昆蟲(chóng)氣味受體研究進(jìn)展

祁全梅，李秋榮

（青海省農(nóng)林科學(xué)院/青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西寧作物有害生物科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，青海 西寧 810016）

昆蟲(chóng)是動(dòng)物界中最大的一個(gè)類群，它們通過(guò)視覺(jué)、聽(tīng)覺(jué)、觸覺(jué)、嗅覺(jué)等感官來(lái)感受外界環(huán)境，能精確嗅到周圍環(huán)境中氣味物質(zhì)的細(xì)微變化，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，形成了高度特化、極其靈敏的嗅覺(jué)系統(tǒng)。昆蟲(chóng)的嗅覺(jué)是行為感覺(jué)的一種重要信號(hào)輸入來(lái)源，是其生存和繁衍的關(guān)鍵［1］。靈敏的嗅覺(jué)對(duì)昆蟲(chóng)的生活習(xí)性有著直接或間接的影響，在一定距離范圍內(nèi)，昆蟲(chóng)利用嗅覺(jué)感器識(shí)別環(huán)境中各種不同的氣味分子，包括寄主植物、異性、天敵等釋放的化學(xué)信號(hào)來(lái)確定飛行方向，從而定位寄主植物、尋找配偶、控制交尾、選擇產(chǎn)卵場(chǎng)所、警惕和躲避天敵等，因此，嗅覺(jué)系統(tǒng)對(duì)昆蟲(chóng)生存和繁衍后代尤為關(guān)鍵。

寄主植物揮發(fā)性化合物的主要化學(xué)成分包括飽和及不飽和脂肪族醛類、酮類、醇類和酯類、烯萜類等，這些成分在化學(xué)感受過(guò)程中，主要發(fā)揮以下3 種功能：一是吸引害蟲(chóng)，幫助搜索食物或選擇產(chǎn)卵地；二是驅(qū)避害蟲(chóng)，阻止取食植物或阻止產(chǎn)卵；三是吸引瓢蟲(chóng)、食蚜蠅、寄生蜂等天敵昆蟲(chóng)。通過(guò)研究揮發(fā)性化合物對(duì)植食性昆蟲(chóng)桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis的作用，發(fā)現(xiàn)香梨、桃、甜橙和檸檬的揮發(fā)物對(duì)桔小實(shí)蠅的嗅覺(jué)行為產(chǎn)生影響，它們均對(duì)桔小實(shí)蠅雌蟲(chóng)具有顯著的引誘活性，由此可知，植食性昆蟲(chóng)的嗅覺(jué)系統(tǒng)對(duì)寄主植物的揮發(fā)物反應(yīng)非常敏感，而且揮發(fā)物在昆蟲(chóng)的生存和繁殖中具有重要作用［2-5］。

昆蟲(chóng)性信息素是由雌蟲(chóng)或雄蟲(chóng)分泌，被同種異性個(gè)體的嗅覺(jué)感受器所接受，并引起異性個(gè)體產(chǎn)生覓偶定向、求偶交配等生殖行為反應(yīng)的微量揮發(fā)性化合物，主要功能是調(diào)控昆蟲(chóng)的求偶、交尾等性行為，因此，性信息素及相應(yīng)的嗅覺(jué)感受對(duì)昆蟲(chóng)繁衍后代尤為關(guān)鍵。有些種類的昆蟲(chóng)還會(huì)產(chǎn)生聚集信息素、報(bào)警信息素等，這些信息素被同種其他昆蟲(chóng)感受到之后會(huì)觸發(fā)相應(yīng)的行為。寄主植物揮發(fā)物、昆蟲(chóng)性信息素、聚集信息素以及報(bào)警信息素被統(tǒng)稱為“氣味分子”或“信息化合物”。

對(duì)昆蟲(chóng)嗅覺(jué)的研究起初主要集中在果蠅、家蠶和東亞飛蝗等模式昆蟲(chóng)，隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，對(duì)其他種類的昆蟲(chóng)嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)制的探索也受到了廣泛關(guān)注，由于昆蟲(chóng)嗅覺(jué)系統(tǒng)在昆蟲(chóng)行為中起著十分重要的作用，嗅覺(jué)系統(tǒng)中的蛋白成為潛在的防治分子靶標(biāo)，因此昆蟲(chóng)嗅覺(jué)相關(guān)基因及其編碼蛋白在氣味識(shí)別過(guò)程中所發(fā)揮的作用以及嗅覺(jué)識(shí)別的機(jī)制逐漸成為研究熱點(diǎn)。在昆蟲(chóng)對(duì)氣味的識(shí)別過(guò)程中有多種蛋白質(zhì)參與，嗅覺(jué)系統(tǒng)中的主要蛋白家族包括氣味結(jié)合蛋白（Odorant-binding Proteins，OBPs）、化學(xué)感受蛋白（Chemosensory Proteins，CSPs）、氣味受體（Odorant Receptors，ORs）、離子型受體（Ionotropic Receptors，IRs）、感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白（Sensory Neuron Membrane Proteins，SNMPs）和氣味降解酶（Odorant Degrading Enzyme，ODE）等［6］，它們?cè)谥鲗?dǎo)調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)的取食、交配和產(chǎn)卵等一系列行為中發(fā)揮著重大作用。其中，氣味受體是化學(xué)感受系統(tǒng)中更為核心的元件，ORs 對(duì)氣味分子的專一性識(shí)別過(guò)程是最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，而ORs 介導(dǎo)的氣味分子與嗅覺(jué)神經(jīng)元的專一性結(jié)合是重要的嗅覺(jué)識(shí)別基礎(chǔ)，在決定化學(xué)感受的專一性、敏感性及昆蟲(chóng)特定行為的輸出方面具有更為重要的作用。

研究昆蟲(chóng)ORs 的氣味分子反應(yīng)譜、ORs-信息化合物-行為三者之間的關(guān)系以及ORs 的具體功能，可以解釋昆蟲(chóng)行為產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)，明確害蟲(chóng)經(jīng)由ORs 調(diào)控的嗅覺(jué)識(shí)別分子機(jī)制，有助于了解害蟲(chóng)種間以及與寄主植物、天敵之間的通訊關(guān)系，為開(kāi)發(fā)對(duì)害蟲(chóng)有效的食物引誘劑、食物驅(qū)避劑或聚集信息素等奠定理論基礎(chǔ)，從應(yīng)用角度看，有助于開(kāi)發(fā)新的防控技術(shù)與方法，加快食誘劑、拒食劑和聚集信息素等在害蟲(chóng)防控上的應(yīng)用步伐。研究ORs與揮發(fā)性化合物、行為之間的關(guān)系，是闡明昆蟲(chóng)對(duì)化學(xué)信號(hào)進(jìn)行識(shí)別的分子機(jī)制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，深入探索昆蟲(chóng)嗅覺(jué)相關(guān)基因的功能，將有助于昆蟲(chóng)嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)制的研究，進(jìn)而通過(guò)調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)嗅覺(jué)識(shí)別過(guò)程，控制昆蟲(chóng)相關(guān)行為，為害蟲(chóng)的預(yù)防和治理提供綠色、安全的新方法，為闡釋昆蟲(chóng)行為的產(chǎn)生機(jī)理奠定分子基礎(chǔ)。

1 昆蟲(chóng)氣味受體的鑒定與分類

1.1 氣味受體的鑒定

氣味受體是一種由嗅覺(jué)細(xì)胞表達(dá)的蛋白，能與氣味分子結(jié)合，屬于多基因超家族。20 世紀(jì)90 年代初，首次發(fā)現(xiàn)于大鼠和人類的嗅覺(jué)上皮細(xì)胞［7-8］，隨后，科學(xué)家經(jīng)過(guò)不斷地探索，先后從脊椎動(dòng)物鳥(niǎo)類、魚(yú)類、兩棲動(dòng)物等體內(nèi)克隆到相似的ORs 基因［9-10］，從無(wú)脊椎動(dòng)物線蟲(chóng)中篩選得到ORs 基因［11］。昆蟲(chóng)研究者最初通過(guò)設(shè)計(jì)ORs 簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，均未能成功，使昆蟲(chóng)ORs 基因的鑒定在一定程度上受阻。而后受益于基因組、轉(zhuǎn)錄組技術(shù)及生物信息學(xué)的快速發(fā)展，完成了多種昆蟲(chóng)的基因組測(cè)序，使昆蟲(chóng)ORs 基因得以快速鑒定。昆蟲(chóng)的第一個(gè)ORs 基因在黑腹果蠅Drosophila melanogaster體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，它類似于G 蛋白偶聯(lián)受體的神經(jīng)肽受體［12］，通過(guò)生物信息學(xué)手段、RNA 原位雜交技術(shù)等明確了果蠅的19 種嗅覺(jué)基因［13］，隨后，在雙翅目、鞘翅目、膜翅目、鱗翅目、半翅目和直翅目等昆蟲(chóng)體內(nèi)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)并鑒定得到ORs，從果蠅屬Drosophila、赤擬谷盜Tribolium castaneum、中華蜜蜂Apis cerana cerana、家蠶Bombyx mori、岡比亞按蚊Anopheles gambiae、稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus、棉蚜Aphis gossypii、柑橘木虱Diaphorina citri和亞洲小車蝗Oedaleus decorus asiaticus等昆蟲(chóng)中分別鑒定到62、259、170、64、79、41、45、46、60 個(gè)ORs 基因［14-22］。

1.2 氣味受體的分類

氣味受體分為兩個(gè)大類：一類為傳統(tǒng)氣味受體（Conventional Odorant Receptors，ORs），另一類為非典型氣味受體（Odorant Receptor Coreceptor，ORCO），傳統(tǒng)型氣味受體又分為普通氣味受體（Original Odorant Receptors，OORs）和性信息素氣味受體（Pheromone Receptors，PRs），每種昆蟲(chóng)有多個(gè)ORs 和1 個(gè)ORCO。不同種類昆蟲(chóng)含有的ORs 基因的數(shù)量存在較大差別，受體間的同源性較低，僅約20%，且在少數(shù)嗅覺(jué)神經(jīng)元中表達(dá)；而ORCO 則具高度保守性，同源性最高可以達(dá)到99%，在大多數(shù)嗅覺(jué)神經(jīng)元中表達(dá)。不同種類昆蟲(chóng)的非典型氣味受體的名稱有所不同，黑腹果蠅的非典型氣味受體被命名為Or83b［23］，鱗翅目的非典型氣味受體被命名為OR2［24］。非典型氣味受體是ORs 形成有選擇性的離子通道、正常發(fā)揮功能所必須的蛋白組分［25］，不能識(shí)別氣味分子，與ORs 共表達(dá)并協(xié)助其完成對(duì)氣味分子的識(shí)別過(guò)程。

2 昆蟲(chóng)氣味受體的蛋白結(jié)構(gòu)與表達(dá)

2.1 氣味受體的蛋白結(jié)構(gòu)

昆蟲(chóng)ORs 是位于嗅覺(jué)感受神經(jīng)元樹(shù)突膜上的一種疏水性膜蛋白，編碼約300～600 個(gè)氨基酸，其N 端不存在信號(hào)肽，但有一個(gè)保守的糖基化位點(diǎn)，胞內(nèi)的環(huán)上存在幾個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)。由于此類膜蛋白的含量很低，解析它們的蛋白晶體結(jié)構(gòu)困難較大，目前僅有高度保守的非典型氣味受體ORCO 的結(jié)構(gòu)被解析［26］。

曾經(jīng)認(rèn)為昆蟲(chóng)的ORs 結(jié)構(gòu)與典型的脊椎動(dòng)物G 蛋白偶聯(lián)受體（G Protein-Coupled Receptor，GPCR）相同，C 端在細(xì)胞膜內(nèi)，N 端在細(xì)胞膜外（圖1 左）。但21 世紀(jì)初，通過(guò)抗體標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，在果蠅、岡比亞按蚊體內(nèi)發(fā)現(xiàn)多種ORs 基因的N 端在細(xì)胞膜內(nèi)，而C 端在細(xì)胞膜外（圖1 右），與脊椎動(dòng)物的ORs 分子結(jié)構(gòu)恰好相反，此結(jié)果符合隱含馬爾科夫模型。因此，推斷昆蟲(chóng)的ORs 基因不屬于G 蛋白偶聯(lián)家族，說(shuō)明昆蟲(chóng)和脊椎動(dòng)物在進(jìn)化過(guò)程中可能形成了兩種不同的嗅覺(jué)系統(tǒng)，昆蟲(chóng)ORs基因可能與典型的GPCR有不同的進(jìn)化起源。

圖1 哺乳動(dòng)物（左）和昆蟲(chóng)（右）的氣味受體結(jié)構(gòu)模式［26］Fig.1 Structural model of odorant receptors in mammalian（left）and insect（right）

昆蟲(chóng)ORs 蛋白結(jié)構(gòu)的典型特征是大多包括7個(gè)長(zhǎng)度為19～26 個(gè)氨基酸的疏水區(qū)，即7 次α-螺旋跨膜蛋白（TM）形成的結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域包含一個(gè)保守片段〔Phe-Pro-X-Cys-Tyr（X）20-Trp〕，其中，保守性最高的是橫跨第6 和第7 跨膜區(qū)域的C 端。除保守區(qū)外，跨膜3、4、5 區(qū)的序列都顯示出高度多樣性，類比7 次α-螺旋跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)3、4、5 區(qū)是氣味分子識(shí)別和結(jié)合區(qū)域的一部分，已在3、4、5 區(qū)確定了 17 個(gè)高度可變的氨基酸殘基，ORs 跨膜3、4、5 區(qū)的可變氨基酸殘基可能與氣味識(shí)別多樣性有關(guān)。

2.2 氣味受體的表達(dá)

不同氣味受體基因在昆蟲(chóng)發(fā)育各個(gè)階段的表達(dá)情況不盡相同。從果蠅基因組中發(fā)現(xiàn)了60 個(gè)ORs 基因，其中，只有23 個(gè)在幼蟲(chóng)期表達(dá)，43個(gè)在成蟲(chóng)期表達(dá)［27］，中黑盲蝽AsutOrco主要在成蟲(chóng)期表達(dá)，且在雌、雄蟲(chóng)觸角內(nèi)高表達(dá)［28］，煙夜蛾HassOr83b在幼蟲(chóng)各齡期皆有表達(dá)，HassOr83b和HassOr18在煙夜蛾成蟲(chóng)觸角和喙內(nèi)高表達(dá)，而其他蟲(chóng)體組織無(wú)表達(dá)［29-30］，柑桔木虱DcitOrco在若蟲(chóng)和成蟲(chóng)期表達(dá)量較低且穩(wěn)定，而8 個(gè)DcitORs在該蟲(chóng)各發(fā)育階段均表達(dá)，且在若蟲(chóng)期表達(dá)量更高［31］。

普通氣味受體基因在昆蟲(chóng)不同性別、不同組織或器官中的表達(dá)存在一定差異。甜菜夜蛾SexiOR3和SexiOR18這兩個(gè)氣味受體基因主要在觸角表達(dá)，且在雌蟲(chóng)觸角中的表達(dá)量明顯高于雄蟲(chóng)觸角［32］；李兆群采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，從大草蛉、中華通草蛉體內(nèi)分別鑒定得到39 個(gè)、37 個(gè)ORs 基因，這些ORs 基因在觸角內(nèi)高表達(dá)或特異表達(dá)，其中，CpalOR11、CpalOR14、CpalOR17及CpalOR25在除觸角外的其他組織也有少量表達(dá)［33］；采用半定量PCR 分析ORs 基因在小菜蛾觸角和其他嗅覺(jué)感器中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ORs 主要在觸角內(nèi)表達(dá)，其中，PxylOR16、PxylOR17和PxylOR18在觸角中大量表達(dá)，且雌雄成蟲(chóng)之間沒(méi)有顯著差異，PxylOR17在雌蛾生殖器中有一定表達(dá)，PxylOR18在雌蛾腹部也有表達(dá)［34］；中華按蚊Anopheles sinensis和中華蜜蜂Apis cerana cerana的氣味受體基因ORs 在觸角的表達(dá)量顯著高于其他組織［35-36］；對(duì)綠盲蝽110個(gè)ORs 在4 種組織進(jìn)行半定量，其中，兩性成蟲(chóng)觸角中各有2 個(gè)特異表達(dá)的AlucORs，分別有10個(gè)和18 個(gè)ORs 在雌、雄蟲(chóng)觸角中的表達(dá)量高于頭部、胸部和腹部等其他組織［37］。

非典型性氣味受體基因在同種昆蟲(chóng)的不同組織或器官中的表達(dá)量各異。桃蛀螟CpunOrco主要在雌、雄蛾觸角及下顎表達(dá)，在胸部、腹部和足等組織也有少量表達(dá)［38］，甜菜夜蛾SexiOR2在毛形、腔錐形和錐形感器中有表達(dá)，在栓錐形和刺形嗅覺(jué)感器中無(wú)表達(dá)［24］，綠盲蝽AlucOrco在雌成蟲(chóng)觸角中的表達(dá)量顯著高于雄成蟲(chóng)觸角［39］，麗蠅科絲光綠蠅LserOrco和大頭金蠅CmegOrco在觸角和下顎須中大量表達(dá)，在雌蟲(chóng)產(chǎn)卵器中微量表達(dá)，而在胸部無(wú)表達(dá)，且這兩種麗蠅科昆蟲(chóng)非典型氣味受體基因的表達(dá)量均隨蟲(chóng)齡增長(zhǎng)而增加［40］，埃及伊蚊Aedes aegypti和致倦庫(kù)蚊Culex quinquefasciatus的ORCO 基因在它們的觸角、下顎須和喙中均有表達(dá)［41-42］，而ORCO 只在斜紋夜蛾Spodoptera litura和中紅側(cè)溝繭蜂Microplitis mediator的觸角中特異表達(dá)［43-44］。在昆蟲(chóng)的不同嗅覺(jué)神經(jīng)元上，表達(dá)的ORs 基因的數(shù)量也存在差異。一個(gè)嗅覺(jué)神經(jīng)元可以表達(dá)一個(gè)氣味受體基因，可以表達(dá)多個(gè)ORs 基因，也有些神經(jīng)元不表達(dá)ORs 基因［45］。

3 昆蟲(chóng)氣味受體的功能

3.1 氣味受體功能研究方法

3.1.1 解析氣味受體配體的方法 研究昆蟲(chóng)氣味受體基因的功能，可為深入了解昆蟲(chóng)識(shí)別氣味分子的嗅覺(jué)分子機(jī)制提供理論依據(jù)。研究昆蟲(chóng)氣味受體的功能，可通過(guò)測(cè)定ORs 的氣味分子反應(yīng)譜，從中篩選有生物學(xué)功能的配體，解析ORs 配體的方法主要有兩種：

一是體外驗(yàn)證法，即通過(guò)異源細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)篩選，異源細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)包括：（1）非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，是在體外研究昆蟲(chóng)ORs基因功能、驗(yàn)證ORs 基因配體方面的一個(gè)較常用、較成功的系統(tǒng)。該技術(shù)先在體外合成ORs 和ORCO 基因的cRNA，注射到爪蟾卵母細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)孵育培養(yǎng)，使用雙電壓電壓鉗在浴液中記錄卵細(xì)胞對(duì)氣味刺激的反應(yīng)，爪蟾卵母細(xì)胞個(gè)體大、易培養(yǎng)且利于膜蛋白-ORs 基因表達(dá)。利用非洲爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，已完成了甜菜夜蛾Spodoptera exigua［46］、斜紋夜蛾S.litura［47］和煙青蟲(chóng)Heliothis assulta［48］等多種昆蟲(chóng)ORs 的功能驗(yàn)證。（2）其他異源細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，主要有草地貪夜蛾Spodoptera frugiperdaSf9 卵巢細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、HEK293 人胚腎細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，HEK293 細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)較為常用的研究外源基因功能的細(xì)胞系統(tǒng)，Sf9 細(xì)胞是一種昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞，這兩個(gè)表達(dá)系統(tǒng)類似，將外源ORs 和Orco在細(xì)胞中共表達(dá)后，用不同的氣味分子刺激細(xì)胞，通過(guò)鈣成像系統(tǒng)測(cè)得受刺激后細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度升高［49］。（3）果蠅“空神經(jīng)元”表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)分子遺傳學(xué)方法構(gòu)建UAS/GAL4 基因異位表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)，可將任何基因在果蠅的特定組織和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。利用此種方法建立了果蠅的錐形感器和毛形感器這兩種感器的受體神經(jīng)元缺失品系，可為不同感器中表達(dá)的氣味受體提供與蟲(chóng)體內(nèi)相似的生理環(huán)境。果蠅的錐形感器中包含2個(gè)神經(jīng)元ab3A 和ab3B，ab3A 中表達(dá)的是OR22a和OR22b，人工敲除OR22a 和OR22b 基因獲得的神經(jīng)元被稱為△ab3A 空神經(jīng)元是常用的果蠅受體神經(jīng)元缺失突變體。通過(guò)UAS/GAL4 系統(tǒng)將外源ORs 特異性地表達(dá)于△ab3A 空神經(jīng)元中，由OR22a 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)，利用單感器（Single Sensillum Recording，SSR）記錄錐形感器ab3，從而獲得外源ORs 對(duì)應(yīng)的氣味分子反應(yīng)譜［50］。此外，開(kāi)發(fā)了果蠅毛形感器受體神經(jīng)元OR67d 缺失品系，通過(guò)將外源氣味受體基因ORs 特異的表達(dá)在黑腹果蠅的毛形感器△T1 空神經(jīng)元中，在OR67d啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，通過(guò)SSR 記錄發(fā)現(xiàn)目的ORs對(duì)某些信息素受體有很好的反應(yīng)譜，解決了在毛形感器中某些ORs 不適合在錐形感器中表達(dá)的問(wèn)題［51］。可能是由于果蠅感器能為ORs 基因提供類似于昆蟲(chóng)體內(nèi)的生理環(huán)境和蛋白組件，果蠅“空神經(jīng)元”表達(dá)系統(tǒng)反應(yīng)比其他方法更靈敏，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為精確，已有果蠅、岡比亞按蚊Anopheles gambiae和灰翅夜蛾Spodoptera littoralis的ORs基因家族使用果蠅“空神經(jīng)元”法驗(yàn)證了它們的氣味配體種類［49-51］。

二是體內(nèi)驗(yàn)證法，即在昆蟲(chóng)體內(nèi)篩選，利用即刻早期基因（Immediate Early Genes，IEGs）可以指示ORs 對(duì)外界氣味分子的反應(yīng)這一原理，篩選目標(biāo)ORs 的配體，這種方法首先在小鼠、果蠅和家蠶上得到驗(yàn)證，家蠶在受到蠶蛾醇這種性信息素刺激后，其性信息素受體基因BmorOR1與即刻早期基因BmHr38共表達(dá)與同一個(gè)神經(jīng)元中［52］，而這種方法到目前應(yīng)用仍很少。

3.1.2 RNAi 技術(shù) RNAi 是一種轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控機(jī)制，主要用于靶標(biāo)基因沉默，由于具有高度的序列特異性，而且抑制效果良好，操作簡(jiǎn)單，周期短，成為基因功能研究的重要工具。斑翅果蠅在注射ORCO dsRNA 24 h后很難準(zhǔn)確找到食物源，且大多數(shù)個(gè)體飛行無(wú)規(guī)則，化學(xué)行為明顯降低，而注射無(wú)RNase 水的斑翅果蠅大多數(shù)能準(zhǔn)確找到食物源且較活躍，說(shuō)明dsRNA 沉默了ORCO 基因的表達(dá)，降低了該蟲(chóng)的嗅覺(jué)能力，證實(shí)了ORCO在斑翅果蠅的嗅覺(jué)感受中發(fā)揮著重要作用［53］。利用RNAi 技術(shù)沉默松墨天牛Monochamus alternatus非典型性氣味受體基因ORCO，導(dǎo)致引誘劑、松節(jié)油及性信息素引起的電位降低，使該蟲(chóng)對(duì)氣味分子的行為趨向表現(xiàn)為隨機(jī)性，因此，ORCO 基因的沉默可能會(huì)對(duì)松墨天牛正常的嗅覺(jué)識(shí)別過(guò)程造成影響［54］。

3.1.3 新一代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9 技術(shù)基因組編輯是對(duì)基因功能進(jìn)行分析的一種重要的生物學(xué)工具，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)是繼TALEN 基因編輯技術(shù)之后又一重大突破，該技術(shù)通過(guò)RNA 指導(dǎo)Cas9 核酸酶對(duì)靶向基因進(jìn)行特定DNA 編輯，效率更高，Cas9 系統(tǒng)的載體構(gòu)建與使用也更加便捷，是目前使用廣泛的新一代基因編輯技術(shù)。利用CRISPR/Cas9 技術(shù)將東亞飛蝗的聚集信息素受體LmigOR35基因敲除后，東亞飛蝗觸角對(duì) LmigOR35 的配體4-乙烯基苯甲醚（4-vinylanisole，4VA）的電生理反應(yīng)以及4VA 對(duì)飛蝗的吸引效應(yīng)顯著降低［55］。煙草天蛾Manduca sexta的非典型性氣味受體基因ORCO 被敲除后，該蟲(chóng)的覓食行為受到影響，而產(chǎn)卵行為不受影響［56］。

3.2 傳統(tǒng)氣味受體的功能

氣味受體分布在嗅感神經(jīng)元樹(shù)突的膜表面，氣味分子或是其與OBPs 的復(fù)合物可以激活相應(yīng)的ORs 傳遞嗅覺(jué)信號(hào)，使昆蟲(chóng)產(chǎn)生反應(yīng)，ORs 主要起識(shí)別氣味分子的作用。果蠅的氣味受體基因DOr43能被環(huán)己酮、環(huán)己醇、苯甲醛和苯甲醇等氣味物質(zhì)激活［57］，稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis氣味受體基因CmedOr1的唯一配體是苯乙醛，而苯乙醛可誘集多種鱗翅目昆蟲(chóng)［58-59］，家蠶的氣味受體基因BmOr1能夠識(shí)別、感知蠶蛾醇這種性信息素［60］，煙青蟲(chóng)H.assulta、歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis、棉鈴蟲(chóng)Helicoverpa armigera等鱗翅目昆蟲(chóng)的個(gè)別ORs 基因也可以識(shí)別性信息素［61-62］。果蠅的氣味受體基因DOr22a和DOr22b 被敲除后，其失去了對(duì)氣味分子的敏感性［63］，埃及伊蚊AaOr8 和AaOr49 對(duì)該蟲(chóng)定位宿主、吸血具有很重要的作用［64］。

3.3 非典型氣味受體的功能

昆蟲(chóng)的非典型氣味受體ORCO 的功能與傳統(tǒng)ORs 不同，ORCO 不能單獨(dú)識(shí)別氣味分子，該基因的缺失會(huì)使昆蟲(chóng)嗅覺(jué)受損，細(xì)胞系通常需要將ORs 和ORCO 基因同時(shí)導(dǎo)入到細(xì)胞中，與ORs基因形成復(fù)合體才能把外界的氣味分子正確定位到體內(nèi)嗅覺(jué)神經(jīng)元的位點(diǎn)上，從而提高ORs 基因?qū)馕斗肿臃磻?yīng)的靈敏度，除非細(xì)胞系細(xì)胞可以表達(dá)內(nèi)源性的類似ORCO 的蛋白ORCO 介導(dǎo)的氣味分子和嗅覺(jué)神經(jīng)元的特異性結(jié)合是昆蟲(chóng)重要的嗅覺(jué)識(shí)別基礎(chǔ)，其與ORs 相互作用形成的異源二聚體對(duì)昆蟲(chóng)的嗅覺(jué)具有重要作用［65］。家蠶的BmorOrco基因被敲除后，其對(duì)兩種性信息素（E，Z）-10，12-十六碳烯醇和反-10，順-12-十六碳二烯醛均無(wú)反應(yīng)，且影響成蟲(chóng)的交配和幼蟲(chóng)對(duì)桑葉的選擇行為［66］，果蠅的DOrco基因被敲除后，其喪失了對(duì)供試氣味的選擇性，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)營(yíng)救后又能恢復(fù)正常［21］。沉默ORCO基因后，導(dǎo)致赤擬谷盜的對(duì)引誘劑、性信息素以及氣味劑的感受能力下降，正常的氣味識(shí)別過(guò)程被影響［67］。可見(jiàn)，昆蟲(chóng)的ORCO 基因在其嗅覺(jué)中占有不可或缺的地位。

4 問(wèn)題與展望

由于普通氣味受體在不同昆蟲(chóng)之間的同源性較低，最初用生物序列的同源性搜索方法尋找昆蟲(chóng)的氣味受體基因并未能成功，后來(lái)，研究者利用用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)方法，第一次從昆蟲(chóng)——果蠅的基因組中鑒定到氣味受體基因。大量研究表明，成功篩選并鑒定氣味受體基因主要是建立在對(duì)昆蟲(chóng)基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)上，同時(shí)，證明氣味受體基因廣泛存在于昆蟲(chóng)基因組中［68］，隨著越來(lái)越多昆蟲(chóng)基因組測(cè)序完成，氣味受體基因的篩選和鑒定工作得到了迅猛發(fā)展。受益于現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，從爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、HEK293、Sf9 細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和果蠅“空神經(jīng)元”表達(dá)系統(tǒng)等異源細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，到昆蟲(chóng)本體內(nèi)篩選技術(shù)，再到RNAi 技術(shù)、新一代基因編輯CRISPR/CAS9 技術(shù)等新型技術(shù)的快速發(fā)展及其在氣味受體功能研究中的應(yīng)用，使人們對(duì)氣味受體的功能及分子作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)也越來(lái)越深入。然而，研究昆蟲(chóng)氣味受體基因的功能所采用的一些技術(shù)仍存在一定局限性。雖然通過(guò)爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、HEK293、Sf9 細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，可大量篩選外源OR 的配體，操作也不復(fù)雜，但是這3 種異源細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)均缺乏CSP、OBP 和SNMP 成分，無(wú)法完全真實(shí)體現(xiàn)OR 的反應(yīng)特征；而果蠅“空神經(jīng)元”表達(dá)系統(tǒng)雖能真實(shí)體現(xiàn)外源OR 的反應(yīng)特征，部分外源ORs 卻不能在該系統(tǒng)成功表達(dá)，加之操作難度較大，不利于高通量研究ORs 功能。研究對(duì)象亦存在局限性，雖然昆蟲(chóng)氣味受體功能的研究對(duì)象由早期的模式昆蟲(chóng)如家蠶、果、蚊子和飛蝗，已轉(zhuǎn)為研究重要的農(nóng)作物、蔬菜害蟲(chóng)，卻鮮見(jiàn)對(duì)于林業(yè)重要害蟲(chóng)OR 功能方面的研究報(bào)道。當(dāng)前，研究重點(diǎn)也主要放在了農(nóng)作物、蔬菜害蟲(chóng)對(duì)植物揮發(fā)物、性信息素的嗅覺(jué)感受功能與機(jī)制上，而忽視了對(duì)害蟲(chóng)聚集信息素受體的鑒定和功能驗(yàn)證，聚集行為在許多害蟲(chóng)群體中是一種很常見(jiàn)的現(xiàn)象，聚集也是導(dǎo)致害蟲(chóng)對(duì)農(nóng)作物、蔬菜和林木造成重大災(zāi)害的重要條件，今后有必要加強(qiáng)對(duì)害蟲(chóng)聚集信息素受體的功能研究。

深入研究氣味受體基因的功能，闡明昆蟲(chóng)覓食、交尾和產(chǎn)卵等的嗅覺(jué)行為反應(yīng)分子機(jī)理，并將其與傳統(tǒng)的化學(xué)生態(tài)學(xué)、行為學(xué)相結(jié)合，有助于從分子生物學(xué)角度解釋氣味受體基因在昆蟲(chóng)定位寄主植物、尋找交尾對(duì)象及產(chǎn)卵場(chǎng)所等行為過(guò)程中發(fā)揮的重要作用，進(jìn)一步了解昆蟲(chóng)一系列行為產(chǎn)生的機(jī)制機(jī)理，同時(shí)也可為研發(fā)綠色、高效的食物引誘劑和、驅(qū)避劑、性信息素引誘劑及聚集信息素等行為調(diào)控劑提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。