植物甙牙膏的開發(fā)及功效研究

高 艷 肖 蕾 車 飆 黃金蓮 雷發(fā)玲 易 丹 何陵玲

(無限極(中國)有限公司，廣東 廣州 510663)

1 前言

口腔為消化道的起始部分，具有重要的生理機能，參與消化、協(xié)助發(fā)音、言語動作、感覺等功能，并輔助呼吸?？谇话鄠€器官，牙齒只是其中一部分?？谇坏那氨诩皞?cè)壁為唇和頰；上壁由硬腭和軟腭構(gòu)成口腔頂；下壁為口腔底，為舌和圍繞舌根的寬溝所占據(jù)。人體是一個統(tǒng)一的整體，各部分之間在生理上互相聯(lián)系，在病理上相互影響?？谇晃痪宇^面部，為五官之一，是人體重要組成部分，具有進水谷、辨五味、泌津液、磨谷物、助消化及發(fā)語音等功能，為胃系之所屬，乃心脾之外竅，經(jīng)絡(luò)循行交會之處。口齒為臟腑之門戶?？谇簧砉δ芗安±碜兓c五臟六腑有著密切的關(guān)系，臟腑生理及病理變化常反應(yīng)于所主的口腔不同部位[1]。

世界衛(wèi)生組織給口腔健康的標準下定義是：牙齒清潔，無齲洞，無疼痛感，牙齦顏色正常，無出血現(xiàn)象。中國居民口腔健康指南定義口腔健康是：無口腔頜面部慢性疼痛、無口咽癌、無口腔潰瘍、無先天性缺陷如唇腭裂、無牙周(牙齦)疾病、無齲病及牙齒喪失、無影響口腔的其他疾病和功能紊亂[2]。無論是世界衛(wèi)生組織還是中國居民口腔健康指南對口腔健康標準并不局限于牙齒上，而是包含了牙齦、牙齒、口腔粘膜、咽、頜面部、唇等口腔內(nèi)所有部位。

專利ZL201710571711.8《一種口腔健康評估算法、裝置及系統(tǒng)》綜合現(xiàn)代醫(yī)學對口腔問題的評價與解釋和中醫(yī)對口腔疾病、周身健康狀態(tài)的闡述，將人們常見口腔問題的發(fā)生機制、表現(xiàn)癥狀進行梳理和歸類，將居民常見口腔問題分為牙齒、牙齦、口腔環(huán)境及口腔潰瘍4大維度，共10個關(guān)注點，包括齲齒、牙齒敏感、牙齦出血、牙齦腫痛、牙齦萎縮、牙齒松動、牙結(jié)石、牙漬、口腔異味和口腔潰瘍，并以此建立了一套評價口腔健康指數(shù)(Oral-health Factor” ，OHF)的專利算法。其中牙齒維度包含齲齒和牙齒敏感；牙齦維度包含牙齦出血、牙齦腫痛、牙齦萎縮、牙齒松動和牙結(jié)石；口腔環(huán)境維度包含牙漬和口腔異味；口腔潰瘍?yōu)閱为氁粋€維度[3]。

口腔健康不能只局限在牙齒上，需要從牙齦、牙齒、口腔環(huán)境、口腔潰瘍等多角度、多維度整體、綜合解決問題。

2 植物甙

植物甙是植物體內(nèi)產(chǎn)生的、由一分子天然非糖化合物(甙元/苷元)與一個或多個糖或糖的衍生物分子(糖元)縮合而成的次級代謝產(chǎn)物的統(tǒng)稱，結(jié)構(gòu)式如圖1。苷元又稱甙元，是糖苷類化合物中，與糖縮合的非糖部分。苷元通過氧原子與糖元結(jié)合為氧苷；與硫原子結(jié)合是硫苷；與羧酸根結(jié)合是糖酯；與胺基結(jié)合是氮苷；由碳原子直接與糖元連接，稱為碳苷[4]。

圖1 植物甙分子結(jié)構(gòu)式

植物中的植物甙類活性成分對人體有廣泛的生理藥理功效。其中，黃芩中的黃芩苷具有降壓、鎮(zhèn)靜、保肝、抗菌、消炎等多種藥理作用[5]。積雪草中的積雪草苷具有抗腫瘤、抗纖維化、抗炎、抗阿爾茨海默病、改善學習記憶能力、抗抑郁、抑制瘢痕增生和修復皮膚損傷等多種藥理作用[6]。虎杖中的虎杖苷有改善心肌損傷、保護血管、降血脂、抗脂質(zhì)過氧化、抗肺動脈高壓、抗休克血管損傷以及抗血栓等心血管方面的作用，還具有抗炎、保護骨髓、促進創(chuàng)面愈合、抗輻射等藥理活性[7]。甘草總皂苷能夠通過抑制COX-2的表達以及炎性因子的活性，從而影響前列腺素E2的合成。甘草苷可以通過提高超氧化歧酶活性，提高體內(nèi)抗氧化酶的活性，減少自由基，抑制體內(nèi)過氧化物的生成，通過抗自由基的方式來改善抑郁癥。甘草苷能夠有效的降低模型動物的心率，減少烏頭堿的心臟毒性，同時擴大烏頭堿對心臟作用的安全使用范圍[9]。

因此在牙膏中添加植物甙類活性成分，可增加牙膏的口腔健康護理功效。本研究研制開發(fā)了一款含植物甙的牙膏，其植物甙來自積雪草、虎杖根、黃芩根、茶葉、光果甘草根等多種植物。從牙齒、牙齦、口腔環(huán)境、口腔潰瘍及安全性等5個維度對所研制的植物甙牙膏進行了測評，驗證此款植物甙牙膏在預防或緩解口腔問題上的功效及其安全性。

3 功效評價方法

3.1 牙齒維度評價

氟化物進入人體后很容易被吸收且絕大部分被存儲在體內(nèi)的礦化組織中，如骨和牙齒。氟可以通過血液進入人體組織，也可以通過牙面直接獲取。牙齒萌出后，釉質(zhì)內(nèi)的氟主要來自唾液，牙本質(zhì)內(nèi)的氟則來自血液循環(huán)系統(tǒng)。許多研究證明氟可被釉質(zhì)中的羥磷灰石吸收形成氟磷灰石，釉質(zhì)中氟磷灰石的增加能降低牙釉質(zhì)溶解性，增強牙釉質(zhì)抗酸性以及再礦化效能。氟可以抑制口腔鏈球菌利用葡萄糖產(chǎn)酸、抑制獲得性膜的形成，以及抑制牙面上細菌堆積。WHO已規(guī)定可以將含氟牙膏作為局部用氟化物防齲措施。20世紀初期，氟化物已被用在牙膏上，預防齲齒[9]。

GB/T 8372-2017中規(guī)定了防齲牙膏中成人牙膏含氟量為1000～1500ppm，兒童牙膏為500～1000ppm。

選用GB/T 8372-2017中游離氟和總氟含量的檢測方法，檢測植物甙牙膏中氟含量。

3.2 牙齦維度評價

3.2.1 抑菌測試

試驗菌株選擇金黃色葡萄球菌( ATCC 6538) 、大腸桿菌( ATCC 25922 )、白色念珠菌( ATCC 10231)、表皮葡萄球菌( ATCC 12228)、牙齦卟啉單胞菌( ATCC 33277)、變異鏈球菌 ( ATCC 700610)、粘性放線菌( C505)。參照QB/T2738-2012 第7.3進行試驗，分別測試用去離子水將牙膏稀釋3倍、100倍后樣品的抑菌率，作用時間2min，試驗重復3 次，取平均值。

3.2.2 臨床試驗

采用QB/T 2966-2014功效型牙膏標準規(guī)定的《牙膏功效評價中的抑制牙菌斑和(或)減輕牙齦炎癥功效(WS/T 326.3-2010)》評價植物甙牙膏抑制牙菌斑和減輕牙齦炎的有效性。

3.3 口腔環(huán)境維度評價

3.3.1 去除外源性色斑效果評價

先用牛牙牙釉質(zhì)制作牙釉質(zhì)樣本塊，隨后進行打磨、拋光、清洗、酸蝕等處理，得到無差異的牛牙牙釉質(zhì)塊。用咖啡、紅茶、胃粘蛋白、醬油、氯化鐵等配制一定濃度的染色液，將處理過的牛牙釉質(zhì)塊浸泡在染色液中，持續(xù)染色12d。將染色后的牙釉質(zhì)塊編號并標記好，用色差計測量牙釉質(zhì)的顏色(L*刷牙前)，選擇L*值在30～50的牙釉質(zhì)塊，隨機分組，每組8塊。用去離子水將測試樣品和對照組牙膏配制成一定濃度的牙膏漿液。將染色后的牙釉質(zhì)塊放入自動機械刷牙機的固定槽內(nèi)固定，安裝牙刷頭，使刷毛垂直接觸牙釉質(zhì)表面。稱取相同重量的待測樣品勻漿放入自動機械刷牙機上，使牙膏漿埋沒牙釉質(zhì)樣本，往返刷牙800次。刷牙結(jié)束后，將牙釉質(zhì)樣本從刷牙機上取出，用水沖洗干凈，用紙巾吸干水，晾干。之后測定刷牙后牙釉質(zhì)顏色(L*刷牙后)，并計算刷牙前后L*值的差值△L*=L*刷牙后-L*刷牙前。采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件，獨立樣本t 檢驗。如果樣品組△L*值大于對照組△L*值，且兩組△L*值比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，可認為受試物能有效去除外源性色斑。

3.3.2 預防外源性色斑附著效果評價

先用咖啡、紅茶、胃粘蛋白、醬油、氯化鐵等配制一定濃度的染色液及人工唾液，將羥基磷灰石(HAP)片隨機分組，每組8個，用色差計測量L*值，記為L*處理前。將羥基磷灰石片浸泡在人工唾液中，放置于37℃恒溫箱1.5小時，以便在羥基磷灰石片表面形成生物膜。用去離子水將測試樣品配制成一定濃度的牙膏漿。將分組后的羥基磷灰石片分別浸泡在試驗樣品和對照組牙膏漿中，3分鐘后取出，在清水中蘸洗后，用吸水紙擦干。隨后，同時浸泡在染色液中3分鐘，取出羥基磷灰石片用清水蘸洗，并用吸水紙擦干，然后用色差計測量L*值，記為L*處理后。比較試驗樣品與對照組羥基磷灰石片的L*值，L*值越大，表明羥基磷灰石片白度越大，證明牙膏預防色斑形成的能力越強。采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件，獨立樣本t檢驗。如果測試樣品L*值大于對照組L*值，且兩組L*值比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，可認為受試物具有預防色斑的功效。

3.4 口腔潰瘍維度評價

取健康剛成年的雄性SD大鼠，腹腔注射麻醉，苯酚燒灼法進行造模。造模成功判斷標準：被燒灼區(qū)形成圓形或橢圓形直徑約5mm的潰瘍，周圍有紅腫隆起，粘膜表面粗糙不平，有灰白或黃色假膜，活動量、攝食量、飲水量減少、大便較稀。造模后第2天，取造模成功的口腔潰瘍雄性SD大鼠數(shù)量30只，隨機分成3組，每組10只，即模型組、植物甙牙膏組、西瓜霜組，其中西瓜霜為陽性對照組。用消毒棉簽黏取相應(yīng)藥物涂布于口腔潰瘍處，植物甙牙膏和西瓜霜粉末均完全覆蓋創(chuàng)面，每天涂抹2次，給藥間隔6h，連續(xù)治療5d，以潰瘍完全愈合為結(jié)束終點。每天觀測口腔粘膜的變化，測定無水腫粘膜潰瘍面積，觀察炎癥充血情況，并用數(shù)碼相機對潰瘍變化進行拍照記錄。檢測時間點：造模后涂抹前、給藥2、4、6天。用游標卡尺測得潰瘍直徑，并計算潰瘍面積。同時計算單位時間內(nèi)各動物的攝水量和攝食量。

評定指標：在涂抹后的第5d記錄潰瘍面積：<1mm2為愈合，≥1mm2為未愈合。模型組為不給任何藥物組。西瓜霜來源桂林三金藥業(yè)股份有限公司，灰黃綠色粉末。

3.5 安全性評價

3.5.1 磨擦值檢測

因含有固體磨料，長年累月使用磨擦值大的牙膏，雖然能很好清潔牙齒，但也會磨損牙齒，造成牙釉質(zhì)流失。磨損值越大，對牙齒磨損程度越高。選擇牙膏要選用清潔率高、磨擦值小的產(chǎn)品。采用《牙膏磨擦值測試方法(GB/T 35832-2018)》來測試牙膏的磨擦值Ra。磨擦值越小，說明牙膏對牙齒的磨損越小。

美白牙膏要達到去除牙面色斑的效果，在磨料清潔、去漬上會比其他類型的牙膏高，相應(yīng)的磨擦值也會更高，因此選用宣稱具有美白牙膏功效的牙膏作為對照樣品，測試植物甙牙膏的磨擦值相對高低。

3.5.2 急性經(jīng)口毒性試驗

選用20g左右的KM小鼠10只，雌雄各半，SPF級。稱取植物甙牙膏5g，加入純水配置成10mL樣品溶液。采用一次最大限度試驗，只設(shè)5000mg/kg體重一個劑量組。試驗前10只小鼠全部禁食過夜，不限飲水。空腹灌胃1次，每次灌胃容量10.0mL/kg體重。染毒后立即觀察并記錄動物的中毒表現(xiàn)、死亡數(shù)和死亡時間，觀察期14d，試驗結(jié)束時未死亡動物稱重。按《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)急性經(jīng)口毒性試驗評價規(guī)定判斷毒性分級。

3.5.3 急性眼刺激試驗

選用3只普通級新西蘭雌兔2.2kg左右。稱取0.1mL植物甙牙膏涂抹兔一側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)，被動閉合1s，30s后用生理鹽水沖洗，另一側(cè)眼睛不處理作為對照。于滴眼后1h、24h、48h、72h、7d、14d、21d肉眼觀察兔眼結(jié)膜、虹膜、角膜損失與恢復情況并進行評分。如果72h未出現(xiàn)刺激反應(yīng)，或第7d或14d眼睛刺激反應(yīng)完全恢復，可提前終止試驗。按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)急性眼刺激性試驗規(guī)定進行結(jié)果判定。

4 結(jié)果

4.1 牙膏中氟含量

在植物甙牙膏中添加氟化鈉含量為0.32%，理論含氟量是0.145%。檢測植物甙牙膏起始、常溫存放1年、2年以及45℃老化3個月時的氟含量，結(jié)果如表1。根據(jù)表1的結(jié)果，常溫存放兩年及45℃老化3個月后，牙膏中氟含量穩(wěn)定，幾乎沒有下降。植雅甙牙膏中氟含量很穩(wěn)定，氟和植物甙成分相容性較好。

表1 植物甙牙膏中氟含量隨時間變化

4.2 抑菌測試

刷牙時，牙膏會被唾液稀釋。實驗分別用3和100倍去離子水稀釋牙膏，制得牙膏漿液后，測其抑菌率，結(jié)果如表2。用3和100倍去離子水稀釋牙膏是分別模擬牙膏在正常刷牙過程中可能被稀釋的倍數(shù)以及被無限稀釋后的狀態(tài)。

表2 植物甙牙膏的抑菌率

由表2 的結(jié)果可知，植物甙牙膏被稀釋3倍，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、表皮葡萄球菌、牙齦卟啉單胞菌、變異鏈球菌、粘性放線菌均有抑菌作用；稀釋100倍后，牙膏對金黃色葡萄球菌、粘性放線菌仍具有抑菌作用。

4.3 臨床試驗

臨床試驗結(jié)果是85例受試者均完成了試驗。經(jīng)獨立性樣本T檢驗，兩組基線無顯著性差異(P>0.05)。整個試驗過程中，試驗對象及檢查者均沒有牙膏副作用的報告?；€檢查結(jié)果見表3。

表3 試驗對象的基線檢查結(jié)果

使用牙膏后1.5個月和3個月的檢查結(jié)果見表4。與對照牙膏相比，使用植物甙牙膏1.5個月，分別減少牙齦炎指數(shù)及齦上菌斑指數(shù)為14.72%(P<0.05)與9.89%(P<0.05)；使用植物甙牙膏3個月，分別減少的牙齦炎指數(shù)及齦上菌斑指數(shù)為15.89%(P<0.05)與22.98%(P<0.05)。

表4 試驗前后受試者牙齦指數(shù)與菌斑指數(shù)變化情況

臨床試驗結(jié)果顯示，使用植物甙牙膏具有抑制牙菌斑、控制牙菌斑形成、降低齦炎指數(shù)、減輕牙齦炎癥的功效。

4.4 去除外源性色斑效果評價

選用市售普通不宣稱美白功效的含氟牙膏作為陰性對照組，選用市售宣稱美白的水合硅石體系的牙膏作為陽性對照組，與植物甙牙膏同步測試去除外源性色斑的效果，結(jié)果如下表5。

表5 植物甙牙膏去除外源性色斑效果

由表5的結(jié)果可知，與陰性對照組牙膏比較，植物甙牙膏可有效去除咖啡、紅茶、醬油等污漬引起的牙釉質(zhì)外源性色斑。與陽性對照組牙膏相比，植物甙牙膏提高染色牛牙的亮度值更高。

4.5 預防外源性色斑附著效果評價

選用與4.4一樣的陰性對照樣和陽性對照樣。與植物甙牙膏同步測試預防外源性色斑的效果，結(jié)果如下表6。

表6 植物甙牙膏預防外源性色斑附著效果

由表6的結(jié)果可知，與陰性對照組牙膏比較，植物甙牙膏可有效預防咖啡、紅茶、醬油等引起的外源性色斑附著；與陽性對照組牙膏效果相當。

4.6 口腔潰瘍效果試驗

模型組、西瓜霜組、植物甙牙膏組對大鼠口腔潰瘍影響結(jié)果如表7。由表7結(jié)果可知，與模型組對比，使用植物甙牙膏3天就有顯著性促進大鼠口腔潰瘍愈合的效果，其效果與西瓜霜相當。

表7 植物甙牙膏對苯酚燒灼法致SD大鼠口腔潰瘍面積的影響

4.7 磨擦值檢測

篩選市售宣稱美白的水合硅石體系牙膏和碳酸鈣體系牙膏作為對比樣，其中水合硅石體系牙膏選擇了宣稱含有高清潔型二氧化硅(簡稱HCS二氧化硅)和不宣稱含有高清潔型二氧化硅兩種類型的美白牙膏。三種牙膏與植物甙牙膏同時測試磨擦值，結(jié)果如下表8。

表8 植物甙牙膏的磨擦值Ra

由表8的結(jié)果可知，在美白類產(chǎn)品中，植物甙牙膏的磨擦值適中稍偏低，略高于不宣稱含有高清潔型二氧化硅的美白牙膏，遠遠低于含HCS水合硅石體系牙膏和碳酸鈣體系的牙膏。

4.8 急性經(jīng)口毒性試驗

急性經(jīng)口毒性試驗染毒后，實驗小鼠未見任何中毒癥狀和死亡，實驗結(jié)束后對存活動物解剖，肉眼未見異常。植物甙牙膏對雌雄性KM小鼠急性經(jīng)口毒性LD50>5000mg/kg 體重，屬實際無毒級。

4.9 急性眼刺激試驗

植物甙牙膏原樣對新西蘭兔急性眼刺激試驗的3只動物角膜損害、虹膜損害、結(jié)膜充血和結(jié)膜水腫的積分均值為0，根據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)第六章毒理學試驗方法5急性眼刺激性/腐蝕性試驗反應(yīng)分級標準，屬無刺激性。

5 結(jié)論

植物甙成分是植物體內(nèi)的次級代謝產(chǎn)物，具有消炎、抗氧化、止痛、抗菌、抗病毒、清熱、抗炎等多種作用。將植物甙加入牙膏中，通過刷牙，局部暫短接觸給藥方式，幫助人們改善各種口腔問題。從牙齒、牙齦、口腔環(huán)境、口腔潰瘍及安全性等多個維度研究了植物甙牙膏的功效和安全性，結(jié)果表明本研究的植物甙牙膏具有防齲、堅固牙釉質(zhì)、抑制牙菌斑、降低牙齦炎、促進口腔潰瘍愈合、去除外源性色斑及與預防色斑附著等多種功效。經(jīng)安全性測試，植物甙牙膏磨擦值適中、急性經(jīng)口毒性試驗屬無毒級、急性眼刺激試驗屬無刺激性，且臨床試驗無不良反應(yīng)發(fā)生，說明此植物甙牙膏安全可靠。

人體是一個統(tǒng)一的整體，各個部分之間在生理上互相聯(lián)系，在病理上相互影響?？谇晃痪宇^面部，為五官之一，是人體重要組成部分。我國的口腔疾病患病率和發(fā)病率均較高，是影響我國居民健康常見病和多發(fā)病?？谇患膊∫呀?jīng)成為危及居民健康的主要公共衛(wèi)生問題之一?？谇患膊θ硇约膊∫灿嘘P(guān)聯(lián)和影響。如，牙周感染會提高患者外周血中G-反應(yīng)蛋白及其他生物標記物的濃度，導致系統(tǒng)性炎癥的水平升高，并通過多種機制參與或促進動脈粥樣硬化的形成；口腔慢性病灶可以增加呼吸道感染的發(fā)病率，使呼吸道致病菌增殖而發(fā)生感染；糖尿病和牙周炎之間存在雙向相關(guān)關(guān)系。口腔健康關(guān)系到全身健康，要呵護牙齒，保持口腔清潔、衛(wèi)生，減少和降低各種口腔疾病的發(fā)生。口腔包含牙齒、牙齦、舌、咽、粘膜、軟腭、硬腭等多個部位，對口腔呵護不能只局限在牙齒上，從牙齦、牙齒、口腔環(huán)境、口腔潰瘍等多個維度整體、綜合護理，使口腔保持健康狀態(tài)。