黃芪中黃芪多糖的提取工藝研究進展

宮安東，宋夢鴿，王高瞻，郜 振，雷銀玉，孫美鶴

(1. 信陽師范學院 生命科學學院，河南 信陽 464000； 2. 河南黑馬動物藥業(yè)有限公司，河南 禹州 461670)

0 引言

黃芪(Astragaluslicentianus)為草本、稀為小灌木或半灌木植物，屬于雙子葉植物綱豆科黃耆屬，是一種比較常見的中藥材植物，主要分布于我國的東北、華北及西北地區(qū)，耐旱耐寒，在全國各地均可栽種。作為常用傳統(tǒng)中藥，黃芪的藥用價值極高，具有降低血壓、增強免疫力、補氣健脾、抗菌消炎等功效。此外，黃芪也是民間常用的食材，具有補氣養(yǎng)血、提高免疫力等功效。

黃芪中含有多糖、皂甙、氨基酸等多種化學成分，其中以黃芪多糖的應用研究報道最多。黃芪多糖是黃芪中的一種重要活性成分，是黃芪干燥根提取物中的主要成分，呈棕黃色粉末，主要由葡聚糖和雜多糖組成，具有抑菌、抗炎、利膽、保肝和免疫調(diào)節(jié)的作用[1]。另外，有相關研究表明黃芪多糖能顯著降低糖尿病大鼠的血糖和血脂水平，改善胰島素耐受性，減輕糖尿病并發(fā)癥[2]。目前，工業(yè)生產(chǎn)中的黃芪多糖多從黃芪中提取而來，迄今為止，應用的黃芪多糖提取方法多樣，主要有溫水提醇沉法、堿溶提取法、堿醇提取法、酶輔助提取法、超聲波提取法和生物發(fā)酵提取法等。工業(yè)生產(chǎn)中上述方法均有使用，然而，各提取方法的優(yōu)勢與不足，以及不同提取方法的優(yōu)劣比較，尚未有研究揭示。為進一步比較不同提取工藝的優(yōu)劣，篩選高效的黃芪多糖提取工藝，提升產(chǎn)業(yè)化應用，本文對現(xiàn)有的黃芪多糖提取工藝進行綜述，并分析不同提取流程，比較分析不同工藝的提取效率，明確最優(yōu)的提取工藝，研究結果將為黃芪多糖工業(yè)生產(chǎn)中提取工藝的再優(yōu)化提供參考。

1 溫水提醇沉法

溫水提醇沉法操作簡單，所需試劑常見易得，提取流程簡便，是生產(chǎn)黃芪多糖比較常用的方法。該方法首先將黃芪碾碎制成粉末，然后加入適當比例的水在適宜溫度下煎煮，離心后于上清液中加入無水乙醇析出沉淀，將沉淀干燥后得到粗多糖。

杜國豐等[3]利用溫水提醇沉法，比較在不同的提取時間、提取溫度、料液比條件下，黃芪多糖的提取效率。結果顯示在一定范圍內(nèi)，隨提取溫度的升高、料液比的提升和提取時間的延長，黃芪多糖的提取量逐步攀升，當提取時間為2.5 h，提取溫度為90 ℃，料液比為1∶8時，多糖提取量較高，此后提取量有所下降。權彥等[4]采用三因素三水平的試驗，發(fā)現(xiàn)在溫度100 ℃、水提取2 h、加入乙醇體積分數(shù)為90%時，黃芪多糖的提取率最高，黃芪多糖粗提物的含量為42.9 mg/g，提取率為4.29%，純度為31.2%。綜上所述，適當?shù)母邷靥幚?，增加提取時間和提取液比率，在一定程度上可以提升黃芪多糖的提取率。但針對不同的黃芪植株品種，其最優(yōu)的提取溫度存在差異，主要原因可能與黃芪植株的品種特性有關，不同地域、不同品種的黃芪植株在細胞結構與組成上存在差異，是導致最佳提取溫度差異的主要因素。水提醇沉法因其安全、成本低而成為植物組織中提取多糖最常用的方法[4]，但是該方法多糖提取率低，雜質(zhì)含量高，提取時間長，多糖結構可能被高溫破壞，從而影響藥效。此方法在工業(yè)化生產(chǎn)中會導致黃芪材料大量浪費，并且需要消耗大量燃料進行煎煮。

2 堿溶提取法

黃芪多糖主要存在于黃芪干燥根莖中，而黃芪細胞壁的成分主要為纖維素，因此，黃芪多糖的提取率與纖維素的溶解性有關。堿溶提取法利用這一特點，將溫水提醇沉法中的水換成弱堿溶液。由于黃芪細胞壁中的纖維素在堿性環(huán)境中產(chǎn)生溶脹作用，溶解性顯著增加，并且纖維之間的酯鍵更容易發(fā)生斷裂，使得細胞壁的破損程度加深，進而使更多的多糖從細胞中流出，提高了多糖的提取率[6]。

金芬芬等[7]用pH值為9～10的NaOH弱堿溶液對黃芪藥材進行浸提，最終黃芪多糖的平均提取率為7.64%。劉永錄等[8]分別用NaOH和CaO調(diào)制pH值為12的堿水提取黃芪多糖，最終黃芪多糖提取率分別為7.73%和7.12%。總的來說，堿溶提取法中黃芪多糖的提取率明顯高于溫水提醇沉法，具有一定的提取優(yōu)勢。該方法與溫水提醇沉法具有操作簡單、成本低廉等同樣的優(yōu)點，然而，提取過程中，該方法提取廢液中富含堿性物質(zhì)，不易過濾及濃縮，大規(guī)模使用易造成環(huán)境污染。

3 堿醇提取法

堿醇提取法是在弱堿存在的基礎上添加5%乙醇，回流提取之后濃縮，再用95%乙醇醇沉，是在堿溶提取法的基礎上加入少量乙醇以提高提取率。在堿性條件下，更多的多糖得以游離并被提取出來，而醇的加入能使多糖的滲透作用增強。在堿與醇的共同作用下，多糖滲透率增加，多糖殘留量降低，回收率提高[9]。

田洛等[10]將5%乙醇溶液用NaOH調(diào)節(jié)pH值到12，用于黃芪莖葉中多糖的提取，結果發(fā)現(xiàn)黃芪多糖含量為89.7 mg/g，提取率為8.97%。金芬芬等[7]將黃芪藥材置于50～60 mL pH值為12的5%醇液中，加熱回流2～3 h，醇沉之后得到黃芪多糖粗品，平均提取率為9.74%。由此可知，堿醇提取法中黃芪多糖的提取率大約為9%～10%，是溫水提醇沉法的2倍，與堿溶提取法相比，多糖提取率更高。堿、醇共同作用，更好地促進纖維素的降解，提升植物細胞壁的破碎程度，而且有機試劑乙醇的添加，有利于極性污染物的吸附、蛋白類物質(zhì)的沉淀，再次提升了黃芪多糖的提取率。該方法雖然提升了黃芪多糖的提取率和提純度。但從根本而言，該方法需要大量使用酸和堿，且對生產(chǎn)設備要求較高，仍然無法排除廢棄物中堿和有機試劑的污染。

4 酶輔助提取法

黃芪多糖位于黃芪植物細胞內(nèi)部，提取過程中需要破碎細胞壁，而黃芪細胞壁的主要成分為纖維素。因此在黃芪多糖的提取過程中，有研究嘗試利用生物酶(纖維素酶)降解細胞壁中的纖維素和半纖維素，使黃芪細胞的細胞膜暴露在外，細胞內(nèi)溶物更易流出，提升黃芪多糖的提取率。酶輔助法能有效破損黃芪細胞壁，提高黃芪多糖的滲出量，進而提高提取率。同時酶輔助提取法可以采用混合酶處理，如纖維素酶和蛋白酶的同時作用，能夠幫助分解黃芪細胞中動物不易消化的大分子多糖和蛋白質(zhì)，將其降解成易于腸道吸收的小分子物質(zhì)，能夠提高黃芪多糖的純度和藥效[11]。

徐艷等[12]通過控制水浴溫度、水浴時長、酶的加入量等條件來研究酶輔助條件下黃芪多糖的提取率，發(fā)現(xiàn)將藥材在80 ℃條件下水浴1.5 h后加入20 mL 2 g/L的纖維素酶時，黃芪多糖的提取率最高，為9.27%。陳學偉等[13]先利用纖維素酶預處理黃芪材料，再用水提醇沉法提取黃芪多糖，發(fā)現(xiàn)在75 ℃條件下加入0.8%的纖維素酶酶解120 min時效果最佳，最終黃芪多糖的提取率為9.78%。CHEN等[14]研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶對黃芪多糖具有更高的提取率，在3.0%的酶處理黃芪3.44 d，處理溫度為56.9 ℃，提取溶劑的pH值為7.8時，黃芪多糖提取率為29.96%±0.14%，提取效率顯著提高。酶的使用代替了酸堿溶液對于纖維素的溶解，更為環(huán)保。此外，酶的作用條件溫和，不會破壞多糖的結構，耗能小，最終多糖提取率較高。但是由于生物酶反應條件苛刻，需要嚴格的生化條件，而且酶的獲取成本高，使用過程中易失活，難以短期實現(xiàn)工業(yè)化的應用，但隨著生物技術的發(fā)展，開發(fā)新型耐高溫、易儲藏的生物酶已逐步成為可能，也是目前階段急需解決的核心問題，對該方法的工業(yè)化應用，具有重要意義。

5 超聲波提取法

超聲波是一種頻率很高的聲波，其頻率通常在20 000 Hz以上。超聲波可以利用能量使物體發(fā)生劇烈震動，從而使物體分解成極細小的顆粒。根據(jù)這一原理可以將超聲波作用于黃芪組織或細胞，超聲波能將黃芪細胞的細胞壁和細胞膜震碎，使細胞內(nèi)溶物流出，從而提高黃芪多糖的提取率。利用超聲波提取黃芪多糖時，首先將黃芪碾碎成粉末，再加入一定量的去離子水混合，經(jīng)過一定頻率的超聲波處理后除去蛋白質(zhì)，離心后醇沉即可獲得粗多糖。

吳銘等[15]利用超聲波提取黃芪多糖，發(fā)現(xiàn)當固液比為1∶20、超聲功率為65 W、溫度為60 ℃的條件下超聲提取12 min時提取率最高，為8.75%。張洪波等[16]利用超聲波儀對黃芪葉細粉進行多糖提取，結果發(fā)現(xiàn)黃芪多糖的平均提取率為7.9%。劉楊等[17]發(fā)現(xiàn)，超聲時間為70 min時多糖提取率最高，而隨著超聲時間的延長，多糖提取率逐漸下降，這可能是由于超聲時間太長導致多糖的分子結構被破壞，從而使提取率下降。還有研究者發(fā)現(xiàn)[18]超聲波提取黃芪多糖的最佳工藝條件為：在超聲功率為250 W的條件下提取90 min，提取溫度為80 ℃。總的來說，超聲波提取法的黃芪多糖提取率大約為8%～9%，與酶輔助法和堿醇提取法相比,效果相當，是溫水提醇沉法的2倍。超聲波處理，有利于植物組織的均勻分散，酶解處理，可以提升細胞壁的溶解率，如果將超聲波提取法與酶輔助提取法二者的優(yōu)勢相結合，能否會再度提升黃芪多糖的提取率，有待于進一步研究。

6 生物發(fā)酵提取法

近年來，利用生物發(fā)酵技術提取黃芪多糖的方法受到廣泛關注。生物發(fā)酵技術主要是利用微生物對黃芪細胞的細胞壁進行消化破碎，使細胞內(nèi)的黃芪多糖流出。微生物的個體小，繁殖能力強，對細胞壁的破碎效果顯著，能明顯提高植物中纖維素和木質(zhì)素的降解率[19]，并且將許多動物不能直接吸收的生物大分子轉化為小分子物質(zhì)，增強藥效。發(fā)酵后的藥渣還可以制成飼料，使黃芪成分得到充分利用。

尚利明等[20]將黃芪通過非解乳糖鏈球菌FGM進行發(fā)酵提取，發(fā)現(xiàn)在溫度為39 ℃、接菌量5%、pH值為5.4、培養(yǎng)時間為48 h條件下多糖產(chǎn)量最高。陳婕等[21]將非解乳糖鏈球菌FGM經(jīng)紫外線照射后篩選到一株突變菌株，發(fā)現(xiàn)使用突變菌株發(fā)酵提取黃芪多糖時發(fā)酵產(chǎn)物中多糖含量為235.51 mg/g，提取率為23.55%。蘇貴龍等[22]分別測定了FGM菌株發(fā)酵前后黃芪水溶液中黃芪多糖的含量，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后黃芪根、一年生莖、兩年生莖、一年生葉、兩年生葉的發(fā)酵液中粗多糖含量分別增加了177.46%、227.27%、207.11%、170.61%、182.28%，多糖溶出量得到了大大提高。李建喜等[23]對黃芪進行多批次發(fā)酵實驗，結果發(fā)現(xiàn)黃芪發(fā)酵液中多糖含量高達70.88%±10%。由此可見，生物發(fā)酵提取法具有高效的黃芪多糖提取率，與酶輔助提取相比，不需要嚴格的條件控制，與常規(guī)的溫水提醇沉法、堿醇提取法、堿溶提取法等相比，不會產(chǎn)生大量的工業(yè)廢棄物，且產(chǎn)生的藥渣可作為有機飼料使用，具有更好的發(fā)展前景。

7 展望

黃芪多糖是黃芪中一種重要的藥用活性成分，具有提高人體免疫力、抗氧化和抗病毒等功效[24]，其高效提取是目前工業(yè)生產(chǎn)中的重要研究內(nèi)容。傳統(tǒng)的溫水提醇沉法中黃芪多糖的提取率不高，并且多糖的純度也較低，用這種方法提取黃芪多糖容易造成原材料的浪費，并且需要較高的能量和高溫環(huán)境，資源消耗大。而堿溶提取法、堿醇提取法、酶輔助提取法和超聲波提取法等方法雖然提高了提取效率和多糖純度，但是都具有資源消耗大，成本高昂、易造成環(huán)境污染等缺點。此外較高的溫度處理、酸性或堿性極端條件等均可能對黃芪多糖的理化性質(zhì)和生物活性造成潛在影響。

與傳統(tǒng)的提取工藝相比，生物發(fā)酵提取法的多糖提取率遠遠超過堿醇提取法、超聲波提取法等常規(guī)方法，且具有操作簡單、投入成本低、不破壞黃芪多糖結構、發(fā)酵廢棄物利用率高等優(yōu)點。微生物的作用條件溫和，繁殖迅速，對儲存環(huán)境要求不高，在工業(yè)生產(chǎn)中具有較好的應用前景。然而，生物發(fā)酵法提取黃芪多糖尚屬于研究階段，黃芪多糖提取效率難以保持穩(wěn)定，不同研究者得出的多糖提取率存在明顯差異。其主要原因可能是采用的發(fā)酵微生物菌株不同，不同的微生物菌株，其增殖速率、產(chǎn)代謝酶活性、發(fā)酵培養(yǎng)條件等均存在顯著差異，最終導致較高的提取效率差異。因此如何穩(wěn)定微生物發(fā)酵提取黃芪多糖的效率，是生物發(fā)酵提取法面臨的首要問題。

微生物發(fā)酵提取法在黃芪多糖的提取中具有顯著優(yōu)勢，為進一步推動其產(chǎn)業(yè)化應用，筆者認為仍需從以下方面開展研究：(1)篩選具有高效降解黃芪細胞壁活性的微生物菌株，提高細胞破碎程度；(2)優(yōu)化微生物發(fā)酵黃芪培養(yǎng)條件，確定最適發(fā)酵條件；(3)針對不同活性微生物，建立不同的黃芪發(fā)酵和多糖提取流程標準，提高發(fā)酵穩(wěn)定性；(4)微生物發(fā)酵提取法與常規(guī)方法可以聯(lián)合應用，最大限度地提高提取工藝。上述研究內(nèi)容的完成，將進一步完善黃芪多糖的提取效率，提高穩(wěn)定性，對工業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。