磺胺類抗生素在畜禽糞便-土壤-植物-水系統(tǒng)中遷移轉(zhuǎn)化研究

余偉達(dá)，丘錦榮，王秀娟，夏 迪，蔡倩怡，曾經(jīng)文，周建利

（1.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.生態(tài)環(huán)境部華南環(huán)境科學(xué)研究所，廣東 廣州 510653）

【研究意義】在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，磺胺類抗生素被廣泛用于治療和預(yù)防感染性疾病，促進(jìn)動(dòng)物生長以及提高飼料利用率［1-3］。在過去的40 多年中，美國用作生長促進(jìn)劑的抗生素用量增長了80 多倍［4-5］，是世界上抗生素生產(chǎn)量和使用量最多的國家。研究表明，2013 年我國抗生素的年生產(chǎn)量達(dá)16.2 萬t 以上，其中52%的抗生素用于畜牧業(yè)，相當(dāng)于美國2012 年畜牧業(yè)抗生素使用量的5.77 倍、英國2013 年畜牧業(yè)抗生素使用量的200倍［6-10］。而動(dòng)物腸胃對抗生素的生物利用率有限，約60%～90%的抗生素會以藥物原形或代謝物的形態(tài)通過排泄物排入環(huán)境中［5，11］，造成環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。由于抗生素大多較為穩(wěn)定，部分抗生素固定相穩(wěn)定存在150 d 以上，部分抗生素隨著畜禽糞便進(jìn)入土壤，在土壤中可持續(xù)5～9 個(gè)月［12-13］。例如，在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的各種介質(zhì)（包括土壤、水、作物等）中都已檢測到高濃度的磺胺類抗生素殘留［14-15］。當(dāng)畜禽糞便直接用于農(nóng)業(yè)施肥時(shí)，抗生素有可能在土壤中積累，并被作物吸收。之前的研究也表明，抗生素有可能在不同的植物中積累，并通過食物鏈轉(zhuǎn)移給人類，對公共健康構(gòu)成潛在風(fēng)險(xiǎn)［7-8］。因此急需開展畜禽糞便中磺胺類抗生素在農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中遷移轉(zhuǎn)化研究。

【前人研究進(jìn)展】抗生素進(jìn)入土壤-植物系統(tǒng)后，易發(fā)生光降解、微生物降解、地表徑流運(yùn)移、淋溶、植物吸收、吸附或土壤固存［16-17］。Hamscher等［18］研究表明，在用豬糞改良的田地中，0～10、10～20、20～30 cm 深度土壤中四環(huán)素濃度分別可達(dá)到86、199、172 mg/kg；Stoob 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在肥料改良土壤中種植的玉米、萵苣和馬鈴薯，3 種作物均吸收了磺胺二甲嘧啶，其在植物組織中的濃度范圍為0.1～1.2 mg/kg，累積量約為施入有機(jī)肥量的0.1%。Kumar 等［20］試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氯霉素會在玉米、青蔥和卷心菜等作物中累積，且隨著糞便中氯霉素含量的增加而增加。

【本研究切入點(diǎn)】目前對畜禽養(yǎng)殖廢物中抗生素的研究主要著重于環(huán)境各種介質(zhì)中的監(jiān)測和分析，很少學(xué)者對抗生素在環(huán)境介質(zhì)中的遷移轉(zhuǎn)化和植物累積方面開展長期的跟蹤研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以磺胺類抗生素為對象，研究其在土壤、植物、土壤滲濾液等各種介質(zhì)中的吸附遷移特性以及玉米對其吸收累積能力，以期為畜禽養(yǎng)殖廢物在農(nóng)業(yè)上的合理利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

磺胺嘧啶（SD）、磺胺吡啶（SP）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺間甲氧嘧啶（SMM）、磺胺氯噠嗪（SMP）、磺胺多辛（SDM）、磺胺喹啉（SQ）、磺胺二甲氧基嘧啶（SMD）等藥品購自Sigma 公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為98%以上，分析過程所用試劑均為分析純和色譜純級別。供試玉米種子云石5 號由云南省農(nóng)科院育種中心提供。供試豬糞來自廣州市良種豬場，經(jīng)脫水處理，含水率50.4%。供試雞糞來自清遠(yuǎn)市某大型養(yǎng)雞場，經(jīng)晾曬處理，含水率21.5%。供試復(fù)合肥（15-15-15）來自廣州某肥料廠。供試土壤為廣州市郊的水稻土和林地土，水稻土理化性質(zhì)為：有機(jī)質(zhì)含量9.85 g/kg，總氮、總磷、總鉀含量分別為0.57、0.76、0.58 g/kg，陽離子交換量為11.62 cmol（+）/kg，交換性酸為0.63 cmol（+）/kg，pH（水∶土=2.5∶1）為5.46；林地土理化性質(zhì)為：有機(jī)質(zhì)含量0.29 g/kg，總氮、總磷、總鉀含量分別為0.74、0.28、0.34 g/kg，陽離子交換量為19.24 cmol（+）/kg，交換性酸為2.23 cmol（+）/kg，pH（水∶土=2.5 ∶1）為6.59。

1.2 試驗(yàn)方法

室外種植試驗(yàn)于2018 年4-8 月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)農(nóng)場（113°36′61＂E，23°16′90＂N）進(jìn)行，試驗(yàn)用地約48 m2，地形平坦。試驗(yàn)采用非常規(guī)的盆栽試驗(yàn)。試驗(yàn)地建有長1.0 m、寬1.0 m、深1.0 m微區(qū)試驗(yàn)池，池四周用水泥進(jìn)行防滲處理，池底部設(shè)計(jì)有滲漏裝置，底部有孔，連接有膠管，用于漏水。根據(jù)試驗(yàn)基地土壤剖面，試驗(yàn)池從下往上依次填碎石20 cm、林地土50 cm、水稻土30 cm，灌水使其自然沉緊。供試土壤經(jīng)檢測均不含磺胺類抗生素，經(jīng)過篩去除石塊、草根、樹根等，混合均勻后分別裝填于試驗(yàn)池內(nèi)。

試驗(yàn)過程最低氣溫19.4 ℃，最高氣溫35.4 ℃，平均氣溫27.8 ℃，總降雨量1 444.0 mm，日平均降雨量17.8 mm。試驗(yàn)期間溫度適宜，適合玉米生長，降雨較頻繁，但未對玉米的生長造成危害。

試驗(yàn)設(shè)不施肥（CK）、施用復(fù)合肥、施用雞糞、施用豬糞4 個(gè)處理，每個(gè)處理4 次重復(fù)。試驗(yàn)前期，對試驗(yàn)場地耕層土壤0～20 cm 進(jìn)行翻耕并除草，并且按照各處理設(shè)置施用不同肥料，將畜禽糞便和復(fù)合肥灑于土壤表層，人工翻土使之與耕作層土壤混合均勻。為了不引起土壤pH 升高、土壤堿化等影響，復(fù)合肥、鮮雞糞（含水率約75%）和鮮豬糞（含水率約80%）施用量分別控制在0.13、3.01、5.99 kg/m2，施肥后自然狀態(tài)下放置24 h 后播種。待苗期為三葉時(shí)進(jìn)行間苗，每個(gè)試驗(yàn)池保留6 株。試驗(yàn)期間用地下井水澆灌，大約每隔3 d澆水1 次（因降雨量而定），并人工除草與防治蟲害，不噴灑農(nóng)藥，試驗(yàn)過程記錄玉米生長情況、溫度與降雨量。

試驗(yàn)初期（0 d）采集畜禽糞便、土壤樣品（耕作層0～20 cm、深層20～80 cm），玉米生長中期（40 d）與末期（80 d）分別采集滲濾液與土樣（耕作層和深層），滲濾液置于棕色樣品瓶中于陰涼處待測。所有土壤樣品經(jīng)冷凍干燥碾磨過0.150 mm 篩后，放入棕色樣品瓶后置于陰涼處待測。于玉米各生長期測量株高和莖粗，收獲期（80 d）采集全株樣，依次用自來水、蒸餾水清洗，濾紙吸干水分。全株分成莖葉與果實(shí)，將莖葉切成碎末冷凍干燥稱重后用棕色樣品瓶保存待測，籽粒冷凍干燥后稱其百粒重，碾磨過篩后放入棕色樣品瓶，置于陰涼處待測。

1.3 樣品分析

1.3.1 樣品處理（1）樣品預(yù)處理：畜禽糞便、土壤和植物樣品用分析天平分別稱取2～3 g（記錄具體值）置于50 mL 玻璃離心管中，加入1 μg/mL磺胺類抗生素內(nèi)標(biāo)5 μL，放入冰箱中（4 ℃）黑暗條件下保存。（2）上清液提?。好總€(gè)離心管加入0.14 mol/L 磷酸鹽緩沖液10 mL、乙腈10 mL，渦旋20 s，超聲15 min，25 ℃、5 000 r/min 離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液于200 mL 濃縮瓶，提取過程重復(fù)2 次。將提取液在50 ℃條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去有機(jī)溶劑，待剩余溶液20～30 mL，轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶用雙蒸水稀釋至100 mL 混勻。將稀釋后的溶液過0.22 μm 尼龍濾膜后，準(zhǔn)確移取10 mL 于進(jìn)樣瓶，并加入Na4EDTA（乙二胺四乙酸四鈉）0.005 g 混勻，待測。空白對照、加標(biāo)樣品以及樣品平行均同時(shí)進(jìn)行處理，每10 個(gè)樣品之間設(shè)定一個(gè)空白樣品，每20 個(gè)樣品之間分析1個(gè)加標(biāo)樣品。。

1.3.2 測定方法 使用在線固相萃取-超高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（On-line SPE LC-MS/MS）技術(shù)分析樣品中的抗生素含量［21-23］。在線固相萃取柱采用C18 柱，分析柱：液相色譜柱 為Merk Purosphere STAR RP-18e（5 μm）250 mm×4.6 mm，流動(dòng)相為乙腈（A）和0.1%甲酸-5 mmol/L 甲酸銨水溶液（B）；梯度洗脫程序：20%A 0 min，40%A 8 min，70%A 11 min，80% A 13 min，80%A 15 min，20%A 16 min；流動(dòng)相流速為0.6 mL/min；柱溫為30 ℃。質(zhì)譜采用電噴霧離子化源（ESI）在正模式下對抗生素進(jìn)行分析。霧化器壓力為45 kPa；干燥氣流速和溫度分別設(shè)為10 L/min 和325 ℃；毛細(xì)管電壓為4 000 V；碰撞能、碎裂電壓（Fragmentor voltage）、母離子和子離子選擇等其他質(zhì)譜條件則采用Agilent 公司軟件Optimizer 自動(dòng)進(jìn)行優(yōu)化。最終所有樣品均在多反應(yīng)監(jiān)測模式下（MRM）進(jìn)行測定，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010 與SPSS 17.0 進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理對玉米農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量的影響

由表1 可知，不施肥對照玉米植株除穗長外，產(chǎn)量、各個(gè)時(shí)期的株高及莖粗、百粒重均顯著低于施肥處理，其中復(fù)合肥處理玉米產(chǎn)量顯著高于不施肥對照；3 個(gè)施肥處理的玉米百粒重?zé)o顯著差異，說明雞糞、豬糞、復(fù)合肥肥效基本一致，能夠滿足玉米生長所需；在整個(gè)生長過程中，相比于施復(fù)合肥，施有機(jī)肥（雞糞、豬糞）能持續(xù)長期地為植物提供肥效。

表1 不同處理對玉米農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量的影響Table 1 Effects of different treatments on agronomic traits and yields of corn

2.2 畜禽糞便對土壤磺胺類抗生素含量的影響

在試驗(yàn)過程中，分別在玉米生長初期（0 d）、中期（40 d）、末期（80 d）取玉米根際土壤耕層和深層樣，分別測定各處理土樣的磺胺類抗生素含量（表2）。由表2 可知，施雞糞處理玉米生長初期（0 d）土壤耕層、深層土樣的磺胺類抗生素總含量分別為2 160、480.2 ng/kg，施豬糞處理分別為1 275.7、454.4 ng/kg，耕層土壤起始濃度高，深層土壤的起始濃度較低；玉米生長中期（40 d），相比于生長初期土壤，各磺胺類抗生素濃度均有所降低，施雞糞、豬糞處理的耕層土壤磺胺類抗生素含量分別降低56.14%和38.39%；玉米生長末期（80 d），施雞糞、豬糞處理的耕層土壤磺胺類抗生素含量分別降低74.70%和51.90%。從磺胺類抗生素總含量變化來看，相比于玉米生長初期，不同施肥處理、不同生長時(shí)期（40、80 d）的耕層土壤磺胺類抗生素含量呈下降的趨勢，其中施雞糞處理的土壤表現(xiàn)為生長初期（2 160 ng/kg）＞生長中期（502.7 ng/kg）＞生長后期（335.4 ng/kg）；而深層土壤卻呈先上升后下降的趨勢，其中施雞糞處理的土壤磺胺類抗生素濃度表現(xiàn)為生長初期（480.2 ng/kg）＜生長中期（655.2 ng/kg）＞生長后期土壤（332.5 ng/kg），這是由于磺胺類化合物在土壤中的吸附能力較低，大部分磺胺類化合物會被浸出到更深的土壤中［24］。

表2 玉米不同生長時(shí)期土壤磺胺類抗生素含量Table 2 Contents of sulfonamide antibiotics in the soil at different growth periods of corn（ng/kg）

2.3 滲濾液磺胺類抗生素含量的變化

從表3 可以看出，從土壤遷移到滲濾液中的磺胺類抗生素含量均較低（0～40 ng/L），且SDM、SQ 和SMD 等磺胺類抗生素在滲濾液中均未檢測到。其中，玉米生長中期滲濾液中的磺胺類抗生素含量分別為生長初期的3.86%和3.79%，生長末期則分別下降到0.81%和1.33%，表明磺胺類抗生素隨著玉米生長時(shí)期的推進(jìn)，能夠從土壤解吸到滲濾液中的磺胺類抗生素不斷減少，這是由于磺胺類抗生素在生態(tài)系統(tǒng)中，不僅會遷移到水體中，還會被土壤吸附、植物吸收積累、光降解、微生物降解等一系列變化，是各個(gè)過程共同作用的結(jié)果［24］。

表3 玉米不同生長時(shí)期土壤滲濾液磺胺類抗生素含量Table 3 Contents of sulfonamide antibiotics in soil leachate at different growth periods of corn（ng/L）

2.4 玉米植株磺胺類抗生素含量的變化

由表4 可知，8 種磺胺類抗生素在玉米的根部均有檢測到、含量范圍在7.2～27.5 ng/kg，而在莖葉中只檢測到部分磺胺類抗生素、且含量均較低（0.5～17.9 ng/kg），玉米果實(shí)則沒有檢出。施雞糞、豬糞處理的玉米根系中的磺胺類抗生素含量分別為土壤初始含量的5.88%和5.24%，而莖葉中的磺胺類抗生素含量分別為土壤初始含量的1.93%和0.77%。由于磺胺類化合物在土壤中的吸附能力較低，大部分磺胺類抗生素會被浸出到更深的土壤或地下水中，從而降低了植物吸收的可能性［25-26］。Zhao 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，與土壤中的抗生素含量相比，只有0.072%的抗生素在植物中積累。植物體內(nèi)累積的抗生素含量要遠(yuǎn)低于土壤［28-30］。

表4 生長末期玉米植株各部分磺胺類抗生素含量Table 54 Contents of sulfonamide antibiotics in various parts of corn at late growth period

3 討論

本試驗(yàn)中，耕層土壤磺胺類抗生素下降速率顯著快于深層土壤，這可能是由于耕層土壤在表層，具有較大的光接觸面與氧氣來源，并且是植物根系所在的主要土壤層，通過光分解、微生物分解、植物吸收、土壤吸附、水的淋溶作用等，磺胺類抗生素降解速度快于深層土壤?？股氐陌胨テ趶膸滋欤让顾亍㈩^孢噻呋）到300 d（土霉素、沙拉沙星）不等，許多抗生素的半衰期會在低溫和黑暗中增加，這表明它們在較深的土層中持續(xù)時(shí)間更長［31-32］。在所有類型的抗生素中，磺胺類抗生素在土壤中的吸附最弱，流動(dòng)性最強(qiáng)［33］。磺胺類抗生素可在土壤中移動(dòng)，通過淋濾和侵蝕進(jìn)一步向土壤深層遷移［34］。而不同土壤對抗生素的吸附效果也有很大區(qū)別，Kay 等［35］研究發(fā)現(xiàn)在粘土土壤中幾乎沒有抗生素殘留。

磺胺類抗生素在土壤滲濾液中的濃度不超過40 ng/kg，且SDM、SQ 和SMD 在滲濾液中沒有被檢測到。前人試驗(yàn)表明，畜禽糞便中的抗生素大部分（高達(dá)99%）都會被保留在糞便中或施肥的土壤中，地表徑流和滲濾液中的抗生素含量低于0.5 μg/L［36］。

本研究雞糞、豬糞等畜禽糞便中的磺胺類抗生素主要在玉米的根部累積，莖葉部分的磺胺類抗生素含量較少，玉米果實(shí)中則沒有發(fā)現(xiàn)磺胺類抗生素，這與其他研究結(jié)果相似。Yan 等［37］研究發(fā)現(xiàn)鳳眼蓮的根部是環(huán)丙沙星主要的累積組織，Michelini 等［38］研究發(fā)現(xiàn)磺胺嘧啶主要在柳樹和玉米的根部累積。但不同類型的抗生素在作物中的累積部位可能不盡相同。Pan 等［39］研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素（TC）、諾氟沙星（NOR）和氯霉素（CAP）在作物組織中的最終分布情況表現(xiàn)為果實(shí)＞葉/根部＞根部，而磺胺甲氧芐啶（SMZ）和紅霉素（RY）的分布則相反，表現(xiàn)為根部＞葉/根部＞果實(shí)。

自然分解是磺胺類抗生素的主要消散途徑。本研究中，磺胺類抗生素在土壤-植物-水系統(tǒng)中的最終含量分布為：施雞糞處理表現(xiàn)為自然分解（67.65%）＞耕層土（12.70%）＞深層土（12.59%）＞玉米根部（4.81%）＞玉米莖葉（1.58%）＞滲濾液（0.66%）＞玉米果實(shí)（0.00%），施豬糞處理表現(xiàn)為自然分解（42.74%）＞深層土（28.59%）＞耕層土（19.51%）＞玉米根部（6.54%）＞滲濾液（1.66%）＞玉米莖葉（0.96%）＞玉米果實(shí)（0.00%）。而相較于施豬糞處理，施雞糞處理的深層土和滲濾液中的抗生素含量比例更低，這可能是由于不同糞便對抗生素的吸附不同導(dǎo)致的。Wei 等［40］也發(fā)現(xiàn)土壤中獸藥的殘留水平與糞便來源的動(dòng)物種類有關(guān)，家禽糞便改良的土壤樣本的抗生素污染水平相對高于牛糞和豬糞改良的土壤樣本。

從玉米果實(shí)樣的分析結(jié)果看，通過施用有機(jī)肥（雞糞和豬糞等）能夠得到安全的農(nóng)產(chǎn)品（玉米）。Boxall 等［41］研究胡蘿卜和萵苣獸用抗生素吸收試驗(yàn)結(jié)果表明，雖然在少數(shù)情況下抗生素的暴露濃度相當(dāng)可觀，但都以低于可接受的每日攝取量的10%，食用植物組織中大多數(shù)抗生素的濃度對人類健康的風(fēng)險(xiǎn)微乎其微。因此人類通過作物接觸的磺胺類抗生素濃度可以忽略不計(jì)，但在得出具體結(jié)論之前，應(yīng)進(jìn)一步調(diào)查抗生素在可食作物中的積累情況，并研究長期食用含抗生素作物對人體的影響。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，玉米在不同施肥處理下均可良好生長，未出現(xiàn)明顯的缺肥現(xiàn)象。相比于不施肥對照，施復(fù)合肥、雞糞、豬糞處理均可收獲正常產(chǎn)量的玉米產(chǎn)品，且畜禽糞便中的抗生素不會對玉米產(chǎn)生抑制毒性。在施用雞糞或豬糞后，畜禽糞便中的磺胺類抗生素會遷移到耕層和深層土壤中，其中大部分（67.65%和42.74%）磺胺類抗生素會自然分解，少量磺胺類抗生素隨著土壤的解吸進(jìn)入水體中，滲濾液中的磺胺類抗生素只有土壤初始含量0.66%和1.66%。根部和莖葉是磺胺類抗生素在玉米中的主要累積部分，且根部對磺胺類抗生素的吸收效率高于莖葉部分，累積濃度為莖葉的5 倍。