2種羌活藥用植物的葉綠體基因組密碼子使用偏性分析

王琳璇 王高烽 谷威 趙志敏 馬永貴

摘要 對(duì)羌活（Notopterygium incisum）與寬葉羌活（N.franchetii）的葉綠體編碼基因的密碼子使用偏性（codon usage bias）及其影響因素進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：羌活和寬葉羌活的葉綠體基因組總ENC值分別為49.79和49.70，偏性較弱，密碼子第3位堿基傾向于使用A/T。PR2-plot分析表明，選擇壓力和突變都是影響2種羌活葉綠體密碼子使用偏性的主要因素;而中性繪圖分析和ENC-plot分析表明選擇壓力是影響2種羌活葉綠體密碼子使用偏性的主要因素。相對(duì)同義密碼子使用度（RSCU）分析確定了2種羌活中使用頻率較高的30個(gè)高頻密碼子，幾乎都以A或U結(jié)尾，只有UUG以G結(jié)尾。羌活的最優(yōu)密碼子9個(gè)，寬葉羌活的最優(yōu)密碼子7個(gè)。2種羌活有5個(gè)最優(yōu)密碼子相同，分別是UUG、CAU、CGU、AGU、GGA。該研究結(jié)果為后續(xù)藥用羌活植物的基因表達(dá)、蛋白質(zhì)翻譯和遺傳育種研究提供了研究依據(jù)和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞 羌活;寬葉羌活;葉綠體基因組;密碼子使用偏性;最優(yōu)密碼子

中圖分類號(hào) Q 943.2? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2022）03-0095-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.03.025

Codon Usage Bias in Chloroplast Genomes of Two Medicinal Species of Notopterygium H. de Boissieu

WANG Lin-xuan， WANG Gao-feng， GU Wei et al

（College of Life Sciences， Qinghai Normal University， Xining， Qinghai 810000）

Abstract This study analyzed the codon usage bias and affecting factors of the protein coding genes （CDS） of the chloroplast genomes of two medicinal plants， Notopterygium incisum and N. franchetii. The results showed that the chloroplast genomes of N. incisum and N. franchetii had a total ENC value of 49.79 and 49.70， respectively， indicating weak codon usage bias. The third base of the codon of the two chloroplast genomes preferred to use A/T. The analysis of PR2-plot showed that selection pressure and nutation were the main factors affecting the bias of codon usage in N. incisum and N. franchetii CDS， while neutrality plot and ENC-plot analyses both illustrated selection pressure was the main factors affecting codon usage bias in the two species. Relative Synonymous Codon Usage （RSCU） analysis determined 30 high-frequency codons used in N. incisum and N. franchetii， almost all ending with A or U， with only UUG ends with G. There were nine optimal codons identified in N. incisum， and seven optimal codons found in N. franchetii. The five optimal codons shared by N. incisum and N. franchetii were namely UUG， CAU， CGU， AGU， GGA. The results provide important basal data for the future study of gene expression， protein translation and molecular breeding of medicinal Notopterygium plants.

Key words Notopterygium incisum;Notopterygium franchetii;Chloroplast genome;Codon usage bias;Optimal codons

基金項(xiàng)目 青海省基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2018-ZJ-741）。

作者簡(jiǎn)介 王琳璇（1994—），女，河北廊坊人，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

通信作者，教授，博士，從事動(dòng)植物分子進(jìn)化與適應(yīng)研究。

收稿日期 2021-04-03

密碼子在蛋白質(zhì)合成過程中起著傳遞遺傳信息的關(guān)鍵作用，在大多數(shù)情況下，編碼同一氨基酸的同一密碼子的使用頻率是不同的，這一現(xiàn)象稱為密碼子使用偏性（codon usage bias）。某一物種或某一基因通常傾向于使用一種或幾種特定的同義密碼子，這些密碼子被稱為最優(yōu)密碼子（optimal codon）。影響密碼子使用偏性的因素很多，最主要的因素是定向突變和中性選擇[1-3]，還包括GC含量、同義替換率[4]、tRNA豐度[5]、有效翻譯起始位點(diǎn)的選擇[6]、密碼子親水性和DNA復(fù)制起始位點(diǎn)[7]、基因長(zhǎng)度[8]和表達(dá)水平[9]等。在不同物種中，突變和選擇的影響強(qiáng)度不同。例如在藍(lán)藻中，影響密碼子使用偏性較大的是GC組成與選擇壓力[10]，但在果蠅中則是突變對(duì)的密碼子使用偏性影響較大[3]。

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的器官，也參與到植物的氨基酸合成等通路中。作為植物重要的細(xì)胞器，葉綠體有自己一套獨(dú)特的遺傳信息[11]。針對(duì)葉綠體基因組的密碼子使用偏性研究，可以幫助了解葉綠體蛋白質(zhì)編碼基因的使用偏好，為后續(xù)遺傳改造和基因表達(dá)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，乳油木葉綠體基因組密碼子使用偏性更多受突變影響[12]，選擇壓力對(duì)其使用偏性影響較小。杜梨葉綠體密碼子使用偏性則主要受選擇的影響[13]。胡曉艷等[14]在對(duì)酸棗葉綠體基因組的研究中獲得了7個(gè)最優(yōu)密碼子。

羌活屬（Notopterygium Boissieu）植物隸屬于傘形科（Apiaceae）美味芹族，是我國(guó)特有的多年生草本藥用植物，主要分布在我國(guó)西南部高山地區(qū)[15]。據(jù)《中國(guó)植物志（英文版）》記載，該屬包括寬葉羌活、羌活、羽苞羌活、瀾滄羌活、卵葉羌活和細(xì)葉羌活6個(gè)種[16]?！吨袊?guó)藥典》規(guī)定的羌活基源植物為羌活與寬葉羌活，入藥部位為干燥根及根莖，具有解表散寒、祛風(fēng)除濕和止痛的功效。羌活主要產(chǎn)于四川、云南，次產(chǎn)于青海及甘肅;寬葉羌活主產(chǎn)于甘肅、青海，次產(chǎn)于四川、山西和內(nèi)蒙古等地。近年來，由于過度采挖及生境受到嚴(yán)重破壞，野生羌活的自然群體已經(jīng)面臨瀕危，被載入《中國(guó)生物多樣性紅色名錄（高等植物卷）》[17]。羌活作為一味傳統(tǒng)的中藥，富含異歐芹素、羌活醇、阿魏酸等活性物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化、抗心律失常、抗菌、抗癌細(xì)胞增殖等藥效作用[18]。目前有關(guān)羌活屬葉綠體基因組密碼子使用偏性研究鮮見報(bào)道。該研究擬對(duì)2種可以入藥的羌活屬植物，即羌活和寬葉羌活進(jìn)行葉綠體基因組的密碼子使用模式分析，研究結(jié)果不但可以闡明羌活光合作用相關(guān)基因的使用偏好，也可為羌活基因表達(dá)研究及遺傳育種研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

羌活樣品采集于青海省果洛藏族自治州達(dá)日縣，99.46° E，33.77° N，海拔3 943.24 m。寬葉羌活樣品采自青海省瑪可河麥浪溝，100.96° E，32.84° N，海拔3 790.78 m。保存于干冰中，送于北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行葉綠體基因組測(cè)序。利用Illumina HiSeq X Ten 平臺(tái)測(cè)序，使用MIRA序列組裝軟件的MIRA v3.4.1.1模塊進(jìn)行，最終得到羌活的葉綠體全基因組序列長(zhǎng)度為 157 050 bp。寬葉羌活的葉綠體全基因組序列長(zhǎng)度為 142 184 bp。測(cè)序結(jié)果提交至NCBI（national center for biotechnology information），登錄號(hào)：羌活MW820163、寬葉羌活MW820162。使用Geneious11.1.5 提取編碼基因（coding sequence，CDS）并篩選，剔除小于300 bp的基因，并選擇起始密碼子為ATG的編碼基因進(jìn)行后續(xù)分析，最終羌活獲得51條編碼基因，寬葉羌活獲得50條編碼基因。

1.2 分析方法

1.2.1 密碼子相關(guān)參數(shù)計(jì)算。

使用軟件codonW1.4.2分析獲得的編碼基因，計(jì)算有效密碼子數(shù)（effective number of codon，ENC）。ENC范圍一般在20～61，越接近20，表示密碼子使用偏性越大。使用在線分析軟件CUSP（http：//embossgui.sourceforge.net/demo/）對(duì)葉綠體基因組密碼子的GC含量等堿基組成信息進(jìn)行研究，并對(duì)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析[19]。

1.2.2 中性繪圖分析。

分別以CGC1、CGC2、CGC3表示密碼子第1、2、3位的GC含量，CGC12表示CGC1與CGC2的平均數(shù)，以CGC3和CGC12為橫、縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，分析葉綠體基因組密碼子第3位和前2位的相關(guān)性，從而分析影響密碼子偏性的因素[20]。以CGC3、CGC12為橫、縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，如果CGC3和CGC12呈顯著相關(guān)，說明密碼子第3位的堿基組成與前2位相似，密碼子偏性主要受突變的影響;如果CGC3和CGC12無顯著相關(guān)關(guān)系，趨勢(shì)線斜率接近0，則說明密碼子第3位與前2位堿基組成差異較大，密碼子堿基相對(duì)保守，這種情況密碼子偏性更多受選擇的影響[21]。

1.2.3 PR2-plot繪圖分析。

為進(jìn)一步分析影響2種羌活葉綠體基因組密碼子偏性的因素，以CA3、CT3、CC3、CG3分別表示密碼子第3位A、T、C、G 4種堿基的含量，以CG3/（CG3+CC3）為橫坐標(biāo)，CA3/（CA3+CT3）為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖。如果大部分基因分布在圖像上半部，說明密碼子第3位堿基含量A>T，反之則T>A，同理如果大部分基因分布在圖像右半部，說明密碼子第3位堿基含量G>C，反之則C>G。若點(diǎn)在圖中均勻分布，則密碼子偏性完全受突變影響[20-21]。

1.2.4 ENC-plot繪圖分析。

以GC3為橫坐標(biāo)，以ENC值為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，并以ENC期望繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

ENC期望=2+CGC32+29CGC32+（1-CGC3）2

標(biāo)準(zhǔn)曲線表示在無選擇壓力的情況下ENC與CGC3的關(guān)系，如果點(diǎn)主要分布于曲線附近，說明密碼子偏性更多受突變的影響，如果點(diǎn)分布于距標(biāo)準(zhǔn)曲線較遠(yuǎn)的位置，則說明密碼子偏性更多受選擇的影響。根據(jù)公式（ENC期望-ENC實(shí)際）/ENC期望制作ENC分布頻數(shù)表，統(tǒng)計(jì)ENC實(shí)際與ENC期望的差距[22]。

1.2.5 RSCU分析。

使用CodonW計(jì)算2種羌活葉綠體基因組的RSCU（relative synonymous codon usage）。RSCU是實(shí)際觀察到的某密碼子使用頻率與預(yù)期（該密碼子編碼的氨基酸的同義密碼子使用頻率相等時(shí)）使用頻率的比值。理論值與預(yù)期值相等時(shí)，密碼子不存在偏性。所以當(dāng)RSCU=1.00，表明密碼子使用無偏性;RSCU>1.00時(shí)，表明該密碼子實(shí)際使用頻率較高;RSCU<1.00時(shí)，表明實(shí)際使用頻率較低[23]。

1.2.6 最優(yōu)密碼子分析。

選出2種羌活葉綠體編碼基因密碼子ENC值最大的10%和最小的10%，分別建立高低表達(dá)庫(kù)，選出庫(kù)中ΔRSCU>0.08且整體RSCU>1.00的密碼子[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子組成

2種羌活葉綠體基因組密碼子第3位的堿基組成結(jié)果顯示，羌活的葉綠體基因組密碼子第3位的CA3、CT3分別為42.75%與46.97%（表1），明顯高于CC3、CG3，說明羌活葉綠體基因組密碼子多以AT結(jié)尾;寬葉羌活的密碼子第3位堿基組成與羌活類似，AT含量較高。 羌活與寬葉羌活的葉綠體密碼子第1位GC含量從第1位到第3位逐漸下降，第1位分別為46.16%、45.99%，第2位38.17%、37.91%，第3位29.97%、29.67%。2種羌活的ENC均大于49.00，說明2種羌活葉綠體基因組密碼子偏性較弱。

使用CUSP統(tǒng)計(jì)2種羌活葉綠體基因組編碼基因的CGC、CGC1、CGC2、CGC3、ENC，結(jié)果表明，羌活和寬葉羌活的葉綠體基因組編碼基因的CGC平均值為38.64%和38.44%（表2），差異不大。羌活和寬葉羌活中CGC最高的基因皆為rps11，CGC最低的基因?yàn)閥cf1。羌活和寬葉羌活編碼基因的ENC值范圍分別是36.33～55.03、37.97～57.09，而且羌活約有83%編碼基因的ENC值大于45.00，寬葉羌活有79%編碼基因的ENC值大于45.00，說明多數(shù)編碼基因密碼子使用偏性較弱。2種羌活的rps8的ENC值最小，分別為36.33和37.97，表明rps8在2種羌活葉綠體編碼基因中偏性最強(qiáng)。

對(duì)2種羌活的葉綠體編碼基因的CGC1、CGC2、CGC3、GC、ENC、葉綠體編碼基因序列長(zhǎng)度（sequence length，SL）等參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明2種羌活的堿基組成相關(guān)性較接近，CGC1與CGC2皆為極顯著相關(guān)（表3），且CGC1、CGC2都與CGC3無顯著相關(guān)性;2種羌活的GC含量與第1、2、3位組成均極顯著相關(guān)。羌活與寬葉羌活的SL與CGC1、CGC2、CGC3、GC、ENC均無顯著相關(guān)性。2種羌活的相關(guān)性分析結(jié)果也存在一定差異，羌活的ENC與CGC3極顯著相關(guān)，而寬葉羌活的ENC除了與CGC3極顯著相關(guān)外，還與GC顯著相關(guān)。

2.2 中性繪圖分析

羌活的CGC12取值范圍為 0.324～0.550（圖1），CGC3與CGC12的回歸系數(shù)為0.218 7，皮爾森系數(shù)為0.147，無顯著相關(guān)性，說明羌活的葉綠體密碼子第3位堿基組成與第1、2位差異較大，密碼子偏性主要受選擇的影響。寬葉羌活的CGC12的取值范圍0.321～0.547（圖1），CGC3與CGC12的回歸系數(shù)為0.431 7，皮爾森系數(shù)為0.316，相關(guān)性較低，說明寬葉羌活的葉綠體密碼子第3位堿基組成與第1、2位差異較大，密碼子偏性受選擇影響較大。

2.3 PR2-plot分析

PR2-plot分析以CG3/（CG3+CC3）為橫坐標(biāo)，CA3/（CA3+CT3）為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，結(jié)果表明，2種羌活大部分基因分布在右下方位置（圖2），說明羌活和寬葉羌活的葉綠體基因組密碼子不僅受到突變的影響，還受到選擇的影響，并且密碼子第3位的堿基頻率T>A，G>C。

2.4 ENC-plot分析

對(duì)2種羌活進(jìn)行ENC-plot繪圖分析，結(jié)果見圖3。標(biāo)準(zhǔn)曲線表示在無選擇壓力的情況下，ENC與CGC3的關(guān)系。如果點(diǎn)主要分布于曲線附近，說明密碼子偏

性更多受突變的影響，如果點(diǎn)分布于距標(biāo)準(zhǔn)曲線較遠(yuǎn)的位置，說明密碼子偏性更多受選擇的影響。2種羌活的編碼基因在標(biāo)準(zhǔn)曲線兩側(cè)均有基因分布，大部分基因位于標(biāo)準(zhǔn)曲線下側(cè)，部分基因距標(biāo)準(zhǔn)曲線較遠(yuǎn)。

為了進(jìn)一步分析ENC實(shí)際值與標(biāo)準(zhǔn)曲線的偏離情況，制作ENC分布頻數(shù)表，結(jié)果見表4，羌活有24個(gè)基因的比值在-0.05～<0.05，表明有24個(gè)基因的ENC實(shí)際值與期望值接近（ENC比值-0.05～<0.05），其余27個(gè)基因的ENC實(shí)際值與期望值相差較大（ENC比值>0.05或<-0.05），其中psbA、rps8、rp116、petD、psbC、psbD、petB的ENC實(shí)際值距標(biāo)準(zhǔn)曲線較遠(yuǎn)（ENC比值>0.15）。寬葉羌活有23個(gè)基因的比值在-0.05～<0.05，ENC實(shí)際值與期望值接近，27個(gè)基因ENC實(shí)際值與期望值差距較大，其中rps8、petB、petD、psbC、ndhE、ndhI的ENC實(shí)際值距標(biāo)準(zhǔn)曲線較遠(yuǎn)。說明2種羌活的葉綠體基因組密碼子偏性受突變的影響較小，更多受選擇的影響。

2.5 RSCU分析

由表5可知，羌活和寬葉羌活各有30個(gè)密碼子RSCU>1.00，說明各有30個(gè)密碼子的使用有偏好性。實(shí)際使用頻率偏高（RSCU>1.00）的密碼子中結(jié)尾為U的有16個(gè)，結(jié)尾為A的有13個(gè)，只有UUG以G結(jié)尾。說明2種羌活葉綠體基因組密碼子偏好以A、U結(jié)尾，其中U的偏好性略強(qiáng)于A。

2.6 最優(yōu)密碼子確定

2種羌活的最優(yōu)密碼子均符合總RSCU>1.00，ΔRSCU≥0.08。2種羌活的最優(yōu)密碼子都多以A/U結(jié)尾，只有UUG以G結(jié)尾。確認(rèn)了羌活的最優(yōu)密碼子9個(gè)（UUG、CUU、ACU、UAU、CAU、AAU、CGU、AGU、GGA），寬葉羌活的最優(yōu)密碼子7個(gè)（UUG、CCA、CAU、CGU、AGU、AGA、GGA）。2種羌活有5個(gè)最優(yōu)密碼子相同，分別是UUG、CAU、CGU、AGU、GGA（表6）。

3 討論

該研究對(duì)羌活和寬葉羌活基因組密碼子使用偏好性及其主要影響因素進(jìn)行了探討和比較。結(jié)果表明，ENC小于45的基因較少，多數(shù)基因ENC較高，說明2種羌活基因組密碼子使用偏性均較弱。相關(guān)性分析結(jié)果表明，2種羌活的葉綠體基因組ENC都與CGC3顯著相關(guān)，說明密碼子第3位堿基組成對(duì)密碼子偏性的影響較大，這與原曉龍等[25]對(duì)云南藍(lán)果樹的研究結(jié)論一致。而尹為治等[26]研究結(jié)果表明，坡壘的葉綠體基因組密碼子第1位堿基組成對(duì)密碼子偏性的影響更大。密碼子組成分析顯示，2種羌活的總GC和CGC3較低，且CGC1>CGC2>CGC3，密碼子的第3位傾向于使用A/T，第3位堿基使用頻率T>A，G>C。

突變和選擇壓力是2個(gè)影響密碼子偏性的主要因素。PR2-plot分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因分布在圖中發(fā)生了偏移，可知2種羌活的葉綠體密碼子使用偏性不僅受到了突變的影響，還受到了選擇壓力的影響。中性繪圖結(jié)果顯示，2種羌活CGC12與CGC3相關(guān)性不顯著，說明密碼子第3位的堿基組成與前兩位差異大，密碼子相對(duì)保守，表明選擇壓力對(duì)密碼子的影響較大。ENC-plot結(jié)果顯示，2種羌活的多數(shù)葉綠體基因偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)一步證實(shí)選擇壓力是影響2種羌活葉綠體密碼子使用偏性的主要因素。綜上所述，2種羌活的葉綠體基因組密碼子使用偏性受到突變和選擇壓力的影響，最主要的影響因素是選擇壓力。影響竹亞科的巴山木竹、印度簕竹、Olyra latifolia L.以及苦蕎的葉綠體基因組密碼子使用偏性的主要因素也是選擇壓力[27-28]。而突變對(duì)槲蕨屬的川滇槲蕨、櫟葉槲蕨的葉綠體基因組密碼子使用偏性的影響更大[29]。

羌活和寬葉羌活的葉綠體基因組密碼子使用模式較為相似。2種羌活的總GC含量與密碼子各位的GC含量差異不大;葉綠體基因組密碼子偏性都較弱;密碼子第3位都傾向于使用A/T，且堿基含量T>A，G>C;影響密碼子使用偏性的主要因素都是選擇壓力。

通過RSCU分析，確定了2種羌活中使用頻率較高的30個(gè)高頻密碼子（RSCU>1.00），幾乎都以A或U結(jié)尾，只有UUG以G結(jié)尾。確認(rèn)了羌活的最優(yōu)密碼子9個(gè)（UUG、CUU、ACU、UAU、CAU、AAU、CGU、AGU、GGA），寬葉羌活的最優(yōu)密碼子7個(gè)（UUG、CCA、CAU、CGU、AGU、AGA、GGA）。2種羌活有5個(gè)最優(yōu)密碼子相同，分別是UUG、CAU、CGU、AGU、GGA。

該研究通過對(duì)2種羌活藥用植物的葉綠體基因組編碼基因的使用偏性進(jìn)行比較分析，得出主要結(jié)論：①2種藥用羌活葉綠體基因組的密碼子使用偏性整體較為相似，且偏性較弱;②密碼子的第3位傾向于使用A、T;③突變和選擇壓力在2種羌活的密碼子使用偏性中起主要作用，其中選擇壓力對(duì)密碼子使用偏性影響更大。該研究結(jié)果為后續(xù)藥用羌活植物的基因表達(dá)、蛋白質(zhì)翻譯和遺傳育種研究提供了研究依據(jù)和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，有潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。

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