烏雞肽對糖尿病小鼠糖化血清蛋白含量及免疫器官指數(shù)的影響

葛 瑩，王歡歡，張 雷，李慶海，黃 沁，章學(xué)東

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310024)

糖尿病是因胰島素分泌不足(1型糖尿病)或胰島素抵抗(2型糖尿病)引起的一種復(fù)雜的慢性代謝性疾病[1,2]。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟報告，2019年全球約有4.63億人患糖尿病，預(yù)計到2035年達(dá)到5.92億，已然成為威脅人類健康的一大疾病。常見的抗糖藥物有胰島素類、雙胍類、α-葡萄糖苷酶抑制劑類等。其中，阿卡波糖屬于α-葡萄糖苷酶抑制劑類降糖藥且目前在臨床上得到廣泛應(yīng)用[3-5]。但研究發(fā)現(xiàn)長期使用會發(fā)生不良反應(yīng)或療效不佳的情況[6]。許多專家認(rèn)為除了運動和藥物控制，飲食治療是糖尿病治療的基礎(chǔ)措施[7]。因此，從食品中挖掘更安全、有效的抗糖功能成分具有重要的意義。

烏骨雞是我國特有的藥食兩用雞種，長期以來深受消費者喜愛。據(jù)《本草綱目》記載烏骨雞能夠治療消渴癥，即糖尿病[8]。同時，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實烏骨雞體內(nèi)富含多種功能活性成分，包括黑色素、氨基酸、脂肪酸和生物活性肽等。其中，烏骨雞活性肽(以下簡稱烏雞肽)是烏骨雞肌肉蛋白水解得到的一些特定小分子量氨基酸片段，已被證實具有抗氧化、補氣血、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的生理作用[9-11]。目前，烏雞肽與糖尿病的關(guān)聯(lián)研究較少。本課題組前期研究初步證實烏雞肽能夠改善鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的體重、空腹血糖、血脂等水平。在此基礎(chǔ)上，本試驗分析烏雞肽對糖尿病小鼠的糖化血清蛋白(glycosylated serum protein，GSP)含量及脾、胸腺指數(shù)的影響，以期進(jìn)一步解析烏雞肽的抗糖作用，為充分開發(fā)烏骨雞功能成分提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗素材 雄性ICR小鼠(5周齡，清潔級)來自浙江省醫(yī)科院實驗動物中心，實驗期間確保飼養(yǎng)環(huán)境安靜清潔，室內(nèi)溫度(20±2)℃、濕度50%～60%、12 h明暗循環(huán)以及提供充足的飼料和飲水，造模前需適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。烏雞肽由杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供，是由烏骨雞蛋白經(jīng)酶解分離制得的分子量小于5000 kDa的多肽。

1.2試劑及儀器 STZ(S0130，Sigma)，阿卡波糖(德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司)，檸檬酸、檸檬酸三鈉、氯化鈉等分析純(生工生物工程(上海)股份有限公司)，GSP測試盒(南京建成生物工程)；電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；臺式低溫高速離心機(Eppendorf，德國)；血糖儀和血糖試紙(Roche，美國)；Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀(Tecan，瑞士)；超純水機(Millipore，美國)。

1.3造模 將STZ溶于0.1 mol·L-1檸檬酸鈉緩沖液以配制10 mg·mL-1注射液。ICR小鼠隔夜禁食后，按照120 mg·kg-1的STZ劑量進(jìn)行腹腔注射來誘導(dǎo)糖尿病。注射1周后斷尾采血，測得空腹血糖值≥11.1 mmol·L-1則為糖尿病小鼠。

1.4試驗分組 將造模成功的小鼠隨機分為3組，每組10只。分別每天灌喂400 mg·kg-1烏雞肽(BP組)、30 mg·kg-1阿卡波糖(AC組)和生理鹽水(PC組)。另隨機選擇10只健康小鼠作為正常對照組(NC)并灌喂生理鹽水。

1.5試驗方法 連續(xù)灌喂30 d后稱重，然后采用脫頸法處死小鼠，眼眶靜脈竇采血，4℃靜置24 h，3000 r·min-1、15 min分離出血清，根據(jù)GSP測試盒說明書，利用酶標(biāo)儀檢測GSP含量，采集脾、胸腺組織，生理鹽水沖洗后擦干、稱重，最后計算脾、胸腺指數(shù)，公式如下：

脾指數(shù)(mg·g-1)=脾重量(mg)/體重(g)

胸腺指數(shù)(mg·g-1)=胸腺重量(mg)/體重(g)

1.6數(shù)據(jù)分析 采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示數(shù)值，使用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間差異顯著性采用Tukey檢驗，以P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1烏雞肽對血清GSP含量的影響 GSP能有效地反映過去2～3周內(nèi)平均血糖水平，不受臨時血糖濃度波動干擾，是觀察血糖控制情況的重要指標(biāo)之一。由表1可知，相比于NC組，其余3組的GSP含量顯著較高(P<0.05)，即灌胃一段時間后的糖尿病小鼠仍持續(xù)高血糖。但相比于PC組，BP組和AC組的GSP含量顯著較低(P<0.05)且這兩組間無顯著差異，說明灌喂烏雞肽和阿卡波糖后的糖尿病小鼠血糖均顯著下降，并且兩者效果相似。總之，烏雞肽和阿卡波糖能在一定程度上調(diào)節(jié)降低糖尿病小鼠血糖。

表1 烏雞肽對糖尿病小鼠血清GSP含量的影響 單位：mmol·L-1

2.2烏雞肽對免疫器官的影響 脾和胸腺是機體重要的免疫器官，并且脾指數(shù)和胸腺指數(shù)可作為評估免疫功能的基礎(chǔ)指標(biāo)。由圖1可知，與NC組相比，BP組和AC組的脾指數(shù)無顯著差異，而PC組顯著較低(P<0.05)；PC組的脾指數(shù)低于BP、AC組，且與后者具有顯著差異(P<0.05)。胸腺指數(shù)由高到低為NC、BP、AC、PC組，但組間無顯著差異。以上表明，灌喂烏雞肽有利于提高糖尿病小鼠脾指數(shù)，具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

3 討論

目前，實驗室常將STZ作為糖尿病模型誘導(dǎo)試劑。它是一種氨基葡萄糖-亞硝基脲化合物，進(jìn)入體內(nèi)被葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運至胰腺組織，特異性破壞β細(xì)胞使胰島素分泌下降，造成機體無法吸收葡萄糖、血糖升高[12]。研究者們通過一次腹腔注射大劑量STZ誘導(dǎo)1型糖尿病小鼠，具有高血糖和“三多一少”的癥狀[13,14]。同樣，本試驗經(jīng)腹腔一次注射120 mg·kg-1劑量的STZ，1周后檢測發(fā)現(xiàn)小鼠空腹血糖高于11.1 mmol·L-1，說明糖尿病小鼠構(gòu)建成功。

GSP是由血液中的葡萄糖與白蛋白和其他蛋白分子N末端發(fā)生非酶促糖基化反應(yīng)的產(chǎn)物，其中糖化白蛋白濃度約占90%[15]。它不受血液系統(tǒng)疾病的影響且半衰期較短(17～19天)，從而反映測定前2～3周的短期血糖狀態(tài)[16-17]。相比于空腹血糖測定的繁瑣(需要禁食)和不穩(wěn)定性，GSP能更快速、準(zhǔn)確地反映血糖控制情況或者監(jiān)測糖尿病治療變化。Chen等[13]發(fā)現(xiàn)STZ型糖尿病小鼠GSP水平顯著高于健康小鼠(P<0.05)。本試驗也證實了健康小鼠GSP含量[(2.02±0.33)mmol·L-1)]顯著低于陽性對照小鼠[(3.93±0.52)mmol·L-1](P<0.05)。灌喂烏雞肽、阿卡波糖30 d后的小鼠組血糖均顯著低于陽性對照組(P<0.05)，說明烏雞肽同阿卡波糖一樣在一定程度上降低糖尿病小鼠血糖。但也觀察到烏雞肽、阿卡波糖組顯著高于正常對照組(P<0.05)，即血糖未恢復(fù)到健康小鼠水平，這可能與給藥濃度及烏雞肽關(guān)鍵功能肽段未完全分離提純有關(guān)。

長期高血糖使機體對胰島多種抗原成分失去耐受，主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ類分子與其處理的β細(xì)胞抗原共同激活細(xì)胞毒性因子，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致免疫力下降引發(fā)嚴(yán)重的心血管、肝腎損傷等并發(fā)癥[18]。脾和胸腺作為動物重要的免疫器官，其中脾臟是體內(nèi)最大的免疫器官，具有T、B淋巴細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞，胸腺能誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞分化、成熟，輔助T細(xì)胞產(chǎn)生抗體。當(dāng)機體發(fā)生超敏反應(yīng)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖、免疫器官質(zhì)量增加。因此，脾指數(shù)和胸腺指數(shù)是衡量免疫功能的重要指標(biāo)[19,20]。黃桂紅等[21]發(fā)現(xiàn)STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠脾、胸腺指數(shù)顯著低于健康小鼠(P<0.05)。本研究也發(fā)現(xiàn)陽性對照組小鼠的脾、胸腺指數(shù)低于其他組。已有研究表明烏雞肽可以通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞活力來增強免疫調(diào)節(jié)[22]。朱小語等[23]認(rèn)為烏雞肽可改善環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠的免疫功能。本試驗也觀察到灌胃烏雞肽及阿卡波糖的糖尿病小鼠脾指數(shù)與健康小鼠無顯著差異，說明它對糖尿病小鼠的免疫器官具有調(diào)節(jié)作用，從而減少并發(fā)癥的產(chǎn)生。

總之，本研究證實了烏雞肽對STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠具有一定降低血糖、增強免疫功能的作用，后期課題組將進(jìn)一步研究烏雞肽降糖的關(guān)鍵功能肽段及其作用機制。