指甲花香豆素類成分提取工藝優(yōu)化及其抑菌活性評(píng)價(jià)

許亞麗，何念武

（1.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000；2.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710127）

指甲花，學(xué)名鳳仙花（Impatiens balsamina），是一種天然植物染料，在民間常被用來染頭發(fā)或指甲，亦可作為園藝觀賞植物。與大部分藥用植物一樣，指甲花化學(xué)成分復(fù)雜，富含醌類、黃酮類和香豆素類等生物活性成分，還含有脂肪酸、揮發(fā)油等成分[1]。研究表明，指甲花具有抗真菌、抗氧化及消炎鎮(zhèn)痛等臨床作用[1-2]，在醫(yī)學(xué)上可用于祛風(fēng)除濕及治療風(fēng)濕、痛風(fēng)和甲癬等。指甲花還具有食療價(jià)值，可炒食或制成保健飲料等[3]。

香豆素類成分主要包括白蠟樹亭、東茛菪素和七葉亭等[4]，存在于自然界許多植物中，作為植物化學(xué)成分之一常帶有香味。龔蕾等[5]綜述了提取香豆素的常用方法，主要有水蒸氣蒸餾提取法、堿溶酸沉提取法、系統(tǒng)溶劑提取法和色譜提取法等，并簡(jiǎn)要分析各方法的優(yōu)缺點(diǎn)，其中系統(tǒng)溶劑提取法具有操作簡(jiǎn)單和成本低等優(yōu)勢(shì)。袁園等[6]通過微波輔助溶劑提取法提取白芷（Angelica dahurica）中的香豆素，結(jié)果顯示該方法具有高效、省時(shí)和便捷等優(yōu)點(diǎn)。微波輔助溶劑提取法主要通過洗料、清洗、粉碎、分離、濃縮和干燥等步驟獲得產(chǎn)品，既克服了系統(tǒng)溶劑提取法操作時(shí)間過長(zhǎng)的缺點(diǎn)，又集合了微波輔助的優(yōu)勢(shì)，目前已被廣泛應(yīng)用于植物化學(xué)成分的提取[7]。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者在關(guān)注植物化學(xué)成分提取分離的同時(shí)，積極開展化學(xué)成分抗氧化、抗菌和消炎等生物活性的研究。黎秋華等[8]采用不同溶劑對(duì)指甲花花瓣進(jìn)行粗提，并進(jìn)行粗提物體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示不同溶劑粗提物均對(duì)細(xì)菌有抑制作用，其中75%丙酮提取物的抑菌效果最強(qiáng)。董晨虹等[9]通過藥敏試紙（濾紙片）法比較指甲花不同部位的抑菌能力，結(jié)果表明指甲花花瓣對(duì)真菌生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。米爾班古麗·阿卜杜如蘇力等[10]對(duì)指甲花粗提液進(jìn)行體外抑菌活性篩選試驗(yàn)，結(jié)果表明指甲花粗提液對(duì)常見致病菌大腸埃希菌（Escherichia co?li）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等的抑菌活性隨濃度的增大而增加。上述研究均表明指甲花有良好的抑菌活性，但并未明確指甲花抑菌活性成分。Malekzadeh 等[11]研究表明，指甲花的抗菌活性可能與其所含的活性成分2-羥基-1,4-萘醌，即指甲花醌類成分有關(guān)。為進(jìn)一步了解指甲花的抑菌活性成分，本研究采用微波輔助溶劑提取法提取指甲花中的香豆素類成分，基于提取溫度、提取時(shí)間、料液比及乙醇濃度4個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行工藝優(yōu)化，并采用抑菌圈法考察指甲花香豆素類成分的體外抑菌活性，以期為指甲花資源的綜合利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

指甲花、香豆素（批號(hào)：20210310，上海邁坤化工有限公司）、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、牛肉膏、氯化鈉、瓊脂、蛋白胨、大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌（由商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.2 指甲花香豆素檢測(cè)波長(zhǎng)

采用紫外全波長(zhǎng)掃描儀檢測(cè)香豆素對(duì)照品和待測(cè)樣品的最大吸收波長(zhǎng)，確定后續(xù)香豆素類成分提取率的檢測(cè)波長(zhǎng)[12]。準(zhǔn)確吸取香豆素對(duì)照品溶液2.5 mL 和供試品溶液1.5 mL 于10.0 mL 容量瓶中，無水乙醇定容，倒置搖勻，在200 ～500 nm 波長(zhǎng)下分別掃描對(duì)照品和供試品溶液，找出最大吸收峰，確定檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.3 指甲花香豆素類成分提取率測(cè)定

1.3.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)照品溶液配制：準(zhǔn)確稱取香豆素對(duì)照品25.0 mg，采用無水乙醇溶解，定容于500.0 mL 容量瓶中，得到50.0 μg/mL香豆素對(duì)照品溶液。

供試品溶液制備：稱取2.0 g 指甲花粉末（粉碎機(jī)打粉，過80 目篩），置于150.0 mL 容量瓶中，加入60.0 mL 無水乙醇，微波輔助加熱冷凝回流90 min，提取溫度60 ℃，放冷后過濾；濾渣中加入30.0 mL無水乙醇，按照上述條件重復(fù)提取1 次，過濾；將兩次濾液合并后置于150.0 mL 容量瓶中，無水乙醇定容，倒置搖勻。精確吸取0.5 mL 溶液置于10.0 mL容量瓶中，無水乙醇定容，得到供試品溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別吸取0.2、0.3、0.5、0.7 和1.0 mL對(duì)照品溶液至10.0 mL容量瓶中，無水乙醇定容，稀釋成不同濃度的香豆素對(duì)照品溶液。以無水乙醇為空白對(duì)照，在一定波長(zhǎng)處檢測(cè)各組吸光值。

1.3.2 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：準(zhǔn)確吸取香豆素對(duì)照品溶液0.5 mL于10.0 mL 容量瓶中，無水乙醇定容，在測(cè)定波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定5 次吸光度，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），判斷儀器的精密度。

式中，S為標(biāo)準(zhǔn)偏差為吸光度均值。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取指甲花提取液在室溫下分別放置2、4、8、12、24 和30 h，在確定的波長(zhǎng)下測(cè)定不同時(shí)間下的吸光度，計(jì)算RSD，判斷指甲花提取液在30 h內(nèi)的穩(wěn)定性。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取2.0 g指甲花粉末，置于150.0 mL圓底燒瓶中，加入60.0 mL 95%乙醇，回流提取1.5 h，提取溫度60 ℃，冷卻后過濾；濾渣中加入30.0 mL 95%乙醇，按照上述條件重復(fù)提取1 次，過濾；將兩次濾液合并后置于150.0 mL 容量瓶中，吸取0.5 mL置于10.0 mL 容量瓶中，無水乙醇定容，得到指甲花粗提液。重復(fù)6 次。在確定的波長(zhǎng)下，測(cè)定待測(cè)液的吸光度，計(jì)算RSD，判斷該方法的重復(fù)性。

1.3.3 香豆素類成分提取率計(jì)算

設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，按照回歸方程計(jì)算指甲花乙醇提取液的濃度，再根據(jù)提取率公式計(jì)算指甲花香豆素類成分的提取率（%）。

式中，C為指甲花提取液的濃度（g/mL）；V為提取液的體積（mL）；M為指甲花粉末的質(zhì)量（g）[6]。

1.4 方法

1.4.1 乙醇浸提指甲花中香豆素類成分的單因素試驗(yàn)

以指甲花粉末為原料，采用冷凝回流法，以總香豆素量為指標(biāo)，考察提取時(shí)間、提取溫度、料液比和乙醇濃度對(duì)香豆素類成分提取率的影響。

（1）提取溫度對(duì)提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取3.0 g 指甲花粉末6 份，分別置于100.0 mL 圓底燒瓶中，加入60.0 mL 50%乙醇，加熱回流90 min，分別調(diào)節(jié)水浴鍋的溫度為40、50、60、70、80 和90 ℃，放冷后過濾；濾渣中加入30.0 mL 50%乙醇，按照上述條件重復(fù)提取1 次，過濾；將兩次濾液合并后置于150.0 mL 容量瓶中，無水乙醇定容，搖勻。準(zhǔn)確吸取0.5 mL 溶液，無水乙醇稀釋并定容至10.0 mL。測(cè)定吸光度，計(jì)算各組香豆素類成分提取率。

（2）提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取3.0 g 指甲花粉末6 份，分別置于150.0 mL 圓底燒瓶中，加60.0 mL 70%乙醇，調(diào)節(jié)水浴鍋溫度為60 ℃，分別加熱回流50、60、90、110、120和150 min，放冷后過濾；濾渣中加入30.0 mL 70%乙醇，按照上述條件重復(fù)提取1 次，過濾；將兩次濾液合并后置于150.0 mL 容量瓶中，無水乙醇定容，搖勻。準(zhǔn)確吸取0.5 mL 溶液，無水乙醇稀釋并定容至10.0 mL。測(cè)定吸光度，計(jì)算各組香豆素類成分提取率。

（3）料液比對(duì)提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取3.0 g 指甲花粉末6 份，分別置于100.0 mL 圓底燒瓶中，分別按照1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40 和1∶50 的料液比（指甲花粉末與提取溶劑之比，mg∶mL）加入50%乙醇，加熱回流提取90 min，調(diào)節(jié)水浴鍋溫度為60 ℃，放冷后過濾；濾液置于150.0 mL容量瓶中，無水乙醇定容，搖勻。準(zhǔn)確吸取0.5 mL溶液，無水乙醇稀釋并定容至10.0 mL。測(cè)定吸光度，計(jì)算各組香豆素類成分提取率。

（4）乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

準(zhǔn)確稱取3.0 g 指甲花粉末6 份，分別置于100.0 mL圓底燒瓶中，分別加入60.0 mL體積分?jǐn)?shù)分別為10%、30%、50%、70%和95%的乙醇，加熱回流提取90 min，調(diào)節(jié)水浴鍋溫度為60 ℃，放冷后過濾；濾渣中加入30.0 mL 對(duì)應(yīng)濃度乙醇，按照上述條件重復(fù)提取1次，過濾；將兩次濾液合并后置于150.0 mL容量瓶中，無水乙醇定容，搖勻。準(zhǔn)確吸取0.5 mL溶液，無水乙醇稀釋并定容至10.0 mL。測(cè)定吸光度，計(jì)算各組香豆素類成分提取率。

1.4.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化指甲花中香豆素類成分提取工藝條件

根據(jù)上述4 個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇適宜的提取溫度、提取時(shí)間、料液比及乙醇濃度，設(shè)置4 個(gè)單因素的正交試驗(yàn)（表1）。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Tab.1 Factor levels of orthogonal experimental design

1.5 抑菌圈法測(cè)定指甲花香豆素類成分抑菌活性

1.5.1 培養(yǎng)基制備

配置牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。稱取10.0 g 牛肉膏、10.0 g蛋白胨、5.0 g氯化鈉和20.0 g瓊脂，溶解于1 000.0 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH為7.0 ～7.2，設(shè)置高壓滅菌鍋的時(shí)間為20 min，滅菌后干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 菌懸液和濾紙片制備

將大腸埃希菌等細(xì)菌在斜面培養(yǎng)基中活化；將已活化的細(xì)菌于無菌條件下接種于50.0 mL 細(xì)菌培養(yǎng)液中，置于培養(yǎng)箱中，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。用打孔器將定性濾紙制成直徑為6 mm的圓片，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，保存?zhèn)溆肹9]。

1.5.3 指甲花香豆素提取物抑菌活性檢測(cè)

稱取適量指甲花香豆素提取物，配置成1.0 g/mL的供試品溶液。取適量供試品溶液，用鹽酸和氫氧化鈉分別調(diào)節(jié)指甲花香豆素提取液的pH 為4、5、6、7、8 和11，將直徑為6 mm 的濾紙片放入溶液中浸潤(rùn)20 min，晾干后貼在培養(yǎng)皿內(nèi)，加入滅菌的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻；待平板凝固后，取預(yù)先配置好的0.1 g/mL 大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌混懸液100.0 mL分別加入平板中央，均勻涂布；無菌水為對(duì)照。平板凝固后，在37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，測(cè)量抑菌圈的直徑，重復(fù)3 次。記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算各pH 條件下3 個(gè)培養(yǎng)皿抑菌圈直徑的均值。一般而言，抑菌圈直徑大于1 cm，說明有抑菌效果；小于或等于1 cm，說明沒有抑菌效果；抑菌圈直徑越大，抑菌效果越強(qiáng)[8-10]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)

對(duì)照品溶液在269 nm 處有最大吸收峰，此時(shí)吸光度為0.49；供試品溶液在270 和271 nm 處有最大吸收峰，此時(shí)吸光度為0.78；兩者最大吸收峰相近（圖1）。因此，本研究將檢測(cè)波長(zhǎng)確定為270 nm。

圖1 香豆素對(duì)照品及供試品溶液紫外掃描圖Fig.1 UV scans of coumarin reference substance and test substance solutions

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以香豆素濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y = 0.026 4 x +0.506 1，R2=0.994 3（圖2）。

圖2 香豆素對(duì)照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of coumarin reference substance solution

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 精密度試驗(yàn)

在270 nm 的檢測(cè)波長(zhǎng)處，連續(xù)5 次對(duì)香豆素對(duì)照品溶液的吸光度進(jìn)行測(cè)定（n=5），RSD 為1.03%，說明所使用的紫外分光光度計(jì)精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在270 nm 的檢測(cè)波長(zhǎng)處，分別在2、4、8、12、24和30 h 測(cè)定指甲花提取物的吸光度，RSD 為1.36%，說明指甲花提取液在30 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

在270 nm 的檢測(cè)波長(zhǎng)處，測(cè)定并記錄吸光值，RSD為1.25%，說明該提取方法有較好的重復(fù)性。

2.4 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 提取溫度對(duì)香豆素類成分提取率的影響

隨提取溫度增加，指甲花香豆素類成分提取率呈先升后降的趨勢(shì)；提取溫度為60 ℃時(shí)，提取率最高（0.12%）；溫度上升至90 ℃時(shí)，提取率較低，可能是高溫破壞了香豆素類成分活性成分的結(jié)構(gòu)（圖3）?；趩我蛩卦囼?yàn)結(jié)果，正交試驗(yàn)最佳提取溫度初步確定為60 ℃。

圖3 提取溫度對(duì)香豆素類成分提取率的影響Fig.3 Effects of extraction temperatures on extraction rate of coumarins

2.4.2 提取時(shí)間對(duì)香豆素類成分提取率的影響

隨提取時(shí)間延長(zhǎng)，指甲花香豆素類成分提取率呈先升后降的趨勢(shì)；提取時(shí)間為90 min時(shí)，提取率最高（0.13%）（圖4）?；趩我蛩卦囼?yàn)結(jié)果，正交試驗(yàn)最佳提取時(shí)間初步確定為90 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)香豆素類成分提取率的影響Fig.4 Effects of extraction time on extraction rate of coumarins

2.4.3 料液比對(duì)香豆素類成分提取率的影響

隨料液比增加，指甲花香豆素類成分提取率呈先升后降的趨勢(shì)；料液比為1∶30 時(shí)，提取率最高（0.13%）（圖5）?；趩我蛩卦囼?yàn)結(jié)果，正交試驗(yàn)最佳料液比初步確定為1∶30。

圖5 料液比對(duì)香豆素類成分提取率的影響Fig.5 Effects of solid-liquid ratios on extraction rate of coumarins

2.4.4 乙醇濃度對(duì)香豆素類成分提取率的影響

隨乙醇濃度增加，指甲花香豆素類成分提取率呈先升后降的趨勢(shì)；乙醇濃度為50%時(shí)，提取率最高（0.10%）（圖6）。基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，正交試驗(yàn)最佳乙醇濃度初步確定為50%。

圖6 乙醇濃度對(duì)香豆素類成分提取率的影響Fig.6 Effects of ethanol concentrations on extraction rate of coumarins

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果及分析

2.5.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

從單因素試驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同的提取溫度、提取時(shí)間、料液比及乙醇濃度對(duì)指甲花香豆素類成分提取率的影響程度不同，基于單因素試驗(yàn)結(jié)果選取各因素較優(yōu)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化（表1）。香豆素類成分提取率為0.04% ～ 0.16%；處理7（A3B1C3D2）的提取率最高（0.16%）（表2）。通過極差分析，各因素對(duì)香豆素類成分提取率的影響為料液比＞乙醇濃度＞提取溫度＞提取時(shí)間，最佳組合為A3B2C3D2，即提取溫度60 ℃、提取時(shí)間90 min、料液比1∶40和乙醇濃度70%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析Tab.2 Results and range analysis of orthogonal experiment

2.5.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

將實(shí)際最優(yōu)組合和理論最優(yōu)組合進(jìn)行同步3 次驗(yàn)證試驗(yàn)（表3）。在理論最優(yōu)組合下，香豆素類成分平均提取率為0.185%，高于實(shí)際最優(yōu)組合。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of validate experiment (%)

2.6 不同pH條件下香豆素類成分提取液抑菌活性

酸性條件下，指甲花香豆素類成分提取液抑菌效果較強(qiáng)，堿性條件下次之，中性條件下較弱（表4）。隨pH 增加，香豆素類成分提取液的抑菌效果呈降低趨勢(shì)；pH 為11 的近強(qiáng)堿性條件下，抑菌效果又有所增強(qiáng)。原因可能是在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的極端條件下，大腸埃希菌等細(xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制，抑菌圈較大[13]。與對(duì)照相比，指甲花香豆素類成分提取液對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)均有顯著抑制作用（P＜0.05）；大腸埃希菌的抑菌圈平均直徑為11.74 mm，金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均直徑為13.77 mm。

表4 不同pH條件下指甲花香豆素類成分提取液抑菌效果Tab.4 Antibacterial effects of coumarins extracts from I.balsamina in different pH conditions

3 討論與結(jié)論

本研究選用微波輔助溶劑提取法提取指甲花中的香豆素類成分，既克服了系統(tǒng)溶劑提取法操作時(shí)間過長(zhǎng)的缺點(diǎn)，又結(jié)合了微波輔助的優(yōu)勢(shì)[7]。抑菌活性研究采用抑菌圈法，通過測(cè)量抑菌圈的直徑大小來判斷抑菌效果。還可通過平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算抑菌率，但平板菌落計(jì)數(shù)法待測(cè)樣品菌液往往不宜完全分散成單個(gè)細(xì)胞，形成的菌落有可能來自樣品中的2 ～3 個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞，試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確度偏低。

本研究以提取指甲花香豆素類成分和研究其抑菌活性為出發(fā)點(diǎn)，對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到的最佳提取工藝條件為提取溫度60 ℃、提取時(shí)間90 min、料液比1∶40 和乙醇濃度70%。最佳提取工藝提高了有效成分的含量，提取率為0.185%。抑菌活性試驗(yàn)結(jié)果表明，指甲花香豆素類成分提取液有一定程度的抑菌效果，大腸埃希菌的抑菌圈平均直徑為11.74 mm，金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均直徑為13.77 mm。

我國(guó)中藥資源豐富，大部分中藥材中均含有潛在的抑菌成分[14-16]，篩選植物天然抑菌活性成分并探究其抑菌機(jī)理已成為植物化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。指甲花在我國(guó)南北方地區(qū)均有分布，多以園藝觀賞為主，易于成活且生存能力強(qiáng)，種植成本較低，醌類、香豆素類和黃酮類活性成分含量較高，具有較強(qiáng)生物活性[17-18]，在抑菌方面有廣闊前景，在供園藝觀賞的同時(shí)有望成為制備抗菌洗液等日用品的化工原料。本研究未對(duì)深層次的指甲花香豆素類成分抑菌機(jī)理進(jìn)行探討，可在后續(xù)工作中進(jìn)一步研究。