高效液相色譜一測多評法同時測定木丹顆粒中9種成分*

田甜，陳鏡樓，黃徐英，林智娟，宋慧晶

(1.武漢市第四醫(yī)院/華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬普愛醫(yī)院藥學部，武漢 430034；2.江漢大學醫(yī)學院，武漢 430056)

木丹顆粒由黃芪、醋制延胡索、蘇木、三七、赤芍、丹參、紅花、川芎、雞血藤等9味中藥配伍而成，主要用于四肢末梢及軀干部麻木、疼痛及感覺異常，或見肌膚甲錯、面色晦暗、倦怠乏力、神疲懶言、自汗等糖尿病性周圍神經(jīng)病變屬氣虛絡阻證的治療[1]。現(xiàn)代臨床研究表明，木丹顆粒治療糖尿病周圍神經(jīng)病變臨床效果顯著[2-4]，可有效改善患者生活質(zhì)量和血流動力學，降低血脂，提高神經(jīng)傳導速度，安全性較高[5]，對早期糖尿病腎病、血脂異常、糖尿病伴頸動脈硬化、糖尿病足、糖尿病自主神經(jīng)病變等多種并發(fā)癥均有明顯療效[6]，該藥聯(lián)合α-硫辛酸可明顯降低血清同型半胱氨酸水平[7]，聯(lián)合貝前列素鈉、依帕司他可明顯改善正中神經(jīng)和腓總神經(jīng)運動神經(jīng)傳導速度和感覺神經(jīng)傳導速度[8]，聯(lián)合紅景天乳膏可降低總癥狀評分及足部感覺震動閾值，提高神經(jīng)傳導速度，明顯改善患者臨床癥狀[9]。木丹顆?，F(xiàn)行質(zhì)量標準為國家藥品標準YBZ00422008，該標準僅對芍藥苷和人參皂苷Rg1進行定量控制，未對方中君藥及其他藥味所含成分進行定量研究，筆者也僅檢索到對木丹顆粒所含單一成分延胡索乙素進行定量研究的文獻報道[10]。中藥及其制劑所含成分復雜，高效液相色譜一測多評法(high performance liquid chromatography-quantitative analysis of multi-components by single-marker，HPLC-QAMS)的多成分同時測定多指標質(zhì)量評價模式，有效降低了檢驗成本，解決了部分對照品不穩(wěn)定等不足，近年來已逐步應用于中成藥復方制劑質(zhì)量控制。筆者在本實驗采用HPLC-QAMS法，以延胡索乙素為內(nèi)參物，對木丹顆粒中巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素進行同時測定，以期為全面科學評價木丹顆粒質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Agilent 1290型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；BSA224S型電子天平(德國Sartorius公司，感量：0.1 mg)；HU31208型超聲波清洗器(上海珂淮儀器有限公司)；Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，WondaSil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

1.2試藥 延胡索乙素對照品(批號：110726-201819，CAS號：2934-97-6，含量：99.8%)、(±)原蘇木素B對照品(批號：111882-201302，CAS號：102036-29-3，含量：98.9%)和毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(批號：111920-201606，CAS號：20633-67-4，含量：97.6%)購自中國食品藥品檢定研究院；巴西蘇木素對照品(批號：PRF8032701，CAS號：474-07-7，含量：99.1%)、四氫非洲防己堿對照品(批號：PRF8050321，CAS號：483-34-1，含量：98.4%)、四氫黃連堿對照品(批號：PRF8070621，CAS號：4312-32-7，含量：99.8%)、毛蕊異黃酮對照品(批號：PRF8062601，CAS號：20575-57-9，含量：99.6%)和芒柄花素對照品(批號：PRF8091225，CAS號：485-72-3，含量：99.9%)購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；去氫紫堇堿對照品(批號：CFS201901，CAS號：83218-34-2，含量：98.0%)購自武漢天植生物技術有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；木丹顆粒(規(guī)格：每袋7 g，批號：10181124，10190102，10190415)來源于遼寧奧達制藥有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1混合對照品儲備液 分別精密稱取巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素對照品各適量，置同一量瓶，用甲醇制成濃度分別為0.982，0.714，0.206，0.478，0.324，0.358，0.212，0.116和0.372 mg·mL-1的混合對照品儲備液。

2.1.2混合對照品溶液 精密吸取“2.1.1”項混合對照品儲備液2.5 mL，用甲醇制成巴西蘇木素49.1 μg·mL-1、(±)原蘇木素B35.7 μg·mL-1、四氫非洲防己堿10.3 μg·mL-1、四氫黃連堿23.9 μg·mL-1、延胡索乙素16.2 μg·mL-1、去氫紫堇堿17.9 μg·mL-1、毛蕊異黃酮葡萄糖苷10.6 μg·mL-1、毛蕊異黃酮5.8 μg·mL-1和芒柄花素18.6 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.3供試品溶液 取木丹顆粒，研成細粉，精密稱取約1.0 g，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲波清洗器超聲處理30 min，放冷后稱定質(zhì)量，用甲醇補重，濾過 ，制成木丹顆粒供試品溶液。

2.1.4陰性樣品溶液 按國家藥品標準YBZ00422008中木丹顆粒的工藝處方分別制備缺蘇木、缺醋制延胡索、缺黃芪的陰性樣品，再按上述方法分別制成陰性樣品溶液。

2.2色譜條件 Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫30 ℃；乙腈(A)-0.2%甲酸溶液(B)為流動相，梯度洗脫(0～11.0 min，10.0%A；>11.0～20.0 min，10.0%A→15.0%A；>20.0～41.0 min，15.0%A→42.0%A；>41.0～57.0 min，42.0%A→55.0%A；>57.0～65.0 min，55.0%A→10.0%A)，流速1.0 mL·min-1；檢測波長分別為280 nm[0～41.0 min檢測巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素和去氫紫堇堿][11-14]和254 nm(41.0～65.0 min檢測毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素)[15]；進樣量10 μL。精密吸取“2.1.2～2.1.4”項下各溶液依法進樣檢測，巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素色譜峰峰形對稱，分離度均>1.5，理論板數(shù)按各成分色譜峰計均≥4500，陰性樣品對木丹顆粒中巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素定量測定無干擾，色譜圖見圖1。

A.混合對照品；B.木丹顆粒；C.蘇木陰性樣品；D.延胡索陰性樣品；E.黃芪陰性樣品；1.巴西蘇木素；2.(±)原蘇木素B；3.四氫非洲防己堿；4.四氫黃連堿；5.延胡索乙素；6.去氫紫堇堿；7.毛蕊異黃酮葡萄糖苷；8.毛蕊異黃酮；9.芒柄花素。

2.3線性關系考察 精密吸取“2.1.1”項混合對照品儲備液0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 mL，用甲醇配制成6個濃度梯度混合對照品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積，以峰面積(A)為縱坐標，質(zhì)量濃度(C)為橫坐標進行回歸，結(jié)果見表1。結(jié)果表明巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素在各自范圍內(nèi)線性關系良好。

2.4精密度考察 精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液重復進樣6次，測得巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素色譜峰峰面積RSD分別為0.58%，0.63%，1.17%，0.79%，1.01%，0.95%，1.13%，1.24%和0.86%。

2.5重復性考察 取同一批次木丹顆粒樣品，按“2.1.3”項方法制備6份供試品溶液，依法進樣測定巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素色譜峰峰面積，計算得9種成分含量RSD分別為0.91%，1.02%，1.73%，1.16%，1.39%，1.24%，1.65%，1.88%和1.30%。

2.6穩(wěn)定性考察 精密吸取木丹顆粒同一份供試品溶液，于0，2，4，6，10，18 h進樣檢測巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素色譜峰峰面積，結(jié)果木丹顆粒供試品溶液18 h內(nèi)穩(wěn)定，9種成分的峰面積RSD分別為0.59%，0.65%，1.14%，0.81%，1.05%，1.37%，1.16%，1.26%和0.91%。

表1 9種成分線性關系與范圍

2.7加樣回收率實驗 取9種成分含量已知的同一批次木丹顆粒樣品，研成細粉，取9份，精密稱取約0.5 g，隨機分成3組，按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部要求加入混合對照品溶液[巴西蘇木素0.654 mg·mL-1、(±)原蘇木素B0.486 mg·mL-1、四氫非洲防己堿0.122 mg·mL-1、四氫黃連堿0.328 mg·mL-1、延胡索乙素0.186 mg·mL-1、去氫紫堇堿0.202 mg·mL-1、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.146 mg·mL-1、毛蕊異黃酮0.068 mg·mL-1、芒柄花素0.262 mg·mL-1]0.5，1.0和1.5 mL各一組，使各組9種成分對照品加入量約為樣品含有量的50%，100%和150%，再按照“2.1.3”項方法制成加樣供試品溶液，依法進樣測定巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的峰面積，計算9種成分平均加樣回收率及RSD值，結(jié)果見表2。

表2 9種成分加樣回收率實驗結(jié)果

2.8相對校正因子測定 采用多點校正法，精密吸取“2.3”項下6種混合對照品溶液依法進樣測定巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素的峰面積，以延胡索乙素為內(nèi)參物，按照計算公式：fk/m=fk/fm=(Ck×Am)/(Cs×Am)(式中C代表質(zhì)量濃度，A代表峰面積，k代表內(nèi)參物，m代表其他成分)計算巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素相對校正因子，結(jié)果見表3。

表3 各成分相對校正因子

2.9耐用性考察

2.9.1不同儀器、色譜柱 精密吸取“2.1.2”項混合對照品溶液，依法進樣測定巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積，考察不同儀器(Waters 2695型、Agilent 1290型)、色譜柱(Agilent Zorbax SB-C18、Diamonsil C18、WondaSil C18)對相對校正因子影響，結(jié)果見表4。

表4 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響

2.9.2不同柱溫 精密吸取“2.1.2”項混合對照品溶液，依法進樣測定巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積，考察不同柱溫(28，29，30，31，32 ℃)對相對校正因子的影響，結(jié)果見表5。

表5 不同柱溫對相對校正因子的影響

2.10色譜峰的定位 精密吸取“2.1.2”項混合對照品溶液，依法進樣測定，記錄巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素色譜峰保留時間，以內(nèi)參物延胡索乙素色譜峰為基準峰，采用相對保留時間值法(各待測成分與內(nèi)參物保留時間的比值)對待測成分色譜峰進行定位，結(jié)果見表6。

表6 不同儀器、色譜柱各成分的相對保留時間值

2.11樣品含有量測定 取3批木丹顆粒樣品，按“2.1.3”項方法制成木丹顆粒供試品溶液(每批次平行制備3份)，依法檢測巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積，首先采用外標法計算9種成分含量，再以延胡索乙素為內(nèi)參物，根據(jù)“2.8”項建立的相對校正因子和計算公式計算巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素含量，結(jié)果見表7。結(jié)果表明HPLC-QAMS法計算值與外標法實測值差異無統(tǒng)計學意義，根據(jù)外標法檢測平均含量的80%，暫定本品每袋含黃芪以毛蕊異黃酮葡萄糖苷計不得低于1.60 mg，以毛蕊異黃酮計不得低于0.70 mg，以芒柄花素計不得低于2.90 mg；含醋制延胡索以四氫非洲防己堿計不得低于1.30 mg，以四氫黃連堿計不得低于3.60 mg，以延胡索乙素計不得低于2.00 mg，以去氫紫堇堿計不得低于2.20 mg，含蘇木以巴西蘇木素計不得低于7.30 mg，以(±)原蘇木素B計不得低于5.30 mg。

3 討論

3.1檢測指標成分的選擇 木丹顆粒組方中，黃芪補脾胃之元氣，氣旺血行，祛瘀而不傷正，為方中君藥，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素等黃酮類為其主要活性成分，對糖尿病周圍神經(jīng)病變臨床療效顯著[16-17]。醋制延胡索活血散瘀、行氣止痛，四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素和去氫紫堇堿等異喹啉類生物堿類為其主要藥效成分，能夠有效減弱急性炎癥和神經(jīng)性疼痛[18]；三七補血活血、散瘀止痛，合為臣藥。蘇木活血祛瘀、消腫止痛，巴西蘇木素和(±)原蘇木素B為其特征成分，通過影響糖尿病大鼠、人臍靜脈內(nèi)皮細胞自噬功能，治療糖尿病性大血管病變[19]；丹參活血涼血、消癰鎮(zhèn)痛，赤芍涼血鎮(zhèn)痛，紅花活血通經(jīng)，川芎活血行氣，共為佐藥。雞血藤補血活血、舒筋活絡，為使藥。諸藥共奏，以達益氣活血、祛瘀生新、通絡鎮(zhèn)痛功效[2]。本實驗參考中藥質(zhì)量標志物[20-21]以君藥為首選，同時兼顧臣佐使藥的原則，選取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、巴西蘇木素和(±)原蘇木素B為檢測指標成分，可為全面評價木丹顆粒整體質(zhì)量提供依據(jù)。

3.2流動相的選擇 本實驗在選擇流動相時，首先對比了乙腈-水[15，22]、甲醇-水[23-24]洗脫效果，結(jié)果甲醇-水系統(tǒng)基線不平穩(wěn)，干擾檢測；乙腈-水系統(tǒng)基線平穩(wěn)且分離效果較好，但毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮色譜峰因拖尾不能完全分離，故考慮在水相中加入弱酸(0.2%甲酸溶液[14，23-24]、0.2%醋酸溶液[11-12，25]、0.2%磷酸溶液[13])以改善峰形和分離效果，同時對優(yōu)選后的流動相比例進行不斷優(yōu)化，最終確定以乙腈-0.2%甲酸溶液為流動相，按“2.2”項流動相比例對木丹顆粒中巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素進行同時檢測。

筆者在本實驗采用HPLC-QAMS法，對木丹顆粒中巴西蘇木素、(±)原蘇木素B、四氫非洲防己堿、四氫黃連堿、延胡索乙素、去氫紫堇堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素9種成分含量進行同時測定，建立了木丹顆粒多指標成分質(zhì)量控制方法，有助于藥品生產(chǎn)企業(yè)不斷完善制劑生產(chǎn)所有原藥材種屬、產(chǎn)地等源頭控制，不斷提升制劑質(zhì)量控制標準以達到產(chǎn)品質(zhì)量和臨床療效一致性，同時，HPLC-QAMS法利用中藥有效成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關系，有效降低了檢驗分析成本，便于多組分質(zhì)量控制模式的普及應用。筆者在本實驗建立的方法操作便捷、結(jié)果準確，分析檢測時間較短，降低了檢驗成本，對提升木丹顆粒質(zhì)量標準具有一定指導意義。