響應面設(shè)計，設(shè)計見表1。采用F檢驗對胃蛋白酶水解藏羊血清蛋白的試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，評價模型的統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 溫度對水解度的影響。

酶蛋白分子的肽鍵具有特定的空間結(jié)構(gòu)，在反應溫度超某一極限值時，易引起肽鍵的斷裂，從而導致酶活性降低[14];但如果反應溫度過低，蛋白分子體系內(nèi)運動的激烈程度會大大降低，導致酶與底物碰撞幾率的降低[15]。

在底物濃度為5%、加酶量6 000 U、pH為3.0的條件下酶解2 h，研究酶解溫度（20、30、40、50、60 ℃）對胃蛋白酶水解藏羊血清蛋白效果的影響，結(jié)果見圖2。從圖2可知，酶解溫度在20～50 ℃時，水解度隨溫度的升高而增大;酶解溫度超過50 ℃后，水解度迅速下降。故選擇較佳的酶解溫度為50 ℃。

2.1.2 加酶量對水解度的影響。

在蛋白質(zhì)的水解過程中，隨著加酶量的增大，溶液中水解的初速度增大，當原有的蛋白質(zhì)減少到一定程度以后，增加溶液中胃蛋白酶的濃度，其能夠與大分子蛋白質(zhì)產(chǎn)生作用的幾率比之前大大降低，因此并不是酶添加量越高其作用效果越大。根據(jù)酶動力學可知，酶的用量過少難以得到最大的水解度，過多會造成資源浪費[16]。

在底物濃度為5%、酶解溫度為50 ℃、pH為3.0的條件下酶解2 h，研究加酶量（3 000、4 500、6 000、7 500、9 000 U）對胃蛋白酶水解效果的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，藏羊血清蛋白水解度隨著加酶量的增加不斷升高，當加酶量超過6 000 U后水解度增加緩慢。故選擇較佳的加酶量為6 000 U。

2.1.3 酶解pH對水解度的影響。

pH對水解度的影響主要表現(xiàn)于對酶活性的影響，因為胃蛋白酶的活性范圍為pH在1～5，在偏中性尤其是堿性環(huán)境中胃蛋白酶就會發(fā)生解鏈而失去活性[17]。pH對水解度的影響不僅要考慮酶本身所產(chǎn)生的生物水解作用，更重要的是要考慮低pH環(huán)境對藏羊血清蛋白所產(chǎn)生的化學水解對生物水解作用的影響。

在底物濃度為5%、酶解溫度為50 ℃、加酶量為6 000 U的條件下酶解2 h，研究酶解pH（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0）對胃蛋白酶水解效果的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，在pH小于3.0時，藏羊血清蛋白水解度隨著酶解pH的升高不斷增大;當酶解pH超過3.0后，其水解度逐漸下降。故選擇較佳的酶解pH為3.0。

2.2 響應面試驗結(jié)果

2.2.1 建立回歸模型及方差分析。

Box-Behnken響應面試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。采用Design-Expert進行數(shù)據(jù)分析，以水解度為響應值，經(jīng)回歸擬合得到胃蛋白酶水解藏羊血清蛋白關(guān)于3因素的回歸方程為

Y=19.81+0.18A+0.41B+1.97C-2.73A2-3.27B2-1.12C2-0.66AB-0.85AC+0.20BC

二次多項方差分析結(jié)果見表3，由表3可知，回歸模型 F=17.29，P<0.01，說明三元二次回歸模型極顯著;失擬項不顯著（P>0.05）;總回歸模型R2=0.957 0，調(diào)整后模型相關(guān)系數(shù)Radj2=0.901 6，說明該回歸方程的擬合度較好，實際值與

預測值有較好的擬合相關(guān)性，試驗方法可靠，可以用來預測

試驗結(jié)果。通過回歸系數(shù)絕對值對各因素變化與

水解度高低之間的分析，結(jié)果顯示，影響胃蛋白酶水解效果的各因素由大到小為C>B>A，即3個因素對水解度的影響表現(xiàn)為加酶量>pH>溫度。

2.2.2 響應面交互作用分析。

為了更直觀地反映兩兩因素交互作用對胃蛋白酶水解效果的影響，根據(jù)回歸方程繪制出其響應面圖和等高線圖，結(jié)果見圖5。

各因素交互作用對響應值影響程度的強弱與響應面坡度和等高線密集度有關(guān)。響應面曲面坡度越陡峭，表示二者交互作用越顯著[18-19]，等高線圓形時交互作用較弱[20]。由圖5可以看出，加酶量與pH交互作用的響應曲面坡度最陡峭，且其等高線圖橢圓率高，pH和加酶量的交互作用對胃蛋白酶水解效果影響最顯著;溫度和pH等高線圖形狀較圓，表示因素交互作用較弱，即溫度和pH的交互作用對胃蛋白酶水解效果影響不顯著。

2.2.3 驗證試驗。

根據(jù)所建立的二次多項回歸方程進行最優(yōu)化分析，胃蛋白酶水解藏羊血清蛋白最佳條件為：溫度（A）為46 ℃，pH為2.25，加酶量（C）為6 200 U，水解時間2 h，在該條件下，所建立模型預測的水解度最高可達（23.60±0.27）%。經(jīng)試驗驗證，在該條件下重復試驗3次得到的水解度平均值為（23.41±0.23）%，與模型的預測值接近，表明模型擬合良好，方法具有可行性。

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應面法優(yōu)化了胃蛋白酶水解藏羊血清蛋白的條件，最后建立了水解度與酶解溫度、pH、加酶量3個因素的二次多項式回歸模型，驗證試驗證明了該模型的可靠性。優(yōu)化獲得胃蛋白酶水解藏羊血清蛋白的最佳酶解條件：底物濃度為5%，溫度為46 ℃，pH為2.25，加酶量為6 200 U，水解時間2 h。在該工藝條件下，藏羊血清蛋白的水解度為（23.41±0.23）%。

水解藏羊血清蛋白是蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域中的熱門方向，各種藏羊血清蛋白的酶解方法、檢測手段也越來越受國內(nèi)外學者的重視。該研究結(jié)果為藏羊血清的利用提供了又一種思路，也為今后關(guān)于藏羊血清蛋白水解物的利用與開發(fā)提供了基礎(chǔ)。

參考文獻

[1] 李芙琴，馬黎明.淺談家畜血液資源的開發(fā)利用[J].養(yǎng)殖與飼料，2010（6）：73-75.

[2] 李晨光，莊紅，呂學舉，等.動物血液血紅素鐵提取方法研究[J].食品工業(yè)科技，2008，29（1）：308-310.

[3] 周成偉，李芮洋，李景敏，等.羊血的開發(fā)和利用[J].科技視界，2019（13）：81-82.

[4] 王芳，徐桂花，田建文.羊肉部分下腳料的利用與開發(fā)[J].食品工業(yè)科技，2009，30（11）：347-348，352.

[5] 任建東，施用暉，樂國偉，等.鹿茸血肽疏水性分離及抗氧化和ACE抑制作用的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010，22（2）：302-306.

[6] 勵建榮，封平.功能肽的研究進展[J].食品科學，2004，25（11）：415-419.

[7] 程云輝，王璋，許時嬰.麥胚蛋白的研究進展[J].食品與機械，2006，22（2）：105-108.

[8] NAKAMURA Y，MASUDA O，TAKANO T.Decrease of tissue angiotensin I-converting enzyme activity upon feeding sour milk in spontaneously hypertensive rats[J].Bioscience，biotechnology，and biochemistry，1996，60（3）：488-489.

[9] 陳勝軍，李來好，曾名勇，等.羅非魚魚皮膠原蛋白降血壓酶解液的制備與活性研究[J].食品科學，2005，26（8）：229-233.

[10] 徐懷德，劉偉，姜莉.草魚生物飲料加工技術(shù)研究[J].西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版），2004，32（10）：59-62.

[11] 余勃，陸兆新.微生物發(fā)酵法產(chǎn)大豆多肽液水解度的測定[J].食品科學，2005，26（4）：104-107.

[12] 徐英操，劉春紅.蛋白質(zhì)水解度測定方法綜述[J].食品研究與開發(fā)，2007，28（7）：173-176.

[13] 郭興鳳.蛋白質(zhì)水解度的測定[J].中國油脂，2000，25（6）：176-177.

[14] 鄧乾春，陳春艷，潘雪梅，等.白果活性蛋白的酶法水解及抗氧化活性研究[J].農(nóng)業(yè)工程學報，2005，21（11）：155-159.

[15] 王梅，谷文英.酶解玉米黃粉蛋白制備可溶性肽[J].糧油食品科技，1999，17（1）：1-3.

[16] 王碩，木泰華，李鵬高.胃蛋白酶水解甘薯蛋白制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽的研究[J].食品科技，2011，36（8）：2-7.

[17] 曹竑，朱麗麗.風味蛋白酶水解藏羊血清蛋白工藝的研究[C]//中國畜牧獸醫(yī)學會家禽生態(tài)學分會學術(shù)研討會論文集.北京：中國畜牧獸醫(yī)學會，2015：237-241.

[18] GHAEDI A M，GHAEDI M，VAFAEI A，et al.Adsorption of copper（II）using modified activated carbon prepared from Pomegranate wood：Optimization by bee algorithm and response surface methodology[J].Journal of molecular liquids，2015，206：195-206.

[19] 黃典，高雅，劉蕾，等.蛋白酶水解美味牛肝菌工藝優(yōu)化及酶解產(chǎn)物的抗氧化活性[J].食品工業(yè)科技，2021，42（12）：209-217.

[20] 周丹丹，周春暉，黃惠華.猴頭菇多糖的超聲輔助罐組式動態(tài)逆流提取及純化研究[J].食品工業(yè)科技，2017，38（5）：279-284.